血清蛋白双向凝胶电泳-质谱分析诊断早期肺腺癌的临床研究

医刊2011年2月第 38卷第4—~ Chinese Jou—rnal ofPracticalMedicine Feb．2011,Vo1．38,No．4 血清蛋白双 向凝胶电泳 一质谱分析 诊断早期肺腺癌的临床研究 刘德义 付月云 彭燕 张海生 黄河 【摘要】 目的 分析肺腺癌患者与正常人血清双向凝胶电泳的差异蛋白质，从而寻找肺腺癌早期特异性的诊 断指标。方法 用固相 IPG梯度双向凝胶 电泳分离肺腺癌患者及正常人血清总蛋白，用PDQuest凝胶图像软件分 析，以识别差异蛋白质点。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI—TOF—Ms)分析获得肽质量指纹 图，然后利用Mascot查询软件搜寻数据库鉴定蛋白质。结果 ①获得了重复性较好的双向电泳银染图谱。②经 PDQuest 7．1软件匹配分析，共筛选出22个差异的蛋白点，对 7个差异蛋 白点进行胶 内原位酶解 一质谱指纹图分 析，获得了7张肽质量指纹图谱 ，查询数据库鉴定出1个蛋白质 一血清淀粉样蛋白A(SAA)。结论 ① 固相 pH梯 度双向凝胶电泳分离血清总蛋白获得 了重复性较好的双向电泳凝胶 图谱。②肺腺癌患者血清和正常人血清的蛋 白质组表达存在明显差异，这些差异蛋白点为进一步建立人肺癌的2一DE数据库奠定了基础。⑧SAA蛋白很可能 是肺癌的一个潜在标志物。 【关键词】 肺肿瘤；腺癌；血清；双向凝胶电泳；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪；蛋白质组 Two dimensional gel electrophoresis——mass spectrometry of serum protein in diagnosis of lung ad- enocarcinoma UU De—yt，FU Yue—yun．PENG Yan，ZHANG Hai—sheng，HUANG He．Department of Respiratory Medicine，the Central Hospital of Xinxiang，Xinxiang 453000，China 【Abstract】 Objective To analyze the proteomic components of the serum from the patients with lung adenocarcinoma and healthy donors，in search of the specific tumor markers of lung adenocarcinoma for diagnose．Methods The serum total protein of human lung adenoearcinoma serum and healthy do— nors serum were separated by immobilized pH gradient based on two——dimensional polyacrylamide gel e-· lectrophoresis(2一DE)．The differentially expressed proteins were analyzed using PDQuest analysis soft— ware，then identified using MALDI—TOF—MS and Mascot database searching．Results ①Good repro— ducible 2一DE image were successfully obtained．②Analyzed by PDQuest 2一DE software，twenty—two proteins were found differentially expressed in serum from lung adenocarcinoma patients and healthy do— nors．Seven protein spots of interest were incised from gel and digested in—gel by trypsin，seven PMF maps were obtained by MALDI—TOF—MS．The typical peptide masses were searched in the NCBInr da— tabase by Mascot software，one protein was identified succesfully．It was serum amyloid A(SAA)．Con- clusions ①Good reproducibility could be obtained by applying immobilized pH gradient two—dimen— sional polyaerylamide gel electrophoresis to separate and identify the proteome in serum．②There is an obviously differential proteomie expression between lung adenocarcinomma patients and healthy donors．It will be useful for identifying 2一DE database of lung cancer．@SAA protein may be a potential serum bi— omark of lung cancer． 【Key words】 Lung neoplasm；Adenocarcinoma；Serum；Two—dimensional gel electrophoresis； Matrix—assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry；Proteome 肺癌是当今世界常见恶性肿瘤之一，其中腺癌是 其主要病理学类型之一，近年来肺腺癌的发病率及病 死率明显增加，如何做到早期发现成为防治的关键。 DOI：10．3760／cma．j．issn．1674—4756．201 1．04．009 作者单位：453000 河南省新乡市中心医院呼吸内科 · 21· 肺癌标志物是肺癌细胞或组织在特定疾病状态下表达 的分子信号，是检测、诊断、治疗、监测肺癌和判断肺癌 预后的重要工具。传统寻找肺癌标志物的方法往往局 限于某些特定的基因或其表达产物，而它们仅仅是肺 癌恶性发展过程中的一小部分，因此并不能真正反映 出肺癌群体的复杂性。和传统方法不同，蛋白质组学 · 22· 2 生 月第38卷第4期 Chinese Journal ofPractical Medicine Feb ． 2011．v01．38．No．4 能对肺癌的蛋白质表达谱进行全面分析，能够发现大 量有诊断价值的蛋白质分子，从而为肺癌的早期诊断 提供依据。本实验采用蛋白质组学方法，建立分辨率 高和重复性好的人肺腺癌及正常人血清蛋白质的双向 凝胶电泳图谱，并识别鉴定其差异表达的蛋白质，从而 寻找肺癌早期特异性的诊断指标。 1 与方法 1．1 研究材料： 1．1．1 标本：l临床肺腺癌患者血清 20例，其中男 8 例，女性 12例，年龄44—78岁，平均62岁，所选20例 肺腺癌均经病理学证实且未接受化疗、放疗和其他治 疗，排除感染及风湿性疾病。正常健康志愿者血清 20 例，其中男8例，女 12例，年龄45～72岁，平均58岁。 1．1．2 试剂：[PG预制干胶条(pH3—10 17 cm)、矿物 油、两性电解质(Bio—lyte Ampholyte 3—10)为 BioRad 产品，丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(Bis— Acrylamide)、十二烷基磺酸钠(SDS)、SwellGel@Blue 白蛋白去除试剂盒为 Pierce产 品。四甲基乙二胺 (TEMED)、Tris—Base、碘 乙酰 胺 (Iodoacetamide， IAA)、CHAPS、二硫苏糖醇(DTr)、琼脂糖均为 Sigma 产品，过硫酸铵(APS)、尿素(Urea)购自北京北化精细 化学品有限责任公司，硫脲(洛阳试剂)，甘油、甘氨酸 购自上海精析化工科技公司，考马斯亮蓝 R250、考马 斯亮蓝 G250购自上海政翔化学试剂研究所、硝酸银 (上海华东试剂工业供销公司)，低分子量蛋白质 (上海生化)。 1．1．3 仪器：Protean 11 Xi Cell垂直电泳仪、Protean IEF Cell等电聚焦仪 、Gs一800光密 度仪为美 国 BioRad产品，核酸紫外测定仪 U一2001购 自美国 Hitachi，MDF—U4086S超低温冰箱为 日本 SANYO 产品，Voyager DE Pro型基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱仪(MALDI—TOF—MS)购 自美国应用 生物系统公司。 1．2 方法： 1．2．1 血清标本收集：取研究对象的静脉血 3 ml，室 温放置 30 min，3000 r／min离心 10 min收集血清(不 能溶血)。将血清分装置于一80℃冰箱保存。 1．2．2 血清蛋白质的制备：用SwellGel@Blue Albumin Removal kit(Pierce公司)去除血清中的白蛋白，然后 用 Bradford法进行血清蛋白定量，分装冻存，用于双向 电泳分析。 1．2．3 双向凝胶电泳：IPG—DALT主要按 Gorg等 的方法和 IPGphor 等电聚焦系统指南进行。水化和 聚焦在 17 oC自动进行，总电压时间为59 480 Vh，其中 水化50 V 16 h，250 V 30 min，1000 V 1 h，10 000 V 5 h。等电聚焦结束后，将 IPG干胶条进行两步平衡， 将平衡好的 IPG胶条移至0．75 mm厚 12％分离胶，进 行 SDS—PAGE电泳。电泳所得到的2一DE胶按蛋白 质银染试剂盒的操作手册进行银染。 1．2．4 凝胶图象分析：利用 Gs一800光密度仪，采用 800 pi的分辨率扫描染色后 的凝胶。使用 PDQuest 7．1专用软件对图象进行背景消减、斑点检测、匹配和 获取斑点位置坐标等。 1．2．5 质谱分析：将考马斯亮蓝染色的蛋白斑点从 2一DE胶切下来，置于 Eppendorf管中，用 7％冰乙酸 保存，用盛有冰块的塑料泡沫盒密封，送上海基康生物 有限公司进行质谱分析鉴定。 1．2．6 数据库检索鉴定蛋 白质：利用 Mascot查询软 件(http：／／www．matrixscience．corn)，在 NCBInr蛋白数 据库中进行查询。 2 结果 2．1 肺腺癌血清和正常血清的2一DE图谱：随机选 取 1例肺腺癌血清，在相同条件下对其总蛋白进行 2 次重复性电泳，经 PDQuest 2 DE软件分析发现，同一 样品的双向电泳图谱具有很好的重复性，保证了肺腺 癌患者与正常人血清蛋白质组成成分分析结果的可靠 性。利用 PDQuest 7．1分析软件对 20例肺腺癌血清 和 20例正常血清的双向电泳图谱分别进行匹配分析， 从而建立了二者的平均凝胶图。将肺腺癌血清和正常 血清的平均凝胶图进一步进行匹配分析，结合肉眼观 察比较凝胶图像，共筛选出22个差异的蛋白点(分布 见图 1a，1b)，其中Spot 1～8在肺腺癌患者的血清中 高表达，Spot 11～20号蛋白点在肺腺癌患者血清中低 表达，Spot 9、10号仅出现在肺腺癌患者的血清中，Spot 21、22号蛋白点仅出现在正常人的血清中。 2．2 差异蛋白点的MALDI—TOF—MS肽质指纹图分 析及数据库检索：从 22个差异的蛋白点中选出7个蛋 白点，其中4个在肺腺癌患者的血清中高表达的蛋白 点(Spot 2、3、8、9)，3个在肺腺癌患者的血清中低表达 的蛋白点(Spot 16、17、19)，经 MALDI—TOF—MS分 析及数据库检索，鉴定出了 1个蛋白质(Spot 9)一血 清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A，SAA)。 3 讨论 血清淀粉样蛋白Al2 是由同一族基因编码的一组 多形性蛋白，分子量大约为 12～14 kDa，由104个氨 基酸组成。正常时主要由肝细胞合成和分泌至血液 中。SAA作为一种急性时相蛋白，能在白细胞介素 一 1仅(IL一1 )、IL一1 B、IL一6、干扰素 一仅(IFN一仅)、 肿瘤坏死因子 一p(TNF—p)等多种炎性细胞因子 的间接刺激下表达 。SAA在正常情况下含量很低 医刊2011年2月第 38卷第4 J~— Chinese Journal o—fPracticalMedicine ： !!： ： ： ： 图 la 图 1b 图1 肺腺癌患者(图1a)和正常人(图 1b)血清双向凝胶电泳图谱及差异蛋白质分布 (1～5 g／m1)，但在炎症或其他各种损伤 (外伤 、感 染、肿瘤等)刺激下，单核 一巨噬细胞和内皮细胞释 放炎性 细胞因子，诱 导肝细胞产生急性期蛋 白， SAA的水平快速上升，可超过正常值的 1000倍左 右，这种特性使得 SAA成为目前最敏感的炎症标志 物之一 。 目前，国内有关 SAA的报道主要集 中在冠心 病 j、类风湿性关节炎 j、感染性疾病 等方 面， 有关肿瘤的报道极少。国外在 SAA与肿瘤关系的 研究方面取得 了一些进展。Biran等采用放射免疫 测定法对 160例肿瘤患者的血清进行了研究 ，发现 SAA的水平和肿瘤的活动度、分期 、大小及预后有 关。在肺癌方面，Benson等对 50例肺癌和 50例健 康人的血清做 了研究 ，发现 SAA水平和肺癌的预 后、复发有关。Gao等 采用蛋 白质微阵列技术对 24例肺癌患者、32例慢性阻塞性肺疾病患者及 24 例健康 人 的血清 做 了研究 ，发现 C一反应 蛋 白 (CRP)、Ot一1一antitrypsin、SAA、mucin 1等 7种蛋 白质在肺癌患者的表达差异有统计学意义，并进一 步对 CRP和 SAA升高水平者采用 Western blot分 析，发现 17份肺癌患者血清和 56份非肿瘤血清被 正确分类。由此 ，他们认为这些差异表达的蛋 白有 可能在监测肺癌发生方面起到一定的作用。杜克 大学的 Howard等 用 2DE和 MOLDI—TOF—MS 技术对正常患者和肺癌的患者的血清进行了分析， 发现血清淀粉样蛋白在肺癌患者的血清中高表达。 他们认为这项技术可能成为寻找肺癌和其他疾病 血清标志物的重要工具。我们对 2O例肺腺癌患者 和20例正常人 的血清应用 比较蛋 白质组学的方 · 23 · 法，也成功鉴定出了 SAA蛋白。 关于 SAA在肿瘤发生、发展中作用的机制还不 清楚 ，但通过以上的文献学习再结合本实验研究结 果 ，我们认为 SAA很有可能成为肺癌的一个标志 物。通过进一步和其他肺癌标志物联合进行检测， 将会大大提高肺癌筛检的特异性与敏感性。 参考文献 [1] Gorg A，Obermaier C，Boguth G，et a1．The current state of two—di— mensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J]．Electro- phoresis,2000，21(6)：1037—1053． [2] Malle E，Steinmetz A，Raynes TG．Serum amyloid A(SAA)：an acute phase protein and apolipoprotein[J]．Atheroselerosis，1993，102(2)： 131—146． [3] Urieli—Shoval S，Linke RP，Matzner Y．Expression and function of se． Vllm amyloid A，a major acute—phase protein，in normal and disease states[J]．Curt Opin Hematol，2000，7(1)：64-69． [4] 王旋 ，程龙献，廖玉华，等．血清淀粉样蛋白 A与冠心病及冠心病 危险因素的关系[J]．I临床心血管病杂志，2004，20(12)：745-747． [5] 吴禹，张莉萍．血清淀粉样蛋白和 c反应蛋白在类风湿性关节炎 患者测定中的临床意义[J]．重庆医学，2002，3l(8)：738． [6] 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