利什曼原虫核糖体基因及其间隔区的研究

?一．]》 务 爱 霸 168 7巷弟 4 利什曼原虫核糖体基因及其间隔区的研究 秒 三 塑 综述 胡孝素 审枝 华西医科大学寄生虫学研究室 成都 61 004 杜氏利什曼原虫是一种专营寄生生活的单细胞 低等真核生物。其生活史包括寄生于媒介 昆虫白蛉 消化道 内的前鞭毛体期和寄生于脊椎动物单核吞噬 细胞内的无鞭毛体期。近年来 ．我国局部地 区黑热 病患者人数在增加，四川1、甘肃 、新疆 等疫 区新发病 例由 l981～1984年 的 443例 ，上升 为 1985～1988 年 1 069铡。且犬的自然感染率 (传染率)较 前升高 7倍(5．26％，1991；36l吕％，1997)．控制和消灭黑热 病的 目标正面临严重挑战“。 。 利什曼原虫的快速鉴定和利什曼病的早期诊断 对利什曼病的肪治极为重要 。以前利什曼病的诊断 主要依靠骨髓穿刺潦片和病变组织块压印片染色检 查，这些方法患者常不愿接受，当原虫密度低或形态 不典型时又容易蔼诊，也不便于早期诊晰 目前抗 利什曼原虫不同抗原位的单克隆抗体和同功酶谱 分析 ，在虫体种株鉴定 中发挥较大的作用，但这些方 法以及其他一些 以蛋白质、脂类、RNA等为基 础的 分类鉴定诊断方法 ，往往受到虫体基 因表达的水 平 和分子重排的影响。并且同功酶谱的分析至少需要 1x1O 个原虫，这对那些难 扩大培养的利什曼原 虫来说根难办到。因此许多国内外学者 已将其注意 力转移到利什曼原虫核内外遗传物质，特别是动基 体 DNA、染色体 DNA以及基因组 DNA，对其进行大 量研究 。其结果有助于探讨利什曼原虫的致病机 理，建立一系列诊断方{者和种株鉴定手段，为最终控 制和消灭利什曼病莫定基础。本文对国内外利什曼 原虫核糖体基因及其间陌区研究进展综述如后。 1 核糖体基因|rDNA、rRNA编码基因) rRNA编码基因是一种中等重复并有转录活性 的基因，其拷贝数为 160个 ，以头尾相接 ，里申珠状 地位于单个染色体上。每个拷贝(重复单位，或称为 转录单位 )均 由转录区段 和非转 录区段 (spacer seg- merit)组成，转录区段编码 rRNA前体，这种前体分 子量为2．5 x1 。～般说来 ，rRNA基因含量相对 稳定，约占 DNA总量 的 0．1％--0．5％。ⅥIlalb~ E (1982) 等采用比色反应法发现巴西利什曼原虫 Y 株无鞭毛体的 DNA含量将近 O．226pg／odl，并将标 记的 rRNA与转印膜 上 DNA进行杂交发现 rRNA 基因最高可占 DNA总量的 0．47％，估计有 160个 rRNA基因拷贝。而将整个原虫 DNA进行 Csc1梯 度离心发现在 主带(p=1．712g／~ a)耐近有两 个主 要的卫星带，较重的一个卫星带(1．72od锄 )是 rRNA基因。而鞍轻的一个卫星带 (口=1 699glcm~) 为 I【DNA阿状结构。 rRNA编码基因在染色体上定位。Co／lfl~8．u A M(1986) 采用正交变变 电场 电泳 (ortho~nal fidd a[t~nafon gd electroohoresis)分离 L Ⅷ ∞m nr加一 zonen~ 染色体太 片段 ，并 用 rRNA探 针进 行杂交 ． 发现 rP~NA编码基因(即 rDNA)主要位于一个区带 ， 其分子量太于 750kb。＆holler(1986) 采用脉冲场 梯度凝胺 电泳(OFGE)对新太 陆利 什曼原 虫 (L b bra~liensis；L m w盯 m ，L．d chagasi)进行染色 体核型分析，并用标记的rDNA探针进行杂交．发现 这三株利什曼原 虫 rDNA编码基 因均位 于 12b区 带 ，其分子量分别为 1 220kb，1 240kb和 1 240I【b．无 显著性差异。采用常规的琼脂糖凝胺电泳．结台分 子杂交技术 ，对 30kb以下的 DNA分子 ，根据其分 子 量大小进行分离是可行 的。若在分子克陛和限制酶 切图谱的基础上，对 3Okb左右的 DNA片断进行序 列分析也非难事 。若再结 合染色体 步行 (Chromo— SOITICwalldng)来建立 100kb以上的基因组 (0．1Mb) 的分子图谱也是可行的。但随着研究 的 DNA区域 扩大，高度重复序列的频率增高，分子克瞳工作就变 得极为困难。因此在 100Kb～5Mb范 围内的 DNA 太分子的研究中，近几年迅速发展起来 的 脉 冲场 梯度凝 胶电泳 (PFGE)为 主的大 片段 DNA分离技 术 ，已为人们在这个范国内的研究提供有力的手段。 国外采用脉冲场梯度凝胶电泳技术对利什曼原虫研 究已取得很多进展 ，巳证实所有 的利什曼原虫种株 均可产生至少 14条 清晰的染色体 DNA医带 ，各区 带之间有 50Kb左右的差异 ，DNA核型可用于种株 鉴定和分类。为证实利什曼原虫核型(1hry0type)稳 定性和重复性，Min s∞(1993)” 使用热休克(heat shocks)、药物、萦外线照射和 射线辐射等方法处理 染色体 DNA，除 射线辐射可弓f超染色体机械性损 伤，而将受损伤的原虫继续培养显示不影响核型外． 其余三种方法均不影响核型，该实验证实利什曼原 虫种株的DNA核型非常稳定，并不因暂时的高热、 药物和辐射等捌激因素而发生变化，这也为我们依 据染色体 DNA核型 进行种株 鉴定及 分类提供 了理 论依据 。 rDNA的碱基组成相 对稳定 ．始终是高度 保守 的，rDNA某些区域在所有 细胞 生物 中存在 ，而另一 些 rDNA区域列出现歧异的变化，具有属种株 特异 性 。将这些具有 种株特异性 的 rDNA区域分离 出 来 ，即可构成 rDNA揉针 ，进行 DNA-DNA 和 DNA- rRNA杂交来检测利什曼原虫。 2 核糖体小亚基(Small·sublmit rRNA． u rRNA J rDNA分子具有功能上的高度保守性，在所有 细胞生物 中都存在，其进化具有 良好 的时钟性质 ，其 维普资讯 http://www.cqvip.com 用寄牛虫病杂志 1999年第 7卷第 4期 序列 中不同位置上变化的速度不同。 目前 已成为系 统分类学研究 中最有用和最 常用的研究对象 ，井称 为 rRNA分子钟(Molec~ar Clock)，用来测定几乎全 都生物问的系统发育关 系，并鞫建进 化树 (Fhyloge— netic t~ee) j。在刺什曼原虫三种 rRNA、5．8srRNA、 1& A、28srItNA中 ，SSu删 A(18s~RNA)囡其含 有大量的可供统计运送的高度保守和部分保守的基 因碱基序列 ，已用来计算发育进化距离，构建进化树 和用于利什曼原虫诊断和种株鉴定 。 RNA基因的一级结构 ：Looker等(1988) 用限制内切酶 E R I将杜氏利什曼原虫苏丹株 SSUrRNA分割 为 3．7kb、1．0kb和 56bp等 3个 片 断 ，将 3．7kb和 1．0kb片段克艟在 18U 质粒上 ， 而将台有 56bp片段的 ，用限制性 内切蘸 HindⅢ和 Pst I消化产生的 450bD片段克隆在 M13mp18噬 菌体内，该 450bp片段即包括 56bp片段，又与 3．7kb 和 1．0kb两个片段重叠。采用双脱氧核苷酸链终止 法测定其碱基序列，发现：杜氏利什曼原虫苏丹株 SSUrlLNA碱基序列为 2204bp．与 Crithidiafasox-u— lata有 97％ 同源 性 ，而 与 Trypanocaome brucei有 84％同源性。Edwards(1989) 采用 PCR及序列测 定 S双jrRNA，即采用一对与 SsurRNA高度保守 区 域的碱基序列互补的单按苷酸弓『物．通过多聚酶链 反应体外扩增直接测序。通过测序发现 s5UrRNA 基因的特点在于高度保守 DNA碱基序列中散在分 布一些半保守和不保守的碱基序列，某些碱基序列 具有种株特异性。根据已发表的 Lei,~man／a ta．r~ 的 SSUrRNA碱 基 序列 (Dams．E．1988)m J，Van Eys．G．J．J．M(1992) 合成一对引物，该弓『物位于 SSUrRNA基因高度保守区，用该对引翱进行 FCR 扩增 出 SsUrRNA基 因中间部分 的 DNA片段。将 古有 800bpSSUrRNA的 PUC19质粒进行序列测定 和单链构象多态性研究。结果发现这段 800bp片段 来自 ssurRNA中间区序列 ，位置在 1 121～2 316 bp。这段特定的序列古有 2个独特的序列区，UQ- I和 UQ-11，只存在 于 L donovani，C fasc~culata． T 和 T brucei。用这两个独特的序列做探针 进行 打点杂 交，可用 来柱 翊I利什 曼原 虫。通 过对 Leishraaniata．x~ 9株以及 丁 brucei，丁 m ‘ 和 C~hidiafasdcula 的 SSU1-RNA序列分析和比较。 证实 Le~shmania ta．ra~存在点突变，都位于 SsU rRNA中间区域的 2个独 特碱基序 列 区(UQI和 Uqn)。正因为点突变的存在 ，可 以通过对 PCR扩 增产物的限制性酶切片段分析，单链构象多态性分 析和序列测定来鉴定刺什曼原虫神株 。 sgurRNA同源性分析及在种系发生和分类 学 上具有较好的应用价值。生物之间的种系发生依靠 同功酶电诛分析技术 已有 20多年，该方法现 已用于 许多研究 ，但对那些血缘较近的(差距在 1 000万年 以内)的生物之间的种系发生研究受到限制。而其 · 169 · 它一些方法 ，如免疫学方法和 DNA杂交，分子克隆 等。固为方法难 以统一 、费时以及夹杂着大量高度 保守的基因而难 以推广。因此依靠各种生 物中含有 大量的半保守区域的 rRNA序列 分析进行生物种系 发生研究已越来越受到欢迎 ，该方法具有快速 ，耗时 少(6--15天)，准确度高(>95％)等优点。 rRNA序列测定 ：Johnson(1989) 描述了一种 用于生物系统分类的快速 rRNA序列测 定法 ，即修 改的 岛f啦 双脱 氧 核 苷酸 链 终止 法 。其原 理 以 rDNA~模板 ，以一个或 多个 寡核 苷酸链做 为弓l物 (与 rRNA分子的一段高度保守区互补的 15--20个 核苷酸)，用逆转录 PCR台成反转录 DNA( NA)。 反应系统由 4支反应管组成，分别用来测定 A、T、 C、G4种碱基，反应底物 为 A、T、c、G所对应的 4种 植苷酸，其中～种台放射性标记。在相应的反应管 中分别加入双脱氧 A、T、c、G棱苷 酸做终止刺 ．它 们随机地参加到延长的 DNA链上相应位置上 ，从而 终止该链的继续延长。反应进行到顶定时问后．四 个管的反应物同时进行 电泳分离 ，电泳结果用放射 性 自显影显示．再从 自显髟图谱上直接读 出 rRNA 序列。将得到的序列资料经计算机处理可得列不 同 rRNA同源性 ，并构建进化树。Johi'Lsorl收集 44种真 核生物和 35种原核生物的完整 的，或部分 的 SSu一 A序列 ，通过比较 ，确定 多个区域 的 同源性 ．这 些区域显示较高的可靠性。以这些区域序列变化来 构建进 化树 。国内郑学 礼等 应 用 PCR—SSCP银 染技术对新疆皮肤利什曼病 (CL)病人(P17)的病原 体 SSUrRNA基 因 及 kDNA基 因进 行 分 析 ，发 现 CLPl7病原体与 L tropica L．infantum 的 DNA 序列存 在 一定 的相 似性 ．但 CLP17病原 体与 L tropica，L infantum 皆有一定 的差异 性。在此基 础上 ，章诗等” 对新疆 皮肤刺什曼病病 原体 SSU— rRNA基因进 行 pcR扩 增和序 列 分析 ，结果 显示 CLP与 L tro9／c~．L．infantum 三者 的序列高度 同源，CLP与 L．tropica序列之间存在 4个点突变， CLP与 L infantura之间存在 7个点突变及 2个移 码突变．而 L tropu：a与 L infantum 之 间存 在 3 个点突变及 2个移码突变 这些结果对当地制定有 效防治对策具有重要意义 ，并为利什曼病分 子漉行 病学提供 了可靠的科学依据。 为证实寄生在 蜥蝎 体内的 L．tarentolae和杜 氏利什曼原虫的亲缘关系。Bfiones(1992) 根据 锥虫科和和什曼原虫的 SSUrRNA基因序列构建进 化树。发现 L tarento／~e和哺乳动物体内寄生的 L dontroan~在 SSUrRNA结构上非 常相似 。而与锥 虫科原虫不论是枯 氏锥 虫还是布 氏锥虫，都有 较大 的进化差距 。采用基因阃隔的 rDNA spacer穿列 为 探针进行打点杂交，结果也证实 了 SSUrRNA 的比 较结 果 这 些 资 料 均 证 实 L tarento／,ae和 L． donovani有密切关 系，而与锥虫有鞍 高差异。这个 维普资讯 http://www.cqvip.com 17O · 结果对利什曼病研究极 为重要，困为 L 缸删 肋 容易分离培养 ，且对人类无害，是 理想的研究锥虫 和 利什曼原虫的生化和分子生物学的实验。 SsurRNA性质及特征 ： urRNA舍有完全保 守的二级结构 ．存在于所有的生物细胞 中，特别是核 心结构 ．其所 舍 序列 是 完全 保 守的 ．以维 护 SSU— rRNA结构的稳定性 。Castro(1981) 发现枯 氏锥 虫的 rRHa_分子 以完整形式存在 ，有时也 出现 2个 片段 ，这取决于在抽提 中使用变性剂 ，或本 身所有 。 通过实验证实内部缺 口是加工过程产生，而不是在 抽提过程 中被降解 。 SsurRNA在种株鉴定 中的应用；rlLNA基因在 利什曼原虫基 因组拷贝数为 160个拷贝，由保守片 段和其两侧在低选择压力下产生的可变 的闻隔基因 片段组成 ，这些特征使 rRNA成为一个 重要 的研究 工具。UI[ana(1991) 采用限制性内切酶 Pvu 11对 利什曼愿虫和锥虫的基因组 DNA进行限制 内切酶 谱分折 ，一个种特异的 P Ⅱ酶切位点在利什 曼原 虫 rRNA5’端上被检出。合成一个包含 P Ⅱ酶切 位点的 20个碱基的寡核苷酸链 ，这段序列做为探针 可检铡 1 X 10 个前鞭毛体，该探针可与所有利什曼 原虫种株进行杂交 ，而不与枯 氏锥虫发生杂交 ，具有 种特异性．可直接用于临床和流行区现场捡铡利什 曼原虫。依据 ⅢⅡ酶切位点和 置印 II酶切位点及 周围碱基序列合成的一对引物 ，建立多聚酶链反应 ， 可提高其检 出率。Van Eys(1992) 根据 已测定 的 缸 的 SsU A 基 因 可 变 区序 列 (800bp)．并 与 已发 表 的 T．brucei．T．c 和 Crithidiafasciculata SSUrRNA gene序列 比鞍 ，设计 一 对利什曼愿虫种特异引物 R222、R333，进行 PCR 扩增 ，扩增产物可通过限制性酶切图谱分析、单链构 象多态性分析和序列测定来进行种株鉴定。 u A序列分析在诊断上的应用：在正常的 细胞 中．RNA的含量是其 D 含量的 10--50倍 ． 并且 大 都 是 rRNA(90％ ～95％)。真 核 生 物 的 rRNA是 由 rRNA．SSUrRNA 和 5．8 A组 成 。小亚基 rRNA(SSUrRNA)序列显示有相 当多_的 具有种特异变异 区域 ，这些 种特异 区域成 了建立敏 感 、准确地检测寄生虫 的靶基 因。若通过分子 克隆 技术筛选种特异性 rDNA片段做为探针 ．或通过化 学合成种特异性 rDNA片段和 SsUrRNA为探针 ．进 行 DNA-DNA杂文和 DNA-ILNA杂交 ．特别是 DNA- RNA杂交和 RNA-RNA杂交 ，必将提高柱 出率。因 为细胞 内 rRNA有 1×10 个拷贝．共 0．2pg．至少可 检铡到 20个前鞭毛体，可 比常规 kDNA杂交检出率 (5×10 个前 鞭 毛体 )提 高 250倍。因此建 立 以 rRNA为靶基因的 rDNA探针检测技术具有灵敏度 高、重复性强、简便易行等特点。随着多聚酶链反应 的广瑟开展 ．Hernad~(1988) 首先采用 PCR技术 去扩增真核生 物 SSUrRNA编码 基因，以真核生物 1999年第 7卷第 4 ssurRNA的 3 端和 5’端保守互补的单核苷酸链为 引物 ，扩增误差为 1／2 000。Van Eys(1992)“ 建立 逆转录多聚酶链反应 ，其扩增效率比 DNA为模板 的扩增教率高 1 000倍 ，这对那些虫数鞍少 的皮肤 利什曼病患者组织病变标本 的检测极为有利。为降 低逆 转 录过 程 中可 能 出 现 的 假 阳 性 ．Shutd[ne (1990)Ⅲ 建立了以 RNA为模板的、 RNA片段为 引物 的 RS-PCR(RNA t锄 pla spec c砌 ymerase chain reaction)方法 ，以 降低少量 DNA污染 ，Souto (1993) ”建立了逆转录 PCR方法去扩增枯 氏锥虫 24SorRNkA_，扩增片段为 100bp，结果表明只有枯氏锥 虫出现预期的扩增产物 ，与利什曼原虫 ，T rangeli 和人类 DNA无交叉反应。在不 同的枯氏锥虫分离 株 PCR扩增产物的分子量各不同 ，其中有 8个枯氏 锥虫分离株为 125bp．另外 8个枯 氏锥虫 分离株 为 ll0bp，这种二态性已通过杂交和序列测定证实，并 可把枯氏锥虫分成两群 ．提示 rRNA PCR扩增产物 应结合杂交结果进行判断。国内陈建平等。越-圳采 用 Lamlxla GE ”Vector载体 系统完成 了杜氏剃 什曼原虫 四，I1人分 离株 的基 因组 DNA 的大片段 (16kb-22kb)克隆，并筛选 出2个古有 SSUrDNA的 重组质粒，建立 了杜 氏利什曼原虫 SSUrRNA逆转 录 PCR方法，发现 以SSUrlLNA为靶基 因的逆转 录 PCR的扩增效率鞍 以 rDNA为靶基 因的 PCR敏感 100倍。 3 核糖体基 因间隔区序列(rib0smmI霉elle si~eei") 利什曼原虫编码 rRNA的基 因，位于单一的染 色体．呈 160个拷 贝的重 复单位。每个重复单位均 可编码 16sRNA、5．8sRNA和 28sRNA。编码 rRNA 基因长度 为 8kb．而周 围 的非 转 录的基 因 间 隔区 【nontranscfibed~ntergenJc spac region NTS)长度平 均为 8．5kb。核糖体基因间隔(ribosomal gene spac一 盯)序列由于 rRNA基因的高度 保守性使其 突变积 累在线形重复排列的 rRNA基 因两侧的非编 码区 ． 而使按糖体基因间隔区序列具有种内和种间的特异 性。这种变化有助于种下分型和变异研究。又由于 基因家族 构成在所有 的真核 生物是相 同的， 因此核塘体基因间区序列已披用于分类学及种株鉴 定。 核塘体基因间隔区序列在分类学及种株鉴定中 的应用 ：Ra r既(1987) 构建 L b Y株 基因库 ，然 后用 I标记 的 L brazilien~4．s Y株 rlLNA探 针筛 选阳性克隆 ．获得两株舍 有核糖体 基因间 区序列的 重组子。PLbYr9重组 子舍有 6．5kb插 入子 ，其 中 1．2kb为 20S rRNA 小 亚 基 编码 基 因 的一 部 分 ． 5．3kb为外 围的按塘体 间隔区序列。PLbYr8重组 子含有部分 16SrRNA编码基 因。首先 将利什曼原 虫各种株基因组 DNA做限制性酶切图谱分折，采用 限制性 内切 酶 Sau3A 酶切，用 I标 记 的 PLbYr9 探针杂交。结果显示 ：L 删 懈 和L brazilien— 维普资讯 http://www.cqvip.com 7卷第 4 脚 可依据限制性酶切谱 和 Southern杂交结果分为 三种群 (group)，第 一种群 图形与 L ．删 2 Y 株相似 ，其参 考株为 L m garr~ mi。第 二种群谱 图形与参考株 L 删如 懈 M379相似。这些结 果支持 L garnhami是一个 独立 的利什曼原虫种 的观点 ，也和以前 L．J~le．yctcan,2和L braziliensis研 究结果相符台 ，同时也为 New World Leishmania~准 确诊断开辟道路 。在此基础上 ，Guevara(1992) 构 建了 L．granlmmi和 L．braziliensis的非 转 录的 基因 间隔区 DNA探 针 ，进 行利什 曼原虫 检 测。L garnhami探针在高严谨性洗涤的条件具有 种特异性 ，若在中度严谨诜涤条件下则 与利什曼原 虫墨西哥种群出现交叉反应 ，L．bra~lL-．ns／s探针显 示完全的种特异性。采用非转 录问隔区序列探针所 傲巴西利什曼原虫的限制酶切片段多态性研究 (PEEP)显示出完全同源的图形，甚至连刚刚分离的 巴西利什曼原虫也具有完全同源的图形。在此基础 上 ，建立了检测 巴西利什 曼原虫 的 PCR扩增技 术． 扩增片段为 146bp。谈 片段为 L 种特异的。Cu— polillo(1995)tz61采用 PCR扩增位于 5．8S rRNA基 因双侧问隔区 ．并用 10种不同的限制性内切酶消化 扩增片段，对 50种不同地区的 L vannia分离株进 行限制性酶切分析 ，并构建进化树 ，发现在 L．啦n— nia亚群中有些种类可形成高度聚类，L．{nv．zilien一 曲 和L．nai#i呈高度的多型性。由此可见利什曼 原虫核糖体基因间隔区序列可较好地应用于利什曼 原虫种株鉴定和诊断 核糖体具有功能上的高度保守性 ．在所有的生 物细胞中都存在．其进化具有良好的时钟性质，并称 为“生物钟”。上述性质使其可以用来测定几乎全部 生物问的系统发育关系。核糖体间隔区序列 由于其 寒变率相对较高而具有种内和种问的特异性，两者 均已成为分子病原生物学鉴定技术常用的靶系统。 4 参考文献 1 W HO 041叭 Ⅸ nee Cbnh0l of the lds}m蛐 汹 s w甜 dHealth [m cal Re州 1990：793 2 胡孝索，等．用 MeAb-AST及骨髓涂片法对四川搜川县 犬感染利什曼原虫的调查研究 中国人兽共患病 杂志． 1991；7(4)：5 3 Barker．DC． Molecular approaches to DNA dutgnasis P o ，1989；99：$125 4 Ⅶ 1丑】h E．et ．R南∞∞ 1a1UNA ofI 栅 ”ia braz． ilimwls ntrr,her offilxx．mmal colX,~ and~re／le isdation J Pmmmo1．1982；29：438 5 ComeauAM ．et al CI吐 Ⅸ0锄 elocationof four genesin Ldshmami8．Me]Bioch~．1lP~ sito1．1986．21：161 8 Schmler JK．et al Molmu r 叼∞哆peof 5pe 酋 and 811b-speciesof Leisltrna~zia M 0lB~ hem Paxasim1．1986： 20：279 7 M ia S，el； ．Influence of heat．也 and radlatic~a on karyoty!ae Leishman~ major Korean J P~ sim1． 1993；31(3)：277 8 枉恩涛，等 rRNA同源性分析与细菌系统分类．微生 · 17I 物学学报 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