遗传多样性

中国农业科学 2011,44(9):1871-1879 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.09.014 收稿日期：2010-05-27；接受日期：2011-01-19 基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目（2007BAD36B01-3）、新疆自治区重大科技专项（200731136）、新疆自治区果树学重点学科基金项目 联系方式：李 超，E-mail：lichaoln@163.com。通信作者罗淑萍，E-mail：luoshuping2008@163.com；通信作者李 疆，Tel/Fax：09918762363； E-mail：lijiangxj@163.com 新疆核桃种质资源遗传多样性的 ISSR分析 李 超 1，罗淑萍 1，曾 斌 2，李 疆 2，李 刚 1 （1新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；2新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052） 摘要：【目的】通过 ISSR标记技术，对新疆核桃种质资源的遗传多样性及遗传结构进行分析，为该资源的保 护与利用提供理论依据和技术支持。【方法】采用 ISSR标记对 5个居群和 1个栽培类型共 163份样品进行遗传多 样性分析。【结果】用 13条引物对 163份样品进行扩增，共检测扩增位点 117个，其中多态性位点 98个。在物种 水平上，多态性位点百分率（PPL）为 83.76%，Nei’s基因多样性（H）为 0.3010，Shannon信息指数(I)为 0.4182； 在居群水平上，多态性位点百分率平均为 68.36%，Nei’s基因多样性（H）平均为 0.1265，Shannon信息指数（I） 平均为 0.1651。基于 Nei’s遗传多样性分析得出的居群间遗传分化系数(Gst)为 0.6425，表明有 64.25%的遗传变 异存在于居群间。居群间的遗传一致度平均为 0.7499，估测的居群间基因流（Nm）为 0.2782，表明核桃采集的 6 个居群或类型之间存在较小的基因流。AMOVA 方差分析也表明居群间的核桃遗传变异大于居群内。Mantel 检测与 UPGMA聚类均表明居群间的遗传距离与居群的地理距离之间具有较高的相关性。【结论】新疆核桃遗传多样性水平 较高，居群之间遗传分化大，种质资源保护和利用策略首选就地保护；在就地保护过程中，通过监测遗传多样性 水平可评价其保护的有效性。 关键词：核桃；种质资源；遗传多样性；ISSR Analysis of Genetic Diversity of Germplasm Resources of Walnut (Juglans regia L.) Revealed by ISSR in Xinjiang of China LI Chao1, LUO Shu-ping1, ZENG Bin2, LI Jiang2, LI Gang1 (1College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052; 2College of Forest Science and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052) Abstract: 【Objective】 ISSR markers were used to study the genetic diversity and genetic structure in order to provide a theoretical basis and technical support for appropriate conservation and application of existing genetic resources of walnut. 【Method】 Genetic relationship of 5 populations and 1 type (163 walnut samples) walnut was analyzed using ISSR markers. 【Result】 117 bands were amplified by 13 informative and reliable primers, of which 98 were polymorphic loci. At species level, the percentage of polymorphic loci (PPL) was 83.76%, Nei’s gene diversity (H) was equaled to 0.3010, Shannon’s Information index (I) was 0.4182. At population level, the average value of PPL was 68.36%, the mean value of H amounted to 0.1265, the general average of I was 0.1651. Genetic coefficient of differentiation (Gst) among populations based Nei’s gene diversity was equaled to 0.6425, which showed 64.25% genetic variation existed among populations. The mean value of Nei’s genetic identity was equaled to 0.7499, estimation of gene flow from Gst (Nm) was 0.2782, which was able to be considered that gene flow was blocked among 6 populations and types, this result was uniform with that obtained by using Nei’s gene diversity. Analysis of AMOVA also showed genetic variance among populations was larger than within a population. Mantel test and UPGMA dendrogram based Nei’s genetic distance showed that genetic distance among populations had more significant correlation with geographic distance. 【Conclusion】 1872 中 国 农 业 科 学 44卷 The walnut germplasms in Xinjiang have a high level of genetic diversity, and the genetic differentiation is also larger. Germplasm protection and exploitation strategies of Amygdalus ledebouriana Schlecht should be prior to conduct in situ conservation, and by monitoring the level of genetic diversity to evaluate the effectiveness of its protection. Key words: Juglans regia L; germplasms resources; genetic diversity; ISSR 0 引言 【研究意义】核桃（Juglans regia L.）系胡桃科 核桃属多年生落叶果树，又名胡桃、羌桃，是重要的 营养坚果。由于近年来核桃产业不断发展以及优良品 种的盲目推广，一些适应性强的农家种和野生种逐渐 消失，基因资源遭受破坏，物种有单一化发展的趋势。 新疆是中国核桃的原产地之一，蕴藏着丰富的基因资 源，从DNA水平分析新疆核桃的遗传多样性，对核桃 资源的收集、整理、评价、保护以及育种改良等有重 要意义 [1-3]。【前人研究进展】 ISSR（ inter-simple sequence repeats）标记是在SSR标记基础上发展起来的 一种新技术，克服了RFLP、RAPD、AFLP等标记技术 的一些局限性，具有无需预知基因组背景信息、操作 简单、试验重复性好、信息量大、多态性高等优点， 目前已被广泛用于种质收集[4] 、品种鉴定[5] 、遗传多 样性[6] 、系统进化关系[7]、遗传作图[8]等研究中。近年 来，国内外许多学者利用分子标记分析技术对核桃属 植物进行了研究，如Malvolti等[9]利用同工酶技术对意 大利核桃种群的遗传多样性进行了分析。Potter等[10]利 用ISSR技术分析 48 个核桃品种的遗传关系以及树状 亲缘关系图。Pollegioni等[11]利用ISSR、RAPD和SSR 分子标记技术对意大利维琴察市的核桃（J. regia）、 黑核桃（J. nigra）及它们的天然杂交种进行了研究。 刘晓丽等[12]利用SSR技术对喀什、和田、巩留 3 个居 群的核桃进行了遗传结构分析。【本研究切入点】前 人已从形态学、生理学等角度对新疆核桃进行了部分 研究，但应用ISSR标记技术对新疆核桃遗传多样性方 面的研究还较少。【拟解决的关键问题】本试验以新 疆不同野生居群和栽培类型的核桃资源为材料，拟采 用ISSR标记分析供试核桃的遗传多样性、遗传分化、 基因流、遗传距离以及亲缘关系等，以期为进一步科 学利用核桃资源提供理论支持及实践依据。 1 材料与方法 1.1 材料 根据新疆核桃分布的地理情况，采集 5个野生核 桃居群，即哈密居群（简称 HM）、鄯善居群（简称 SS）、吐鲁番居群（简称 TLF）、巩留居群（简称 GL）、霍城居群（简称 HC）和 1个温宿栽培类型（简 称WS），共 163份样品（表 1）。按随机取样原则， 在每个居群或类型内按不同海拔高度（每 100—200 m）设置样点，选取 30个单株树，株间距至少 50 m， 分别采集幼叶，硅胶干燥后冷冻保存。 1.2 方法 1.2.1 基因组 DNA提取 核桃叶片基因组 DNA的提 取参照文献[13-14]中的 CTAB法，并略有改进。 1.2.2 ISSR-PCR反应体系的建立 根据本实验室已 建立的野扁桃ISSR反应体系并参照文献[15-16]确定 PCR反应体系为：25 μL反应体系中含有ddH2O 19.5 μL，10×buffer 2.5 μL，primer 1.0 μL（10 μmol·L-1）， dNTP 0.6 μL（10 mmol·L-1），Taq酶 0.4 μL（2.5 U·μL-1） （Tiangen），DNA模板 1 μL（60 ng）。 表 1 样品采集的地理位置 Table 1 Sample size, geographic location, temperature and rainfall of the sampled region 居群和样品编号 Population and sample No. 地点 Location 地形 Landform 海拔 Altitude (m) 经度 Longitude (E) 纬度 Latitude (N) 年平均降雨量 Annual rainfall (mm) 年平均气温 Annual Temperature (℃) HM (1—30) 哈密 Hami 丘陵 Upland 1050 93°95′ 42°89′ 90 11.0 SS (31—60) 鄯善 Shanshan 丘陵 Upland 1000 93°95′ 43°08′ 95 11.2 TLF (61—90) 吐鲁番 Tulufan 丘陵 Upland 850 89°38′ 43°17′ 50 13.9 GL (91—120) 巩留 Gongliu 山地Mountain 1250 82°16′ 43°22′ 700 7.4 HC (121—150) 霍城 Huocheng 山地Mountain 1450 80°46′ 44°19′ 600 6.2 WS (151—163) 温宿Wensu 绿洲 Oasis 980.4 79°36′ 42°49′ 46.8 9.8 9期 李 超等：新疆核桃种质资源遗传多样性的 ISSR分析 1873 PCR扩增程序为：95℃预变性 5 min，94℃变性 60 s，50—55℃（根据引物退火温度设定）复性 45 s， 72℃延伸 90 s，循环 40次，最后 72℃延伸 7 min，4℃ 保存。 1.2.3 电泳及检测 取 8 μL PCR产物和 2 μL上样缓 冲液混合，Marker 2000 bp作分子质量进行对照， 电压 5 V·cm-1，用 2%琼脂糖凝胶电泳约 80 min，EB 染色 20 min。在凝胶成像分析仪（BIO-RAD）上观察， 并试验结果。 1.2.4 数据处理与分析 ISSR 是显性标记，根据电 泳图谱中标准分子质量，统计反应产物在凝胶上的位 置，按凝胶图谱上同一扩增位点条带的有无进行统计， 有带的记为“1”，无带的记为“0”，构建 ISSR 数 据矩阵。采用软件 POPGEN version 1.32、NTSYSpc version 2.1、ARLEQUIN version 3.1、HICKORY version 1.1、MEGA version 3.1、Mantel-struct version 1.0进行 遗传分化及遗传距离等方面的分析。 2 结果 2.1 引物筛选 从 100条 ISSR引物中筛选出 13条稳定性好、谱 带清晰的 ISSR引物（表 2）。用筛选的 13条 ISSR引 物对 163份核桃样品的 DNA进行 ISSR-PCR扩增，电 泳检测扩增位点共检测出 117条，其中多态性位点 98 条，部分凝胶电泳结果见图 1和图 2。 2.2 遗传多样性分析 采用 POPGEN version 1.32软件分析供试核桃的 遗传多样性及香农指数等数值（表 3）。 表 2 13条 ISSR引物的特征 Table 2 Characteristics of 13 pairs of ISSR primers 引物名称 Primer 引物序列 (5′→3′) Primer sequence (5′→3′) 退火温度 Annealing temperature (℃) 扩增条带数 Total number of amplified bands 多态性带数 The number of polymorphic bands 多态性条带比率 Percentage of polymorphic bands (%) I807 (AG)8T 53.0 7 7 100.00 I811 (GA)8C 53.0 11 9 81.82 I821 (GT) 8T 53.0 7 5 71.43 I822 (TC)8A 52.0 8 5 62.50 I825 (AC)8T 52.0 11 9 81.82 I826 (AC)8C 52.0 9 9 100.00 I828 (TG)8A 53.0 10 10 100.00 I834 (AG)8YT 52.0 9 6 66.67 I836 (AG)8YA 53.0 9 9 100.00 I856 (AC)8YA 52.0 8 8 100.00 I857 (AC)8YG 53.0 10 10 100.00 I888 BDB(CA)7 52.0 10 6 80.00 I891 HVH(TG)7 52.0 8 5 62.50 总计 Total 117 98 图 1 引物 I811对鄯善居群扩增的凝胶电泳图谱 Fig. 1 Results of electrophoresis of amplification SS population using primer I811 1874 中 国 农 业 科 学 44卷 图 2 引物 I857对霍城居群扩增的凝胶电泳图谱 Fig. 2 Results of electrophoresis of amplification HC population using primer I857 表 3 供试核桃遗传多样性的统计 Table 3 The statistics of genetic diversity of walnut 居群 Population 多态性位点数 NP 多态性位点百分率 PPL 等位基因数 A 有效等位基因数 Ae 遗传多样度指数 H 香农指数 I HM 73 69.52 1.3867 1.1768 0.1102 0.1712 SS 78 73.58 1.3467 1.1812 0.1192 0.1662 TLF 58 52.72 1.2000 1.0565 0.0890 0.0663 GL 53 51.96 1.1200 1.0478 0.0794 0.0491 HC 84 82.35 1.3600 1.1939 0.1195 0.1734 WS 92 80.00 1.7600 1.4224 0.2417 0.3641 物种水平 At species level 98 83.76 1.9467 1.4408 0.3010 0.4182 A: Observed number of alleles; Ae: Effective number of alleles; H: Nei’s (1973) gene diversity; I: Shannon’s Information index; NP: The number of polymorphic loci; PPL: The percentage of polymorphic loci (PPL) % 有效等位基因数（Ae）和遗传多样度指数（H） 是目前应用较为广泛的遗传多样性指数，而遗传多度 指数（H）不仅是衡量供试材料遗传多样性最常用的 指标，同时也反映该物种中等位基因的丰富度和均匀 程度。由表 3分析，在供试材料的物种水平上，新疆 核桃遗传多样性的指数为：多态性位点（NP）有 98 个、多态性位点占有率（PPL）达到 83.76%、等位基 因数（A）1.9467、有效等位基因数（Ae）1.4408、香 农指数（I）0.4182、遗传多样度（Ht：Nei’s 1973 total genetic diversity）指数 0.3010；供试 163 份核桃的有 效等位基因数（Ae）介于 1.0478—1.4224；遗传多样 度指数（H）变动范围为 0.0794—0.2417，表明供试核 桃居群之间的遗传多样度差异比较大。以已检测的 Ae 和 H作为标准，上述数据表明供试核桃之间的遗传多 样性具有相同的趋势：温宿栽培品种（WS）＞霍城 （HC）＞鄯善（SS）＞哈密（HM）＞吐鲁番（TLF） ＞巩留（GL），即温宿栽培核桃遗传多样性较高，巩 留野生核桃遗传多样性较低。 2.3 遗传分化 采用 POPGEN version 1.32软件计算供试核桃的 遗传分化与基因流，得出遗传分化系数（Gst： Coefficient of gene differentiation）为 0.6425，表明有 64.25%的遗传分化存在于居群之间，有 35.75%的遗传 分化存在于居群内，这也说明核桃居群之间的遗传分 化高于居群内的遗传分化。供试核桃的基因流（Nm： effective number of migrants）计算值为 0.2782＜1，表 明供试核桃居群之间存在较小的基因流，也进一步说 明基因的遗传漂变已造成居群之间将产生较大的遗传 分化。 采用HICKORY version 1.1软件进一步分析供试 核桃的遗传分化，计算随机交配杂合度hs（average panmictic heterozygosity），相当于期望杂合度He （expected heterozygosity）；固定指数或内繁育系数 FIS（inbreeding coefficient at the region level）；近交系 数FIT（inbreeding coefficient at the total sample level）， 分析数据见表 4。 由表 4可知，供试 163份核桃的随机交配杂合度 在种级水平的指数为 0.4253；随机交配杂合度的差异 9期 李 超等：新疆核桃种质资源遗传多样性的 ISSR分析 1875 表 4 供试核桃的遗传分化系数 Table 4 Genetic differentiation of walnut 居群及指数 Population and index 随机交配杂合度 hs 标准差 St. Dev 95%置信区间 95% confidence interval HM 0.4256 0.0146 0.3939—0.4488 SS 0.4245 0.0146 0.3935—0.4483 TLF 0.4239 0.0149 0.3922—0.4483 GL 0.4266 0.0137 0.3970—0.4490 HC 0.4254 0.0142 0.3952—0.4489 WS 0.4257 0.0143 0.3952—0.4489 总杂合度 Total 0.4253 0.0142 0.3951—0.4484 内繁育系数FIS 0.1182 0.0218 0.0773—0.1624 近交系数FIT 0.5925 0.2489 0.0678—0.9623 较小，均在 0.4239—0.4266，由高至低依次为：巩留 （GL）＞温宿（WS）＞哈密（HM）＞霍城（HC） ＞鄯善（SS）＞吐鲁番（TLF），表明巩留核桃的随 机交配杂合度较高，而吐鲁番核桃的随机交配杂合度 较低。此外，供试核桃的固定指数或内繁育系数FIS 值为 0.1182＞0，进一步表明供试核桃整体的随机交配 杂合度不足；近交系数FIT 值为 0.5925≠0，表明供试核 桃之间已发生近亲交配，这也和上述分析的随机交配 杂合度相符合。 上述结果表明，无论在整体水平还是在个体水平， 供试核桃均表现为杂合度不足的现象，其重要特征是 核桃的纯合基因型增加，近似于农作物育种的纯系。 2.4 遗传结构和遗传距离 采用 ARLEQUIN3.1 软件对供试核桃的遗传结构 进行 AMOVA（analysis of molecular variance）分析。 通过对 ISSR-PCR 扩增的“0”、“1”数据进行方差 分析，计算居群间和居群内的方差、方差分量及贡献 率，依此来评价遗传结构变异在居群间和居群内所占 的比率，计算数据见表 5。 由表 5可知，居群间和居群内的差异均极显著（P ＜0.001）。供试核桃的遗传变异主要分布在居群间， 其遗传变异方差分量的贡献率较大，占 70.55%，而居 群内方差分量的贡献率较小，占 29.45%。此外，供试 核桃间的表型预测（Фst）值为 0.7060，也说明遗传结 构的变异主要存在于居群间，这也与 2.3 中分析遗传 分化的结果相符合。 采用 POPGEN version 1.32 软件，根据 Nei 氏 （1978）的方法分析供试核桃的遗传距离与遗传一致 性（对角线上面数据是遗传一致性，下面数据是遗传 距离），计算结果见表 6。 遗传距离是从相反方向，遗传一致度是从相同的 方向，对供试核桃进行遗传关系方面的分析，即亲缘 关系越近的核桃遗传一致度系数越接近 1，反之，其 遗传距离越接近 0。由表 6 得知，供试核桃居群间的 遗传一致性变化范围为 0.6031（GL 与 WS）—8 968 （HM与 HC）；居群间的遗传距离变化范围为 0.1090 （HM与 HC）—5 056（GL与WS），表明 HM与 HC 表 5 基于 ISSR数据分析核桃的遗传变异指数 Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for population of walnut by ISSR data 变异源 Source of variance 平方和 SS 自由度 df 均方差 MSE 方差分量 Variance component 方差分量百分率 Total variation (%) 显著性 P值 P-value PHIst系数 Фst 居群间 Among population 1059.0090 5 211.802 7.7616 70.55 <0.0010 0.7060 居群内Within population 508.5615 157 3.239 3.2392 29.45 <0.0010 0.001显著水平 0.001 significance level 表 6 供试核桃的遗传一致性与遗传距离 Table 6 Genetic identity and genetic distances among six populations of walnut 居群 Population HM SS TLF GL HC WS HM **** 0.8004 0.8117 0.7970 0.8968 0.6554 SS 0.2782 **** 0.8227 0.7132 0.7838 0.6478 TLF 0.2087 0.1952 **** 0.6954 0.7557 0.6452 GL 0.2269 0.3380 0.3633 **** 0.8231 0.6031 HC 0.1090 0.2436 0.2801 0.1947 **** 0.6311 WS 0.4225 0.4342 0.4382 0.5056 0.4603 **** 1876 中 国 农 业 科 学 44卷 核桃的遗传关系较近，遗传距离为 0.109，因为两者同 属于野生核桃。GL 与 WS 核桃的遗传关系较远，遗 传距离为 0.5056，因为前者属于国家二级保护的野生 植物，为珍贵的第三纪温带落叶阔叶林的残遗成分， 生于海拔 1 200—1 600 m的山坡下部或峡谷沟底，是 新疆栽培核桃群系的直系祖先；后者属于绿洲地域的 栽培核桃，在漫长的进化与人为等因子的影响下，造 成两者遗传距离较远，这也与目前所处的实际地理位 置和生长环境相符合。 为了进一步探讨供试核桃的遗传关系，利用 MEGA3.1软件，采用邻接法（neighbour-joining method， NJ），即距离矩阵法绘制出 5个居群和 1个栽培类型， 供试核桃的遗传距离聚类分析（图 3）。 图 3 利用 NJ法根据 Nei’s遗传距离对 5个居群和 1个栽培 类型的生态地理聚类分析 Fig. 3 Dendrogram obtained by NJ cluster analysis based on Nei’s genetic distance among 5 populations and 1 type of Juglans regia 由图 3分析，供试核桃的地理聚类可为三大类： 其中WS类型与其它居群的地理位置相距较远，先聚 为第 1 类；SS 与 TLF 聚为第 2 类，进一步也可分成 SS亚类与 TLF亚类；GL与 HC、HM聚为第 3类， 由于 GL与 HC的地理位置较近，先聚为第 1亚类后， HM 与两者居群相距较远，聚为第 2 亚类，分析表明 HM 居群与实际地理位置有误差。但整体聚类结果显 示，基本上符合“隔离-距离”模型。 2.5 聚类分析 采用 NTSYSpc2.1软件根据 Nei’s遗传一致度，利 用非加权配对算术平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA），对供试 的 163 份核桃个体进行遗传关系的聚类（图 4）。由 图 4 分析，供试核桃之间的遗传相似系数（gengtic similarity，GS）变化范围在 0.56—1.0。遗传相似系 数在 0.56处 163份核桃可以分成两大类，即温宿类 型 13份栽培核桃（151—163号）聚成第 1类， 余 下 150 份野生核桃聚成第 2 类。进一步细分遗传相 似系数约在 0.82处可把第 2类野生核桃分成 5个亚 类，即哈密亚类、鄯善亚类、吐鲁番亚类、巩留亚 类、霍城亚类；在 5 个亚类之间聚类结果又出现部 分个体的交叉，这表明在野生核桃居群之间也存在 着较小的基因流。 上述聚类结果表明，供试核桃具有较近的亲缘关 系，其相同居群所采集的核桃亲缘关系最近，并且能 较好的聚为一类；也进一步表明供试核桃之间又具有 明显的地域性，这与 2.4 中所采用的距离聚类分析的 结果基本相符合。 2.6 遗传相关性系数 r值分析 采用Mantel-struct version 1.0软件分析供试核桃 之间的遗传相关系数（genetic correlation），见表 7。 由表 7 得出，HM 和 HC 之间遗传相关性的 r 值较小 为0.7147，TLF和GL遗传相关性的 r值较大为0.9765。 这表明供试核桃之间具有较高的遗传相关性，其遗传 相关性系数的变化范围在 0.7147—0.9765，这也与 2.5 聚类分析的结果相符合，进一步说明供试核桃之间具 有较近的遗传关系。 表 7 核桃的遗传相关系数 r值分析 Table 7 Analysis of genetic correlation r of walnut population 居群 Population HM SS TLF GL HC WS HM **** 0.8770 0.9427 0.9075 0.7147 0.9099 SS **** 0.8969 0.9111 0.8701 0.9209 TLF **** 0.9765 0.9633 0.9217 GL **** 0.8440 0.8914 HC **** 0.8699 WS **** 9期 李 超等：新疆核桃种质资源遗传多样性的 ISSR分析 1877 图 4 ISSR标记对 163份核桃亲缘关系聚类图 Fig. 4 Dendrogram of the relationship UPGMA cluster of 163 walnuts based on ISSR markers 1878 中 国 农 业 科 学 44卷 3 讨论 3.1 核桃遗传多样性 遗传多样性是生物所携带遗传信息的总和，代表 该物种在特定环境中基因的丰富程度，是植物选育及 研究中最重要与最有价值的物质基础。王滑[17]认为中 国核桃居群在整体水平上遗传多样性较高，与本研究 的结果相符，本研究结果表明，供试核桃的多态性位 点比率为 83.76%，具有较高的遗传多样性。遗传分化 （genetic differentiation）本质上指基因频率的概率变 化及其杂合性变化的度量，是杂合度与一致度的扩展， 又称为基因分化（gene differentiation），其遗传分化 值越高越接近于 1表明该居群物种的遗传分化越高； 反之，越低。本试验得出供试核桃遗传分化系数（Gst） 为 0.6425，表明供试核桃之间的具有较高的遗传分化， 占 64.25%，这与众多风媒授粉针叶树的典型基因分化 模式相符合，即群体内基因分化水平较低，而群体间 基因分化水平相对较高[18]。 此外，基因流也能揭示该物种之间所发生的基因 渗透、遗传分化等遗传现象。一般来说木本植物的基 因流是通过花粉或种子传播而发生的，基因流Nm的数 值与居群间的基因分化呈负相关，即基因流越大的物 种，居群之间的遗传分化越小，大的基因流可以阻止 居群间的遗传分化。当基因流Nm＜1时遗传漂变造成 居群之间将产生较大的遗传分化；反之，若基因流Nm ＞1 时，则可以防止由遗传漂变引起的居群之间的遗 传分化[19-20]。 利用ISSR分子标记技术，对供试核桃遗传结构 AMOVA进行分析，表明供试核桃之间具有较高的遗 传变异，主要原因与供试核桃间存在较小的基因流交 流有关，也反映了该物种在长期进化史包括分布区转 移、生境片段化、居群特化、突变、遗传漂变、交配 系统、选择等不同过程的相互作用所造成的[21-23]。 根据ISSR标记技术所产生的“1”、“0”矩阵数 据，并采用NTSYSpc2.1 软件根据Nei’s遗传一致度， 利用UPGMA法对 163 份核桃样品个体之间进行聚类 与分析，得出遗传相似系数（GS）变化范围在 0.56— 1.00，表明相同地域核桃的亲缘关系最近，而不同地 域核桃的亲缘关系都较远，具有明显的地域性。通过 Mantel检测分析，供试核桃在遗传关系、亲缘关系和 地理距离方面均具有较高的遗传相关性。这与路安民 等通过对核桃果实传播方式、分化、生态及地理分化 研究的结果相符合，认为核桃属植物是从热带和亚热 带比较湿润的环境，向温带较为干燥环境迁移过程中 产生的按地理距离亲缘关系聚类的趋势[24]。 3.2 核桃资源保护 遗传多样性是物种长期进化的结果，同时代表了 该物种的进化潜力。因此为了生存，该物种在恶劣的 生境条件下进行进化并积累了较多的变异。核桃是中 国一种优质的经济树种，了解该物种遗传多样性水平 和遗传变异的空间分布格局对于制定科学的基因资源 保护策略具有重要作用，现代选育品种的遗传多样性 较差，地方品种较好，徐颖等[25]研究认为天然核桃株 系，在自然变异中有许多优良的性状，其后代的不同 株系将表现高抗果实细菌性黑斑病、炭疽病和叶片白 粉病，而且在生长势等方面均具有超双亲的优良变异。 鉴于供试新疆核桃遗传多样性水平较高，在遗传 改良工作中优良种源、优良居群、优良个体的选择不 容忽视，因此，供试核桃所在的居群及个体应优先保 护，尤其是在特殊生境中的核桃，在分类与遗传上具 有不可替代的独特性，根据核桃遗传多样性指数的高 低应优先保护温宿与霍城核桃、其次保护鄯善、哈密、 吐鲁番、巩留核桃。作者经实地采样了解，在供试的 居群内核桃树的年龄平均 100岁以上，部分核桃树可 能已有 300 多岁；平均树高 12—25 m，冠幅直径 11 —20 m，近地面干粗直径范围 35—150 cm。在核桃的 不同居群、或同居群不同个体间的核桃基因型差异较 大，采样中发现具有早实性的核桃树株，具体情况有 待进一步研究。但怎样保护和利用新疆这些古老基因 资源来培育或改良核桃新品种，进一步研究核桃优良 性状的遗传规律及挖掘现有特异核桃种质的优良基 因，都可能成为今后研究的重点。 4 结论 本研究经实地观察与试验技术相结合，从 DNA 水平对新疆 5个居群和 1个栽培类型共 163份核桃材 料进行遗传多样性分析，认为供试核桃的遗传多样性 水平较高，遗传变异主要分布在居群之间。在优先保 护现有居群的基础上，加强筛选和保存变异的核桃， 有助于核桃种质资源的保护、遗传改良及可持续利用。 References [1] 郗荣庭 , 张毅萍 . 中国核桃 . 北京 : 中国林业出版社 , 1992: 109-152. 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