冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）

乙型脑炎纯化疫苗（Vero细胞）制造及检定规程 冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞） Donggan Yixing Naoyan Miehuoyimiao (Vero Xibao) Japanese Encephalitis Vaccine（Vero Cell），Inactivated, Freeze-dried 本品系用乙型脑炎(以下简称乙脑)病毒接种于Vero细胞, 经培养、收获病毒液、灭活病毒、浓缩、纯化后，加入稳定剂冻干制成，用于预防乙脑。 1. 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合 “凡例”有关要求。 2. 制造 2.1 生产用细胞 生产用细胞为Vero细胞。 2.1.1 细胞库的管理及检定 应符合 “生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”。 各种子批代次应不超过批准的限定代次，取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。 2.1.2 细胞制备 取工作细胞库中的1支或多支细胞管，细胞复苏、 扩增至接种病毒的细胞为1批。将复苏后的单层细胞用胰蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化， 分散成均匀的细胞， 加入适宜的培养液混合均匀，置35℃~37℃培养形成致密单层细胞。 2.2 毒种 2.2.1名称及来源 生产用毒种为乙脑病毒P3株。 2.2.2种子批的建立 应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。 乙脑病毒P3株原始种子应不超过第53代， 主种子批和工作种子批的代次应不超过批准的限定代次。 2.2.3种子批毒种的检定 主种子批应进行如下全面检定，工作种子批至少应进行2.2.3.1-2.2.3.5项检定。 2.2.3.1鉴别试验 将毒种10倍系列稀释，取10-1～10-5稀释度的病毒液与乙脑特异性免疫血清等量混合作为试验组，取10-4～10-8稀释度的病毒液与乙型脑炎非特异性血清等量混合作为对照组，于37℃水浴中和90分钟，试验组和对照组每个稀释度分别接种体重为7-9g 昆明鼠或其他品系小鼠20只，每只脑内注射0.03ml，逐日观察，3日内死亡不计，观察14天，计算中和指数应不低于500。 2.2.3.2无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 2.2.3.3支原体检查 依法检查（附录XII B），应符合规定。 2.2.3.4 病毒滴定 将毒种10倍系列稀释，取10-6~10-9稀释度病毒液脑内接种体重为7～9g 昆明鼠或其他品系小鼠，每稀释度注射小鼠4只，每只0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，病毒滴度应不低于8.0 Lg LD50/ml。 2.2.3.5 病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.2.3.6免疫原性检查 用主种子批毒种制备原疫苗，腹腔免疫体重为12～14g NIH小鼠10只，每只0.3ml，免疫2次，间隔7天，初免后第14天， 对免疫组和未经免疫的对照组小鼠用不低于10 000 LD50病毒量的非生产用乙脑病毒P3株进行腹腔攻击，同时各组小鼠每只脑腔注射0.03ml稀释液。21天后免疫组应100%保护，对照组死亡率应不低于80%。 2.2.4 毒种保存 冻干毒种保存于-20℃以下，液体毒种保存于- 60℃以下。 2.3 原液 2.3.1 细胞制备 按2.1.2项进行。 2.3.2 培养液 培养液为含有适宜浓度灭能新生牛血清的199或其他适宜培养液。新生牛血清的质量应符合要求（附录XIII D），且乙脑抗体应为阴性。 2.3.3 对照细胞病毒外源因子检查 依法检查（附录XII C），应符合规定。 2.3.4 病毒接种和培养 细胞生长成致密单层时，弃去细胞培养液，用Earle’s液或其他适宜的洗涤液充分冲洗细胞,除去牛血清后,加入MEM维持液。工作种子批毒种按0.050.3MOI接种（同一批工作种子批应按同一MOI接种）。 置适宜温度下培养。 2.3.5 病毒收获 经培养60-84小时，澄清过滤后收获病毒液。根据细胞生长情况，可加入新鲜维持液继续培养， 进行多次病毒收获。同一细胞批的同一次病毒收获液检定合格后可合并为单次病毒收获液。 2.3.6 单次病毒收获液检定 按3.1项进行。 2.3.7 病毒灭活 应在规定的蛋白质含量范围内进行病毒灭活。单次病毒收获液中加入终浓度为200ug/ml甲醛，置适宜温度灭活一定时间。病毒灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样， 分别进行病毒灭活验证试验。 2.3.8 超滤浓缩 同一细胞批制备的多个单次病毒收获液经病毒灭活后， 进行适宜倍数的超滤浓缩至规定的蛋白质含量范围。 2.3.9 纯化 浓缩后的病毒液采用蔗糖密度梯度区带离心法或其他适宜的方法进行纯化。 2.3.10脱糖 将收集液以截留分子量100kD的膜进行超滤脱糖后，可加入适宜浓度的稳定剂，即为原液。 2.3.11 原液检定 按3.2 项进行。 2.4半成品 2.4.1 配制 用疫苗稀释液将原液按同一蛋白质含量和抗原含量进行稀释，总蛋白质含量不得超过20ug/ml，加入适宜的稳定剂即为半成品。 2.4.2半成品检定 按3.3项进行。 2.5成品 2.5.1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.5.2 分装及冻干 应符合“生物制品分装冻干规程”规定。 2.5.3 规格 复溶后每瓶0.5ml，每1次人用剂量0.5ml。 2.5.4 包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3．检定 3.1 单次病毒收获液检定 3.1.1 无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.1.2支原体检查 依法检查（附录XII B），应符合规定。 3.1.3病毒滴定 按2.2.3.4项进行，应不低于7.0 Lg LD50/ml。 3.2 原液检定 3.2.1无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.2.2 病毒灭活验证试验 将病毒灭活后供试品脑内接种体重1214g小鼠8只，每只0.03ml，同时腹腔接种0.5 ml， 为第1代； 7天后将第1代小鼠处死3只，取脑制成10%脑悬液，同法脑内接种12~14g小鼠6只，为第2代；7天后将第2代小鼠处死3只，同法脑内接种12~14g小鼠6只为第3代， 接种后逐日观察，3日内死亡者不计， 观察14天，全部健存为合格。（动物死亡数量应不超过试验用动物总数的20% ）。 3.2.3 蛋白质含量 应按附录VI B第二法进行测定，应按批准的执行。 3.2.4 抗原含量 采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。 3.3 半成品检定 3.3.1 无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.3.2 抗原含量 采用酶联免疫法，应按批准的标准执行。 3.4 成品检定 除水分测定外， 应按标示量加入灭菌注射用水， 复溶后进行以下各项检定。 3.4.1 鉴别试验 采用酶联免疫法检测， 应证明含有乙型脑炎病毒抗原。 3.4.2 外观 应为白色疏松体，复溶后应为无色澄明液体，无异物。 3.4.3水分 应不高于3.0%（附录 VII D）。 3.4.4 游离甲醛含量 应不高于10μg/ml（附录VI L）。 3.4.5 效价测定 采用免疫小鼠中和抗体测定法， 以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。 参考疫苗（RA和RB）以及中和试验阳性血清由国家药品检定机构提供。 将被检疫苗(T)和参考疫苗(R)分别稀释成1：32，腹腔免疫体重为12~14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第2次免疫后第7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭活30分钟。稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别与稀释病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合，同时将稀释后的病毒再1：2稀释作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔细胞培养板BHK21细胞，每孔0.4 ml，置37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于37℃培育5天，染色，蚀斑计数，病毒对照组的蚀斑平均数应在50~150之间。计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。 蚀斑减少率=（1－S/ CV）×100% S 为被检苗平均斑数 CV 为病毒对照组平均斑数 按以下公式计算被检苗效力T 值。 T=（Y－50）/ 47.762 ＋Lg X T= 被检苗引起50%蚀斑减少的抗体稀释度的对数 Y为被检苗的蚀斑减少数 X 为蚀斑中和试验时所用的血清稀释倍数 结果判定： （1）合格： T ≥（RA+RB）/ 2 ―0.33 （2）重试：（RA+RB）/2 ―0.66＜ T＜（RA+RB）/ 2 ―0.33 （3）不合格： T＜（RA+RB）/ 2 ―0.66 3.4.6 热稳定性试验 疫苗出厂前应进行热稳定性试验， 于37℃放置7天，按3.4.5项进行效价测定，仍应合格。如合格， 视为效价测定合格。 3.4.7牛血清白蛋白残留量 应不高于50ng/剂（附录VIII F）。 3.4.8无菌检查 依法检查（附录XII A），应符合规定。 3.4.9 异常毒性检查 依法检查（附录XII B），应符合规定。 3.4.10 细菌内毒素含量测定 应不高于50EU/ml（附录XII E 凝胶限量试验） 3.4.11 抗生素残留量测定 细胞制备过程中加入抗生素的应进行该项检查， 采用ELISA法，应不高于10ng/ml。 3.4.12 Vero细胞DNA残留量 应不高于100pg/剂（附录IX B）。 3.4.13 Vero细胞蛋白残留量测定 采用酶联免疫法， 应不高于2ug/ml， 并不得超过总蛋白含量的10%。 4．保存、运输及有效期 于2~8℃保存和运输。自生产之日起， 有效期为24个月。 5 疫苗稀释剂 疫苗稀释剂为灭菌注射用水，应符合对疫苗稀释剂有关要求。 5.1疫苗稀释剂装量 5.2 疫苗稀释剂包装 5.3 疫苗稀释稀释剂有效期 5.4 疫苗稀释剂批准文号 5.5 疫苗稀释剂生产企业 6说明书