丙型肝炎病毒重组联合疫苗的实验研究

①本文为河北省科技支撑项目 (08276412D) ②军事医学科学院基础医学研究所 ,北京 100850 ③邢台医学高等专科学院 ,邢台 054000 作者简介 :曾瑞红 (1970 年 - ) ,女 ,副教授 ,主要从事疫苗的研究 , E2 mail :zengruihong @yahoo. com ; 通讯作者及指导教师 :魏　林 (1961 年 - ) ,女 ,教授 ,博士生导师 ,主 要从事感染免疫学研究 , E2mail : weilin21 @ sina. com。 丙型肝炎病毒重组联合疫苗的实验研究① 曾瑞红 　李广学③　张贺秋②　凌世淦②　姚智燕 　修冰水②　贺 　峰②　杨建岭 　魏 　林 (河北医科大学免疫教研室 ,石家庄 050017) 　　中国图分类号 　R373. 21 　　文献标识码 　A 　　文章编号 　10002484X( 2009) 0820687205 [摘 　要 ] 　目的 :研究一种基于丙型肝炎病毒 ( HCV) 多个抗原的重组联合疫苗。方法 :将三种 HCV 重组抗原 F4HVR1、 HCV2T和 HCV2E1 混合 ,联合免疫 BALB/ c 小鼠 ,用 ELISA 检测血清抗体滴度 ;第三次免疫后 10 天杀死一半小鼠 ,取脾细胞 ,用 乳酸脱氢酶 (LDH)释放法检测细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)活性 ;用 ELISPOT法检测分泌 IFN2γ和 IL24 的细胞 ;用流式细胞仪检 测 CD4 + T和 CD8 + T细胞 ;最后一次免疫后 2 周 ,在免疫小鼠的背部皮下注射 1. 0 ×106 个 SP2/ 02NS3 细胞 ,考察联合免疫对小 鼠的保护作用。结果 :F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 联合免疫诱导了高滴度的 HCV2E1 和 F4HVR1 特异性的 IgG抗体以及高水平 的 CTL 活性 ;与单独免疫相比 ,联合免疫诱导了平衡的 Th1/ Th2 免疫应答 ;而且联合免疫后能显著预防 SP2/ 02NS3 对小鼠的攻 击。结论 :F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 诱导了保护性的体液免疫和细胞免疫应答 ,有望开发为一种有效的重组 HCV 联合疫苗。 [关键词 ] 　丙型肝炎病毒 ;联合疫苗 ;体液免疫 ;细胞免疫 ;保护作用 Experimental study of a HCV recombinant combined vaccine ZENG Rui2Hong , LI Guang2Xue , ZHANG He2Qiu , LING Shi2Gan , YAO Zhi2Yan , XIU Bing2Shui , HE Feng , YANG Jian2 Ling , WEI Lin. Department of Immunology , Hebei Medical University , Shijiazhuang 050017 , China [ Abstract] 　Objective :To study a HCV recombinant combined vaccine based on several antigens of HCV.Methods :Mice were co2im2 munized with three recombinant antigens F4HVR1 ,HCV2T and HCV2E1. The antibodies in sera were tested by ELISA. Spleens from immunized BALB/ c mice were removed 10 days after the third immunization. CTL activity was assessed using a LDH Cytotoxicity Assay Kit. IFN2γ2 and IL242 secreting cells were quantified using a ELISPOT kit. Percentages of CD4+ T and CD8 + T cells in the spleen cells of mice were analyzed with flow cytometer. Two weeks after the final immunization ,the mice were challenged s. c. at the back with 1. 0×106 SP2/ 02NS3 cells ,and protective effect was observed. Results :Co2immunization with F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 induced high tiers of HCV2E12 or F4HVR12 spe2 cific IgG antibody ,high level of CTL activity ,and a balanced Th1/ Th2 response. The combined vaccine F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 could significantly protect mice from SP2/ 02NS3 cells. Conclusion :Co2immunization with F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 induces protective humoral and cellular immune responses. F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 is potential as a prophylactic HCV vaccine. [ Key words] 　HCV ;Combined vaccine ;Humoral immunity ;Cellular immunity ;Protective effect 　　丙型肝炎是由丙型肝炎病毒 ( Hepatitis C Virus , HCV)引起的慢性传染性疾病。目前全球 HCV 感染 者约有 2. 0 亿 ,我国约 3 800 万人感染 HCV。80 %的 HCV 感染者可发展为慢性感染 ,部分慢性 HCV 感染 会发展为肝硬化 ,甚至肝癌。目前尚无特异性的治 疗和预防措施 ,首选的治疗方法是 IFN2α与利巴韦林 联合使用 ,价格昂贵 ,副作用较明显 ,且仅对 20 %～ 60 % 的患者有较好的疗效[1 ,2 ] 。除了肝功能障碍的 症状以外 ,HCV 感染常和多种自身免疫性疾病以及 非柯杰金氏淋巴瘤等有关 ,对生活质量构成了严重 的影响。在预防传染病方面疫苗发挥着不可替代的 作用 ,目前急需发展一种有效的疫苗来控制 HCV 的 感染。 之所以至今仍无一例安全有效的丙肝病毒疫苗 上市 ,原因是多方面的 ,其中病毒的高度变异性是重 要原因之一。E1 和 E2 是 HCV 的两个表面糖蛋白 , 是疫苗研究的两个重要抗原 ,但这两个蛋白高度变 异 ,尤其是 E2 ,E2 有两个高变区 HVR1 和 HVR2 ,研 究表明 HVR1 含有中和抗体表位 ,抗 HVR1 抗体能 够保护黑猩猩免于同源 HCV 的感染[3 ] ,但不能抵抗 其它型别的 HCV 感染。为了提高抗 HVR1 抗体的 交叉保护性 ,本课题组从我国流行的 HCV 型别中筛 选了几个有代表性的、具有高交叉保护性的 E22 HVR1序列进行组合 ,研制了一种重组嵌和抗原 ·786·曾瑞红等　丙型肝炎病毒重组联合疫苗的实验研究　第 8 期 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net F4HVR1 ,该抗原对我国的 HCV 流行株具有高度的 交叉保护性[4 ] ,为 HCV 疫苗的研究奠定了基础。E1 与 E2 相比变异性小 ,HCV2E1 是本课题组制备的一 种基于多型别 HCV E1 的重组抗原。HCV2T 是一个 基于 HCV 的核心蛋白 C和几个非结构蛋白 NS 的 T 细胞表位的重组抗原 ,可以激活 CD4 + T 和 CD8 + T 细胞 , 诱导保护性细胞免疫应答。本研究将 F4HVR1、HCV2E1 和 HCV2T 三个抗原联合免疫 BALB/ c 小鼠 ,研究体液免疫原和细胞免疫原联合免 疫后的免疫原性及免疫保护性。 1 　材料与方法 111 　试剂和动物 　LDH (乳酸脱氢酶) 细胞毒性检 测试剂盒以及 ELISPOT试剂盒为 Cayman 公司产品 ; 流式细胞仪检测用标记抗 CD4 和 CD8 抗体为 Invit2 rogen 公司产品。碱性磷酸酶标记的 IgG购自中山 生物技术公司 ,碱性磷酸酶标记的 IgG1 和 IgG2a 二 抗为 Caltag Laboratories Inc.公司产品 ;铝盐佐剂 alhy2 drogel 为丹麦产品。96 孔 PVDF 滤膜板 MAIP S4510 为 Millipore 产品。F4HVR1、HCV2E1 和 HCV2T 为本 课题组制备。6 周龄雌性 BALB/ c 小鼠购自河北省 实验动物中心。 1. 2 　方法 1. 2. 1 　重组抗原 F4HVR1、HCV2E1 和 HCV2T 的准 备 　(1) HCV2E1 :人工合成经筛选的 6 个 HCV 基因 型的 E1 N2端的中和表位和一个强的 CD4 + T 细胞 表位的基因 ,利用重叠延伸 PCR 扩增得到 HCV2E1 全长基因片段 ,插入原核表达质粒 pBVIL1 中 ,转化 E. coli 表达 ,经 S2Sepharose Fast Flow 阳离子交换和 Sephadex G250 凝胶过滤纯化得 HCV2E1 ; (2) HCV2T: 合成从 HCV NS3 和 Core 蛋白中筛选的 CD4 + T细胞 表位和 CD8 + T 细胞表位的基因 ,其它步骤同上 ; (3) F4HVR1 :人工合成有代表性的、具有高交叉保护 性的 E22HVR1 序列的基因 ,其它步骤同上。用 SDS2 PAGE和 Western blot 其纯度和特异性。 1. 2. 2 　动物的免疫和攻击 　将 BALB/ c 小鼠分成 5 组 ,以 20 % alhydrogel (v/ v) 为佐剂 ,分别用 200μl F4HVR1 (50μg) 、HCV2T (50μg) 、HCV2E1 (50μg) 、 F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 (各 50μg)和 PBS皮下多 点免疫小鼠 ,3 周免疫一次 ,共免疫 3 次 ,最后一次 免疫后 10 天杀小鼠 ,每组 6 只 ,取脾细胞 ,用于 CTL 活性、分泌 IFN2γ和 IL24 的细胞和 CD4 + / CD8 + T细 胞的检测。最后一次免疫后两周 , 在 HCV2T、 F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 和 PBS 组各 6 只小鼠的 背部皮下注射 1. 0 ×106 SP2/ 02NS3 细胞 ,每天观察 小鼠背部肿瘤生长状况以及小鼠的生长状况 ,观察 2 个月 ,处死小鼠 ,剥离肿瘤称重。 1. 2. 3 　ELISA 检测抗体滴度 　第一次免疫后 20、41 和 52 天取血分离血清。用 HCV2E1 或 F4HVR1 包被 酶标板 ,免疫血清为一抗 ,羊抗鼠碱性磷酸酶标记 的2IgG为二抗 ,采用标准的 ELISA 程序[5 ] 。每组检 测 6 只小鼠 ,每只小鼠的血清样品设 3 个复孔 , ELISA 滴度表示为最大稀释度的对数 ,OD ≥0. 15 并 且至少是阴性对照的两倍。 1. 2. 4 　用LDH 释放法检测 CTL 活性 　最后一次免 疫后 10 天杀死 6 只小鼠 ,取脾细胞 ,用 20μg HCV2T 体外刺激脾细胞 5 天得效应细胞 ,将效应细胞与靶 细胞 SP2/ 02NS3 按效靶比 100∶1、50∶1、25∶1、12. 5∶1、 6. 2∶1 加载到 96 孔细胞培养板中 ,SP2/ 0 细胞作为对 照细胞 ,同时设置靶细胞 SP2/ 02NS3 自然释放LDH孔 和最大释放LDH孔 ,分别设 3 个复孔 ,在 CO2 培养箱 37 ℃共培养 6 小时 ,根据LDH释放试剂盒说明书检测 CTL 活性。特异性细胞杀伤率 ( %) = (试验组 OD 值 - 自然释放组 OD 值) / (最大释放 OD 值 - 自然释放组 OD 值) 。 1. 2. 5 　ELISPOT法检测分泌 IFN2γ和 IL24 的细胞 　 每组检测 4 只小鼠 ,每只小鼠的脾细胞样品设 3 个 复孔 ,按试剂盒说明操作 :在 96 孔滤膜板中加 100 μl/ 孔的 70 %乙醇 ,室温放置 10 分钟 ,倒掉乙醇 ,用 PBS或包被缓冲液洗涤 ;加 100μl/ 孔适当稀释的捕 获抗体 ,4 ℃包被过夜 ;倾空板子 ,用包被缓冲液洗涤 2 次 ,加 200μl/ 孔 RPMI1640 完全培养基 ,室温封闭 1 小时 ;弃液 ,加入 100μl/ 孔用 RPMI1640 稀释的抗 原 ;每孔加入脾细胞 106 个/ 100μl ,在 37 ℃5 %CO2 培养箱中培养 36 小时 ;将培养物倒掉 ,拍干 ,用 PB2 ST洗涤 3 次 ,加 100μl/ 孔生物素标记的检测抗体 , 室温放 2 小时。弃液 ,用 PBST洗涤 4 次 ,加 100μl/ 孔亲和素标记的辣根过氧化物酶 ,室温放置 45 分 钟 ,洗涤 ,加 100μl/ 孔新配置的 AEC (32amino292ethyl carbazole)底物液 ,室温显色 10～60 分钟 ,观察斑点 形成。加 200μl/ 孔蒸馏水洗板 3 次终止反应。自 然干燥 ,用读板机读板。 1. 2. 6 　流式细胞仪检测 CD4 + T 和 CD8 + T 细胞 　 每组检测 6 只小鼠 ,每只小鼠的脾细胞样品设 3 个 复孔 ,取 106 个/ 100 μl 脾细胞 ,加入适当浓度的 FITC标记的抗 CD4 抗体和 PE 标记的抗 CD8 抗体 , 室温孵育 20 分钟 ,用 500μl 生理盐水洗 1 次 ,1 500 r/ min 离心 ,弃上清 ,再加 500μl 生理盐水重悬细胞 , 用流式细胞仪检测。 1. 2. 7 　统计学方法 　用 t 检验分析 , P < 0. 05 为差 异有统计学意义。 ·886· 中国免疫学杂志 2009 年第 25 卷 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 2 　结果 2. 1 　联合免疫刺激产生了特异性的体液免疫应答 　如图 1 所示 ,第二次免疫后的抗体效价比第一次 免疫后显著高 ( P < 0. 05) ,第三次免疫后的抗体效 价与第二次相比没有显著性差异 ( P > 0. 05) ,表明 免疫次数采取 2～3 次比较合适。另外 ,联合免疫分 别诱导了 F4HVR1 和 HCV2E1 特异性的抗体 ,且其 抗体滴度与单独的 F4HVR1 或 HCV2E1 所诱导的抗 体滴度没有显著性差异。这些结果表明 : F4HVR1 和 HCV2E1 均为强免疫原 ,且二者与 T 细胞表位抗 原 HCV2T联合免疫后仍能诱导强烈的、特异性的体 液免疫应答 ,即三个抗原联合免疫不影响体液免疫 的强度和特异性。 2. 2 　联合免疫诱导了强烈的 CTL 应答 　如图 2 所 示 :当靶细胞为 SP2/ 02NS3 时 , F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 和 HCV2T 均诱导了强的 CTL 应答 ,而靶细 胞为 SP2/ 0 时 ,均不能诱导 CTL 的产生 ,说明 CTL 是 NS3 特异性的 ,HCV2T中含有 NS3 的 T细胞表位 ,即 图 1 　免疫 BALB/ c 小鼠诱导的特异性体液免疫应答 Fig. 1 　Specific humoral responses following immunization in BALB/ c mice Note :A. F4HVR12specific IgG antibodies ;B. HCV2E12specific IgG antibod2 ies. 该 CTL 是 HCV2T 特异性的。另外 , F4HVR1 + HCV2 T + HCV2E1 所诱导的 CTL 显著高于 HCV2T 组的 CTL 水平 ( P < 0. 05) ,表明 HCV2T 与 F4HVR1 和 HCV2E1 联合免疫增强了 HCV2T 所诱导的 CTL 应答。 2. 3 　分泌 IFN2γ和 IL24 的细胞数量 　ELISPOT结果 显示 : F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 联合免疫组的分 泌 IL24 的细胞数为 (12～54) / 106 ,与 F4HVR1 单独 免疫组 (12～42) / 106 接近 ,而 HCV2T ( < 20/ 106) 或 HCV2E1 ( < 10/ 106) 单独免疫所刺激的分泌 IL24 的 细胞数量都很少 (图 3A) 。F4HVR1 + HCV2T + HCV2 E1 联合免疫组的分泌 IFN2γ的细胞数为 24～40 (平 均 31) / 106 ,三个单独免疫组均较少 (平均值分别为 14、11、10 / 106) 。已知 IFN2γ是典型的 Th1 型细胞因 子 ,而 IL24 则是典型的 Th2 型细胞因子 ,可见 ,联合 免疫组激活了更多的 Th1 和 Th2 细胞。另外 ,联合 免疫组的分泌 IFN2γ的细胞数平均值正好等于分泌 IL24 的细胞数平均值 ;F4HVR1 单独免疫组分泌 IL24 的细胞数平均值是分泌 IFN2γ的细胞数平均值的 2 倍以上 ;HCV2E1 单独免疫组分泌 IFN2γ的细胞数平 均值是分泌 IL24 的细胞数平均值的 2 倍以上。以上 结果表明 :联合免疫组诱导了平衡的 Th1/ Th2 应答 , 图 2 　免疫 BALB/ c 小鼠诱导的 CTL 应答 Fig. 2 　Induction of antigen2specific CTL responses following immunization in BALB/ c mice Note :A. Target cells were SP2/ 02NS3 cells steadily expressing HCV2NS3 pro2 tein ;B. Target cells were SP2/ 0 cells (as a control) . ·986·曾瑞红等　丙型肝炎病毒重组联合疫苗的实验研究　第 8 期 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表 1 　免疫 3 次后接种 SP2/ 02NS3 细胞 ,小鼠的肿瘤重量 Tab. 1 　The tumor weights of mice challenged with SP2/ 02NS3 cells after 3 times immunization Immunogen Tumor weight of each mouse after 2 months (g) 1 2 3 4 5 6 Protective rate ( %) Survival rate ( %) F4HVR1 + mT + mE1 0. 0 0. 0 3. 2 0. 0 0. 0 0. 0 83. 3 100 mT 5. 1 0. 0 0. 0 0. 1 0. 0 0. 0 66. 7 100 PBS — 4. 8 2. 4 — — 2. 6 0. 0 50 Note : —. Death. 图 3 　联合疫苗在小鼠体内刺激产生的 IFN2γ和 IL24 分泌 细胞 Fig. 3 　The frequency of antigen2specific IFN2γ2 or IL242se2 creting T cells in splenocytes of mice immunized Note :A :Number of IL242secreting cells ;B :Number of IFN2γ2secreting cells ; Each shade bar represents an individual vaccinated mouse. Back bar represents the mean value. F4HVR1诱导了 Th2 优势应答 , HCV2E1 诱导了 Th1 优势应答。 2. 4 　脾细胞中的 CD4 + T 和 CD8 + T 的百分率 　既 然 HCV2T中既有 CD4 + T 细胞表位 ,又有 CD8 + T 细 胞表位 ,用流式细胞仪检测了脾细胞中的 CD4 + T 和 CD8 + T细胞的百分率。如图 4 所示 :F4HVR1 + HCV2 T + HCV2E1 和 HCV2T免疫组中 CD4 + T 和 CD8 + T 细 胞的百分率均高于 PBS 组 ,说明 F4HVR1 + HCV2 T + HCV2E1 和 HCV2T 免疫后刺激了 CD4 + T 和 CD8 + T 细胞的增殖。 图 4 　流式细胞仪检测的 CD4 + T和 CD8 + T细胞的百分率 Fig. 4 　Percentage of CD4+ T and CD8 + T cells activated in mice by flow cytometry 2. 5 　免疫对小鼠的保护作用 　用 SP2/ 02NS3 肿瘤 细胞攻击免疫后的 BALB/ c 小鼠作为评价免疫保护 性的模型。如表 1 所示 : F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 能够保护 83. 3 %的被免疫的小鼠 ,而 HCV2T单独免 疫仅能保护 66. 7 %的小鼠免受 SP2/ 02NS3 的攻击 , PBS组中所有小鼠均长了肿瘤 ,保护率为 0。可见 F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 联合免疫对小鼠具有良 好的保护作用。 3 　讨论 HCV 的高度异源性是 HCV 疫苗研究的重要障 碍 ,通过对来自全球的多株 HCV 序列分析表明 ,至 少存在 6 种主要基因型和大约 70 种基因亚型[6 ] 。 其变异性主要表现在病毒表面糖蛋白 E1 和 E2 上 , 而核心蛋白 C 和非结构蛋白 NS 相对保守 ,本课题 组早期的研究主要集中在克服病毒变异性的免疫原 研究上 ,先后设计并研制了基于多型别 HCV 的、能 够诱导广泛交叉保护性体液免疫的 F4HVR1 和 HCV2E1 ,以及含有 C 和 NS 的 T 细胞表位的 HCV2T 重组抗原。 体液免疫应答在保护机体免受病毒的攻击中发 挥着重要作用[7 ,8 ] ,研究表明 ,HCV 抗体混合物能够 ·096· 中国免疫学杂志 2009 年第 25 卷 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 中和不同来源的病毒 ;而细胞免疫在清除已经感染 的细胞、控制 HCV 感染中发挥着重要作用[729 ] ,在 HCV 感染的患者中 ,能够在感染早期产生较强的针 对 HCV 各个蛋白的多表位特异性 CTL ,则患者的感 染多表现为自限性[6 ] ,在免疫球蛋白缺乏症的儿童 中 ,尽管无特异性抗体 ,HCV 感染也可呈自限性 ,提 示 CTL 活性对 HCV 感染的控制具有重要作用[9 ] 。 同时诱导细胞免疫和体液免疫是 HCV 疫苗研究的 理想策略。本研究将体液免疫原 F4HVR1 和 HCV2 E1 及细胞免疫原 HCV2T联合免疫 ,同时诱导了抗原 特异性的高滴度的抗体和高水平的 CTL。迄今为止 还没有体液免疫应答保护作用的有效评价体系和小 动物模型 ,所以我们仅体外检测了体液免疫的强度 以及特异性 ,证明联合免疫能够诱导较强的特异性 体液免疫应答 ,而且联合免疫刺激的体液免疫不受 HCV2T抗原的影响 ;参与细胞免疫的细胞主要包括 CD4 + T 细胞和 CD8 + T 细胞 ,CD4 + T 细胞在调解体 液免疫和 CD8 + T细胞免疫应答中发挥着中心作用 , 流式细胞仪检测结果表明联合免疫同时激活了这两 种 T 细胞。CD4 + T 细胞可分化为多个亚群 ,其中 Th1和 Th2 分别促进细胞免疫和体液免疫应答 , ELISPOT的检测结果显示 F4HVR1 诱导了 Th2 优势 应答 ,HCV2E1 诱导了 Th1 优势应答 ,这两个抗原与 HCV2T联合免疫后诱导了平衡的 Th1/ Th2 应答 ,这 对于疫苗的有效性和安全性是有利的。尽管缺乏评 价细胞免疫的保护性的模型 ,但用表达 NS3 蛋白的 肿瘤细胞攻击免疫的小鼠已是一个被普遍使用的代 用模型 , F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 联合免疫可以 有效保护 SP2/ 02NS3 对小鼠的攻击。 综上所述 , F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 联合免 疫诱导了高水平的特异性抗体和 CTL ,同时激活了 CD4 + T细胞和 CD8 + T 细胞 ,诱导了平衡的 Th1/ Th2 应答 ,保护性研究结果表明联合免疫能够有效保护 小鼠。可见 , F4HVR1 + HCV2T + HCV2E1 可能成为 一例有希望的预防性 HCV 疫苗。 4 　参考文献 1 　Foster G R. Past ,present ,and future hepatitis C treatments[J ] . Sem Liv Dis ,2004 ;24 (Suppl . 2) :972104. 2 　Feld J J ,Hoofnagle J H. Mechanism of action of interferon and ribavirin in treatment of hepatitis C[J ] . Nature ,2005 ;436 :9672972. 3 　Folgori A ,Capone S ,Ruggeri L et al . A T2cell HCV vaccine eliciting ef2 fective immunity against heterologous virus challenge in chimpanzees[J ] . Nat Med ,2006 ;12 :1902197. 4 　Xiu B S ,Ling S G,Song X G et al . Cross2reactivity of hypervariable re2 gion 1 chimera of hepatitis C virus [J ] . World J Gastroenterol ,2003 ; 9 (6) :125621260. 5 　Depraetere S ,Leroux2Roels G. Hepatitis C virus envelope proteins : im2 munogenicity in humans and their role in diagnosis and vaccine develop2 ment[J ] . Viral Hepat Rev ,1999 ;5 :1132146. 6 　Lavanchy D ,Purcell R ,Hollinger F B et al . Global surveillance and con2 trol of hepatitis C[J ] . J Viral Hepat ,1999 ;6 :35247. 7 　Bowen D G,Walker C M. Adaptive immune responses in acute and chron2 ic hepatitis C virus infection[J ] . Nature ,2005 ;436 :9462952. 8 　Houghton M ,Abrignani S. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus[J ] . Nature ,2005 ;436 :9612966. 9 　Bjoro K,Skaug K,Haaland T et al .Long2term outcome of chronic hepati2 tis C virus infection in primary hypogammaglobulinaemia[J ] . QJM ,1999 ; 92 :4332441. [收稿 2008211216 　修回 2009202226 ] (编辑 　许四平) (上接第 686 页) 2 　Welt C ,Sidis Y,Keutmann H et al . Activins ,inhibins and follistatins :from endocrinology to signaling [J ] . Exp Biol Med ,2002 ;227(9) :7242752. 3 　Endo D ,Maku2Uchi M ,Kojima I. Activin or follistatin :which is more ben2 eficial to support liver regeneration after massive hepatectomy [J ] . En2 docrine J ,2006 ;53 :73278. 4 　Date M ,Matsuzaki K,Matsushita M et al . Differential regulation of activin A for hepatocyte growth and fibronectin synthesis in rat liver injury [J ] . J Hepatol ,2000 ;32 :2512260. 5 　Patella S ,Phillips D J ,de Kretser D M et al . Characterization of serum ac2 tivin2A and follistatin and their relation to virological and histological de2 terminants in chronic viral hepatitis [J ] . J Hepatol ,2001 ;34 :5762583. 6 　Gold E J ,Francis R J ,Zimmermann A et al . Changes in activin and ac2 tivin receptor subunit expression in rat liver during the development of CCl42induced cirrhosis [J ] . Mol Cell Endocrinol ,2003 ;201 :1432153. 7 　张红军 ,柳忠辉 ,马　迪 et al . 激活素 A 及其 IIA 型受体在模型鼠 肝损伤过程中的表达 [J ] . 吉林大学学报 (医学版) ,2008 ;34 (3) : 3932396. 8 　Erwei Song ,Sang2Kyung Lee ,Jie Wang et al . RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J ] . Nature Med ,2003 ;9 (3) : 3472351. 9 　Gartner F ,Leist M ,Lohse A W et al . Concanavalin A2induced T2cell2me2 diated hepatic injury in mice :the role of tumor necrosis factor [J ] . Hepa2 tology ,1995 ;21(1) :1902198. 10 　Wang S Y,Tai G X ,Zhang P Y et al . Inhibitory effect of activin A on ac2 tivation of lipopolysaccharide2stimulated mouse macrophage RAW264. 7 cells [J ] . Cytokine ,2008 ;42(1) :85289. [收稿 2009202210 　修回 2009204208 ] (编辑 　倪 　鹏) ·196·曾瑞红等　丙型肝炎病毒重组联合疫苗的实验研究　第 8 期 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net