d杆菌对温度、制粒工艺及pH值的耐受性

其在对虾饲料中应用的实效 性!为水产饲料的生产应用提供参考’ 9!材料与方法 9<9!试验菌株 实验室分离&筛选的?株有益芽孢杆菌!编号为F:%&F:!&F:"&F:C&F:?!为用普通营养琼 B%第#期!!!!!!李卓佳等$几株有益芽孢杆菌对温度&制粒工艺及PL值的耐受性 脂"$i下培养!C!CD/的斜面纯培养物! 9<=!试验菌剂 由上述?株芽孢杆菌经固体发酵工艺生产而成"粉状"每2含有效活菌数!$Y%$D! 9<@!试验方法 9<@<9!温度对菌株存活的影响试验!挑取!C/的斜面培养物一环"接至装有%$$EM无菌水 的三角锥瓶中摇匀"先吸取$值! 9<@,0<9!!1/F%F,D/,*#(2B&*/,%+&(20,$%DD1&,*-%22#/#+**#)"#/,*1/#(28,*#/,+-*%)# Q 试验菌株 %$$i !E1* ?E1* %$E1* @$i ?E1* !$E1* D$i ?E1* !$E1* C$E1* F:% %$$ D$ "$ @? "? %$$ %$$ %$$ F:! %$$ D$ "$ @? "? %$$ %$$ %$$ F:" %$$ D? "? @? C$ %$$ %$$ %$$ F:C %$$ D? C? %$$ ?$ %$$ %$$ %$$ F:? %$$ @$ ?$ %$$ B$ %$$ %$$ %$$ D% 湛 江 海 洋 大 学 学 报!!!!!!!!!!!!!!!第!"卷 =<=!试验菌剂对硬颗粒饲料生产工艺的耐受能力 将试验菌剂添加在饲料原料粉中混合均匀!经过对虾配合饲料常规生产工艺流程制成颗 粒饲料!检测不同生产阶段饲料"粉#中的芽孢杆菌活菌数$结果发现!经制粒工艺后取样!饲 料中芽孢杆菌活菌数为饲料混合粉的@?Z!损失了?Z%经烘干工艺后取样!饲料中芽孢杆菌 活菌数为饲料混合粉的@"Z!损失了BZ!显示了选用的?株芽孢杆菌对对虾饲料生产条件有 较高的耐受力"图%#$ 水产饲料分粉状料"软颗粒#& 硬颗粒料&膨化料等!硬颗粒饲料 中以对虾饲料生产过程的温度最 高!熟化时间最长!这是益生素在 对虾饲料中应用的主要限制因素$ 莫棣华&沈应然报道!压粒加工可 使%$Z!"$Z的芽孢杆菌孢子损 失!而乳杆菌&酵母在#$!B!i制 粒几乎测不到活细胞’?($刘亚林& 李忠平报道!芽孢杆菌能形成孢子 来承受制粒过程中的压力&温度和 水分的变化!在颗粒温度?!!%$! i的条件下!芽孢杆菌存活力只有 少量损失’#($本试验选用的?株芽孢杆菌经制粒&熟化&烘干工艺流程"制粒温度%$$i!后熟 化温度D$!@$i&熟化时间"$E1*#!检测芽孢杆菌活菌存活@"Z!说明试验菌株能够承受硬 颗粒饲料生产过程中压力&温度和水分的变化!保持较高的存活率和萌发率!显示了作为水产 硬颗粒饲料益生素菌株的优良特性$而且!在饲料生产加工过程中!试验菌株表现出比水浴处 理有更强的耐受温度的能力!这是因为微生物耐受干热的能力比耐受湿热的能力强!也可能与 有饲料粉作为介质相关$ =<@!环境PL值对试验菌株生长的影响 表=!B株试验菌在不同PL值条件下的生长状态 >,0<=!N/(8*?&*,*#&,0(1*B&*/,%+&(20,$%DD1&,*-%22#/#+*"O 培养基PL F:% F:! F:" F:C F:? !值%<$!%值$值$值$<% 试验菌株在不同PL值条 件下的生长状态如表!所示$ 当PL 值为!,0<@!J+-1/,+$#(2B&*/,%+&(20,$%DD1&*(,$%-%*4 培养基PL F:% F:! F:" F:C F:? ! 0.2％，KH<,2>PO<,4> 0.14％，Na<,2>HPO<,4>·12H<,2>O 0.37％，FeSO<,4>·7H<,2>O0.001％，MgSO<,4>·7H<,2>O 0.02％，CaCl<,2> 0.001％，酵母粉 0.05％，pH 7.0，温度50-55℃。确定了该菌株生长的pH、温度和盐度范围：pH 5.5-9.5，温度35-70℃，NaCl浓度0.10﹪；同时确定 了该菌株适宜生长的pH、温度和盐度的范围：pH6.0-9.0，温度40-60℃，NaCl浓度0.5-8﹪。采用高压岩心管，利用高压空气加压，通 过培养实验研究了高压对该菌株生长的影响，结果表明，该菌株能在10MPa高压下生长，但生长延滞期变长。以上实验结果表明，该菌 株的pH、温度和盐度适应范围均较广且耐高压，说明该菌可能的油藏适应范围较广，进一步说明该菌株适宜用于好氧微生物驱油基础 理论研究。 3．以G2菌为例，通过调整模拟油藏环境的营养和配气，研究其在模拟典型实验区块实际油藏环境下的生长状况。 1)通过对非生物因素耗氧实验研究和细菌生长耗氧量的估算，确定了好氧微生物在室内模拟胜利油田孤岛中一区Ng3区块油藏环境 下生长实验的配气量(空气)：在不饱和原油的情况下，配气量维持在常压下液气比1：10；在饱和原油的情况下，配气量维持在常压下 液气比1：30就足以维持好氧微生物在模拟油藏环境下良好生长了。通过对蔗糖和NO<,3><'->等营养物在岩心中的运移实验，确定了在 注入岩心3--4.5PV培养液时，岩心出口营养物的浓度基本达到注入浓度。 2)通过模拟目标油藏的温度、压力、孔隙度、渗透率、流体特征和开发程度等因素，进行了G2菌在模拟油藏环境下的生长实验 ，结果表明，在注入适宜的营养和配气条件下，G2菌能够在模拟Ng3区块油藏环境下良好生长，细菌密度由10<'6>个/mL增加至 10<'8>个/mL，该菌株适宜作为该区块实施微生物采油技术的候选菌种。残余油的存在对G2菌的生长基本没有产生影啊，但在模拟油藏 环境下，该菌生长延滞期较摇瓶培养实验长，说明为特定油藏进行的各种微生物采油技术研究必须在模拟油藏环境下进行。 4．以G2菌为例，系统考察了驱替速度、实验温度、岩心渗透率、微生物菌体大小和聚集度以及油相存在与否等因素对微生物在岩 石毛细孔隙中运移的影响，并探讨了微生物在岩心中运移过程中滞留的主要机制。 1)先用处于生长稳定期的菌液进行连续的岩心驱替，接着用无菌水驱替，在出口取样分析菌体密度，

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整个驱替过程中的压差 变化。驱替实验结果表明：驱替速度、实验温度、岩心渗透率、微生物菌体大小和聚集度以及油相存在与否等因素对微生物在岩心中 运移有重要影响。当驱替速度、实验温度和岩心渗透率升高时，微生物运移效率增加；当微生物菌体大小和聚集度增加时，微生物运 移效率降低；脉冲驱替能够增加微生物在岩心中的运移效率；油相存在能增加细菌的滞留量，降低细菌的运移效率。微生物在岩心中 运移过程中的滞留是筛分、架桥堵塞、界面吸附、粘附和聚集堵塞等作用机制共同作用的结果。当注入微生物浓度较高时，架桥和聚 集堵塞是微生物在岩心中滞留的主要作用机制，微生物更易滞留在岩心入口段，形成外部或内部滤饼，并对该段岩心渗透率伤害较大 。 2)微生物在模拟油藏环境下的生长和运移实验表明，即使在静止培养的条件下，扩散对微生物及其代谢产物的运移影响也很小 ，在连续驱替过程中，微生物运移的动力主要来自于水动力。 本论文的研究成果为建立空气辅助微生物驱油技术室内评价方法(尤其是物理模拟驱油体系方法)和数模软件提供基础。另外，本 论文针对胜利油田孤岛中一区Ng3区块进行研究，研究成果为该区块微生物采油矿场试验设计提供一定的理论基础和技术支撑，对最终 提高现场应用效果具有促进作用。 3.期刊论文 梁俊芳.靳烨 不同温度对生鲜乳中芽孢杆菌生长特性的影响 -中国乳业2007,""(5) 通过平板划线法、菌落形态观察以及革兰氏染色法对生鲜乳中芽孢杆菌进行了分离,先后筛选出8株具有典型特征的芽孢杆菌并鉴 定.对已经鉴定的8株菌,在不同温度条件下进行生物学特性研究,获得了各个菌株的最适生长温度. 4.学位论文 韩永霞 牛乳中芽孢杆菌的动态变化及部分生物学特性的研究 2006 本文主要是基于对乳品生产全程中芽孢杆菌的分析研究，该研究从原料乳及乳品生产几个主要环节的牛乳中分离出42株芽孢杆菌 ，其中有23株高温芽孢杆菌，19株中温芽孢杆菌，并进行了形态学以及生理生化特性的研究。结果发现42株菌在乳制品生产过程中呈 现不同的动态分布，如超高温灭菌可以使所有的中温芽孢杆菌失活，而高温芽孢杆菌中的地衣芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌极耐高温，超 高温灭菌后仍有残留。本试验并以嗜热脂肪芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌为代表菌，研究了温度、pH值、紫外线照射及溶氧量等理化因素 对其营养体生长及芽孢形成的影响。结果表明，蜡样芽孢杆菌的最适生长温度为40℃，100℃湿热处理10min后该菌几乎不能生长 ，pH=6.0时生长最好；而嗜热脂肪芽孢杆菌的最适生长温度为50℃，100℃湿热处理10min后该菌仍然能正常生长，耐酸碱范围较广 ，甚至pH=10.0时也生长良好；紫外线照射后对两株菌都有抑制作用，且照射时间越长营养体生长越缓慢；另外，加入不同的固态介质 后，对两株菌的生长都有促进作用；两株菌在营养体生长越旺盛的情况下，芽孢的形成量也越大。对两株蛋白酶高产菌株产酶条件的 研究结果表明，地衣芽孢杆菌产酶的最适培养温度为50℃、培养时间为48h、培养液pH=9.0，反应温度为60℃；嗜热脂肪芽孢杆菌产酶 的最适培养温度为50℃、培养时间为60h、培养液pH=7.5～8.0，反应温度为70℃，两菌株培养到稳定期后，酶活力也达到最高。 5.期刊论文 田亚红.王丽丽.仪宏.赵紫华.王昂.TIAN Ya-hong.WANG Li-li.YI Hong.ZHAO Zi-hua. WANG Ang 几种芽孢杆菌对温度、氨水和乙醇耐受性的研究 -化学与生物工程2005,22(7) 研究了枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌以及从土样中筛选的6种未知芽孢杆菌对温度、氨水和乙醇的耐受性.结果表明,水悬液中的芽 孢在100℃处理3 min后全部被杀死,土壤颗粒包裹的芽孢则需15 min全部被杀死;从土样中筛选的6种未知芽孢杆菌在25%的氨水、75%的 乙醇中分别浸泡7 d后仍有存活. 6.学位论文 王标诗 超高静压下压致升温及对细菌芽孢致死规律的研究 2008 超高静压处理技术被认为是食品加工与保藏技术中最有潜力和发展前途的非热处理技术之一,在食品的超高静压加工过程中,对食 品物料进行超高静压处理时,由于压缩作功产生热量,使传压介质和食品的温度增加,而不同的传压介质和食品在超高静压处理中的压致 升温值不同,这给准确控制食品的超高静压杀菌(特别是热压协同时)带来很大难度；超高静压对细菌营养体的灭活作用已经被确认,但 人们对超高静压对细菌芽孢灭活效应的认识还很有限,到目前为止的研究表明,超高静压与热处理结合可以有效地增加对细菌芽孢的灭 活作用。 本论文主要采用升级改造的超高静压设备,首先测定了不同传压介质和食品的压致升温规律,再以枯草芽孢杆菌ATCC6633、凝结芽 孢杆菌IFFI 10144和嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC12980为对象菌,对超高静压协同热处理对其致死效应开展了系统的研究,主要研究结果如下 ： 测定了在较小热损失条件下四种传压介质和多种食品的压致升温值,油性传压介质升温较高,脂肪含量高的食品的压致升温值较高 (橄榄油最大达到9.1℃/100MPa),水分含量高的食品的压致升温值较小；在测定油脂、蛋白质和碳水化合物压致升温值的基础上提出了 预测某一食品压致升温值的方法,与实测值比较可知此方法能较好地预测其压致升温值；由热力学第一定律推导出一定压力和温度范围 内某一物料的压致升温值主要取决于其初始温度和压力,即dT=Tap/ρcp dP,并通过经验方程建立了食品压致升温值与压力和初始温度 之间的关系。 超高静压的升压过程对凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的灭活、损伤和诱导发芽都有不同程度的影响：不同的传压介质时 对枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌芽孢的灭活效果影响也不同,在条件相同的情况下,油性传压介质对芽孢的灭活效果显著(P<0.05)高于 水作为传压介质的情况；使用自制的聚四氟乙烯套筒比使用不锈钢套筒对细菌芽孢的致死率有显著(P<0.05)的影响：热压协同处理对 细菌芽孢的灭活效果中既有压力的因素,也有温度的因素,单独的压力对凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌芽孢致死效果的贡献较少,而单纯 的温度(模拟保压过程中的温度)对其灭活的贡献相对较高。研究了凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢灭活的动力学规律,探讨了升 压过程、食品成分等对灭活效果的影响,牛奶、鸡腿菇和卤牛肉对其都有一定的保护作用,其中在卤牛肉中的保护作用最强；并通过线 性、Weibull和Log-logistic三种模型拟合了灭活曲线,Log-logistic模型具有最优的拟合效果,其次是Weibull模型,线性模型最差；相 同条件下嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的抗性更强。 初步利用人工神经网络对超高静压灭活凝结芽孢杆菌芽孢的条件进行优化,经过训练的BP网络具有良好的预测能力,它能够对超高 静压灭活芽孢过程进行优化,最优的灭活条件为：压力550MPa,温度80℃,时间20min,此条件下可使芽孢数下降4.97个数量级,此结果比 正交实验结果提高了0.16个数量级。 经热压处理后的凝结芽孢杆菌芽孢和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢内的蛋白质和核酸泄漏随温度和压力的增加而逐渐增多；凝结芽孢杆 菌芽孢和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢内的核心物质DPA在热压处理下会有不同程度的泄漏,压力温度越高泄漏越严重,而同等条件下,凝结芽 孢杆菌芽孢内DPA的泄漏更多。 扫描电镜观察到凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢经热压处理后表面受到不同程度的破坏,形态结构发生改变,表面大部分出 现褶皱并内缩；而透射电镜观察到热压处理后的芽孢层结构遭到破坏,外壳及包衣甚至出现缺口,核内物质结构发生紊乱,甚至泄漏,核 心出现大的透明区,同等条件下,凝结芽孢杆菌芽孢的情况更为严重。 7.期刊论文 郝秋娟.李树立.陈颖.李崎.HAO Qiujuan.LI Shuli.CHEN ying.LI Qi 温度对淀粉液化芽 孢杆菌5582产蛋白酶的影响 -中国酿造2008,""(6) 为进一步提高淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyioliquefaciens)BS 5582产蛋白酶的水平,对发酵工艺进行优化,采用了分阶段控温 工艺.发现在5 L发酵罐装料系数0.6、接种量6.67%、种龄18 h、通气量1.0 L/(L·min)、搅拌转速500 r/min、起始发酵温度35℃,发 酵27 h(稳定期)后降温至32℃继续发酵至终了,蛋白酶酶活在47.75h达到9838U/mL,比恒温发酵提高101.6%. 8.学位论文 钟秀霞 超高静压结合热杀灭芽孢杆菌芽孢时的热压效应 2006 超高静压用于低酸性食品杀菌时，由于芽孢杆菌的芽孢有很强的耐压性，单独的超高静压(600MPa以下)处理难以使其完全灭活。 将超高静压与其它处理方法结合是解决问

题

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的主要途径，其中超高静压结合热处理是研究的热点之一。介质受压时体积减少会导致其 内能增加、温度升高(压致升温)。由于不同介质具有不同的压缩性，也就具有不同的压致升温值，在升压和保压过程中传压介质和高 压设备以及传压介质和样(食)品之间出现热传递，导致样(食)品在压力处理过程中有一定的温度变化。这样的温度变化将会影响超高 静压结合热处理的效果。本实验以凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的芽孢为对象，把压致升温和热传递考虑进去，研究超高静压结合热 处理对杀灭芽孢的影响。 使用自制的传压套筒(材料为聚四氟乙烯)作为内衬来保持超高静压过程中传压介质和样品的温度，比较不同热损失对杀菌效果的 影响。结果显示，传压介质为癸二酸二辛酯、600MPa、初温48℃处理10min，使用壁厚15mm的套筒比没有使用套筒能获得更高的芽孢致 死率，凝结芽孢杆菌芽孢和枯草芽孢杆菌芽孢(缓冲液中)的致死率均提高了约0.6个数量级。 初温会影响超高静压结合热处理杀灭芽孢的效果。传压介质为水、600MPa、初温在20℃～60℃的范围内处理10min，凝结芽孢杆菌 芽孢的致死率增加缓慢，致死率均低于1个数量级，初温60℃比初温20℃芽孢的致死率提高了约0.5个数量级。同样条件下，初温 60℃时枯草芽孢杆菌芽孢的致死率达到2.41个数量级，比初温20℃时的提高了约2个数量级。传压介质为水、600MPa、初温80℃处理 10min，凝结芽孢杆菌芽孢和枯草芽孢杆菌芽孢的致死率分别达到4.00个数量级和4.32个数量级，以上结果显示：超高静压结合热处理 杀灭芽孢时，初温在某一阈值以上，才能取得明显的杀菌效果。相对而言，凝结芽孢杆菌芽孢的阈值比较高(>60℃)，枯草芽孢杆菌芽 孢的阈值比较低(<60℃)。而且初温达到阈值以上，随温度升高，凝结芽孢杆菌芽孢的致死率提高得比较快。 论文比较了传压介质分别为橄榄油和水的情况。传压介质为橄榄油、600MPa、初温80℃处理10min，凝结芽孢杆菌的芽孢和枯草芽 孢杆菌芽孢致死率分别达到5.10个数量级和6.00个数量级。致死率比水为传压介质时分别高约1.1和1.7个数量级。 为了解压力和温度分别在超高静压结合热处理中各自的贡献。实验中比较了单纯的压力处理和单纯热处理(模拟保压过程中的温度 )。结果在传压介质为水、600MPa、初温20℃下处理10min，凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的芽孢的致死率分别为0.29和0.42数量级 ，单纯的压力处理对凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的芽孢的致死率影响不明显。以加热的橄榄油(10min内温度从103.9℃降到 94.9℃)模拟超高静压结合热处理(传压介质为水，初温为80℃时，600MPa压力处理10min)过程中的温度变化，结果凝结芽孢杆菌和枯 草芽孢杆菌芽孢的致死率分别为1.50和2.00个数量级。表明超高静压结合热处理杀灭芽孢时，热效应起主要的作用。 9.期刊论文 郝秋娟.陈颖.李永仙.李崎.HAO Qiu-juan.CHEN Ying.LI Yong-xian.LI Qi 温度对淀粉 液化芽孢杆菌5582产β-葡聚糖酶的影响 -中国酿造2007,""(3) 为进一步提高淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)BS 5582产β-葡聚糖酶的水平,采用了分阶段控温工艺,在5L发酵罐 ,装料系数0.6,接种量6.67%,种龄18 h,通气量1.0 L/(L·min),搅拌转速500 r/min,起始发酵温度36 ℃,培养27 h(稳定期)后,降温至 32 ℃继续发酵至终了.β-葡聚糖酶酶活在51.75 h达到182.52 U/mL,比恒温发酵提高了28%. 10.会议论文 武玉艳.李汴生.蔡蕊.刘媛.阮征.黄娟 超高压作用过程中压力与温度各自对芽孢杆菌芽 孢的影响的探讨 2009 采用等温终点法模拟高压过程中的传压介质的温度变化测定温度对芽孢灭活的影响，选取邻近芽孢杆菌培养温度的温度作为压力 处理的温度条件测定单纯的压力对芽孢灭活的影响，再选用不同的传压介质在使用保温装置的务件下测定温度和压力联合作用对芽孢 灭活率的影响。结果表明：单纯的力作用对芽孢的灭活率影响很小，在600MPa下处理10min，凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的芽孢的致 死率分别为只有0.29个数量级和0.42个数量级;模拟高压过程中的传压介质的温度变化对芽孢致死率产生的影响表明不同的I传压介质 及其初温对芽孢的灭活率影响很大，传压介质为80℃橄榄油时，600MPa压力处理下处理10 min，凝结芽孢杆菌芽孢的致死率达到4.4个 数量级，枯草芽孢杆菌芽孢芽孢的致死率达到5个数量级。研究压和热对物料的分别作用有利于选择合理的超高压加工工艺参数，保持 食品的良好的风味物质和感官状态。 引证文献(7条) 1.翟兴礼 苏云金芽孢杆菌四个亚种对温度和pH值的耐受性[期刊论文]-商丘师范学院学报 2009(6) 2.林艺远.沈中艳 益生菌及其在养殖业的合理使用[期刊论文]-江西畜牧兽医杂志 2009(1) 3.郝生宏.董晓芳.佟建明.杨荣芳.萨仁娜 不同饲料制粒条件和保存时间对益生菌活力的影响[期刊论 文]-中国畜牧杂志 2009(1) 4.於叶兵.江世贵.林黑着.黄建华.温为庚.周发林 芽孢杆菌对斑节对虾饲料表观消化率的影响[期刊 论文]-中国水产科学 2007(6) 5.罗勇胜.李卓佳.杨莺莺.文国梁 光合细菌与芽孢杆菌协同净化养殖水体的研究[期刊论文]-农业环 境科学学报 2006(z1) 6.罗勇胜.张道波.李卓佳 有益菌与大型藻类净化集约化养殖废水的展望[期刊论文]-海洋湖沼通报 2006(2) 7.刘伟 利用地衣芽孢杆菌发酵生产细胞分裂素[学位论文]硕士 2005 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zjhydxxb200306004.aspx 授权使用：广东省农科院(gdsnky)，授权号：2f6dd188-9312-4d3c-b3a0-9e1e00de3fa2 下载时间：2010年10月29日