47例汉族HIVAIDS患者外周血白细胞线粒体

扩增包括mtDNA 部分编码区和HR1区在内的619bp片段(npl6000． 16569和rip0．50)的引物，序列为：5’．CCACCATAGCA． CCCAAAGCTAAG一3’和5’．ACCAA711’GCAGGAGAGGT． CCCGTG一3，引物由中国科学院上海生物研究 中心合成。Taq聚合酶、dNTPMix、PCR产物纯化试 剂盒等购自大连宝生物有限公司。 1．2方法 1．2．1外周血白细胞mtDNA的提取：抽取EDTA抗 凝静脉血2IIll，离心，吸取血浆和红细胞之间的白细 胞层，使用QIAampDNABloodMini鼬t(德国Qiagen 公司)按照说明书所述步骤提取DNA。 1．2．2线粒体DNAPCR扩增及产物纯化、鉴定：扩 增目的mtDNA片段：反应体系60m：10×PCR反应 缓冲液5m，20ttmol／L的dNTP4肛l，15肛mol／L引物 各1．5m，Teq酶1．5m，提取的外周血白细胞DNA 2肛l，加双蒸水到反应体系为60出。反应条件： 94℃预变性2min；94℃变性1min，560C退火1min， 72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸温度为 72℃2min。PCR产物采用试剂盒回收纯化，用含溴 化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1．2．3 PCR产物测序：以619bpPCR产物核酸片段 为测序模板，测序采用扩增引物片段的上游引物，由 大连宝生物有限公司测读序列。 1．2．4测序数据分析：测出的DNA序列首先在 http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／比对进行序列来源鉴 定。碱基序列变化采用Bioedit软件分析测序数据， 校对参考序列采用剑桥序列基因库>>si 113200490JgbI J01415．2I HUMMTCGHomosapiens mitoehondrion，completegenomeLength=16569，碱基 变异率=变异碱基总数／所测碱基总数×100％。 2结果 2．1线粒体DNAD-LoopHR-1的目的片段PCR 扩增结果 目的核酸片段PCR扩增分析47例中国 汉族HIV／AIDS患者白细胞mtDNAPCR扩增产物均 呈619bp大小的清晰目的片段条带，由含EB的1％ 琼脂糖电泳验证，结果如图1所示。 M代DNAmarker，+为阳性对照，．为阴性对照，I一10分别为 十份样本扩增产物 圈1 目的基因片段tmDNA扩增结果 M：2kbDNAladder；lane1．10：productsof10differentsamples； “+”：positivecontrol；。．”：negativecontrol Fig．1ElectrophoreticresultsofmtDNAHRI byPCR 2．2线粒体DNAD．LoopHR1区的目的片段PCR 产物测序结果 大部分mtDNA产物纯化测序结果， 碱基峰比较清晰。在http：／／www．ncbi．him．nih．gov／ 比对，与人mtDNA同源性98％以上，证实为扩增的 片段是人类mtDNA的HR1区。 2．3 mtDNA非编码HR1区序列变异情况 所测 619bp核酸片段中，在非编码HR1区(核苷酸位点 16024。16383之间)有124个位点发生变化，碱基 平均变化率为0～20．47％(平均5．33％)。主要碱 基变异为C—T和T—C，变异位点和例数(频率)如 下：16093T—C3／47(6．38％)；1611lC—T2147 (4．26％)；161897I_C13／47(27．66％)；16278C—T 2／47(4．26％)；16292C—T1／47(2．13％)；16304T-一 c5／47(10．64％)。图2显示代表性的核苷酸位点变 化及和剑桥序列比对结果。其他碱基变化为G—A、 A—G、A—c、C—A、C—G替换和A缺失，以及插入 突变，根据和www．mitomap．eom的数据库，为单核苷 酸多态性位点。 2．4 HR1区特殊位点分析 既往文献报道认为线 粒体DLoop的16223和16362位点是汉族人特异的 单核苷酸多态性位点，本研究对HIV感染者的这两 个位点进行分析，了解HIV感染对其有无影响。在 第16223核苷酸位点，共36例出现了C—T变异，发 生率为70．97％(36／47)；在第16362核苷酸位点，26 例出现pc改变，发生率为55．32％(26／47)，3例T —G改变，发生率为6．38％(3／47)。 万方数据 主堡壅堕塑堕盎疸壹堂茎查!堂堡!；旦蔓!!鲞星!塑￡!i!堂』堕曼丛!i丛!旦塑坐!!塑!!!!：!!!堕!：j A显示正常mtDNA序列在核苷酸16111位点为c；B显示核苷酸 16111位点突变为T；C显示5例标本(1-5)测序的序列和线粒体 剑桥序列(gi113200490I曲lJ01415．2I)比对结果，图中标出 16189T---C突变和16223C—T多态性位点以及单核苷酸多态 性位点 圈2线粒体HR1区几个位点核苷酸变化位点。 A．ChromatogramsshowingseqIIencewithoutmutationat印16III；B． Chromatogramsshowing叩16111：C+Tmutation；C．Sequence variationsof5 c∞comparedwiththereferencesequence(gi 113200490Igb J01415．2I)．Dotsindicatedidenticalnueleotideto referenceseqIlen∞．AiTow$indicatedmutationatnp16189T啼Cand polymorphismatnp16223C4T Fig．2HR1 Districtmitochondrialnueleotide changesinafewsitessites 3讨论 人类mtDNA是人类细胞中惟一存在于核DNA 以外的遗传物质。其碱基突变将对整个线粒体的功 能产生重要影响。 本研究中发现，HIV／AIDS患者的D‰pHRI 和剑桥序列(西I113200490lgbIj01415．2I)比较，变 化位点124个。既往文献认为16223的C—T改变 和16362位点T—c是汉族的单核苷酸多态性位点， 具有法医学意义，本研究发现在第16223核苷酸位 点，C—T改变发生率为70．97％(36147)，在第16362 (16362)核苷酸位点，26例出现了T—C，发生率为 55．32％(26／47)，3例出现T—G改变，发生率为 6．38％(3／47)。核苷酸位点16272—16383之间碱基 变异。与国内报道的16223(核酸替代由C—T占 74．77％)、16362(T—c占53．15％)位点多态性类 似H’5]，可能HIV感染对此汉族特异性的多态性位 点无显著影响。 本研究FIRI变化率0。20．47％(5．33％)高于 以往报道汉族人变化率(1．28％)¨】，可能与HIV感 染有关。Donato等哺1认为，HIV病毒蛋白、NO及过 氧亚硝酸盐的协同效应，和(或)凋亡因素等因素可 能引起线粒体功能障碍，Casula等"1研究显示，在未 接受抗反转录病毒治疗的HIV抗体血清转化的患 者中，CD8+T细胞内的mtDNA含量在血清转化5年 之后下降。对于慢性男性HIV感染者，mtDNA在活 化的CD8+和CD4+T细胞的含量低于未活化CD8+T 和CD4+T细胞，这些研究结果说明了艾滋病感染会 影响mtDNA含量，特别在免疫活化细胞线粒体DNA 含量降低更加明显。在特定的细胞群中测量mtDNA 含量要比检测含有不同细胞的PBMC的线粒体成分 更加重要。外周血不同细胞成分含量不同，不同细 胞线粒体突变程度不同，进一步分析细胞活化状态， 对不同细胞内分类进行变异位点分析可能得出更有 意义的结果。我们的结果进一步说明了HIV感染 不仅可以引起患者线粒体数量的改变，同时也可能 使其发生质量上的改变。 线粒体能量产生系统在凋亡中具有重要作用， 但是其在凋亡中的确切调控机制还不清楚。HIV感 染使得线粒体发生数量和质量上的改变，这一改变 以及随之发生的能量代谢方面的改变与CD8+和 CD4+T细胞的凋亡是否存在着必然的联系，而线粒 体控制区上的改变是否正是数量改变的原因，这些 都需要大量的工作进一步的证明。我们研究发现的 现象，为进一步研究提供了重要的线索。 4参考文献 [1]WallaceDC．Mitoehondrialdiseas∞inmenandmoll,S．Science， 1999。283：1482．1488． [2]CossarizzaA，MoyleG．Antiretroviralnueleosideandnucleotide 8naloguesandmitochondria．AIDS．2004．18：137-151． [3]CasulaM，Bosboom．Dobbel_aerI，SmoldersK。eta1．hafeefionwith mV．1inducesadecreaseinmtDNA．JInfectDis，2005，191：1468- 1471． 【4]胡义德，贾立明，孙玉兰，等．31例中国汉族人外周血白细胞 线粒体DNA高变I区序列特殊变异分析．第三军医大学学 报，2004，26：1806一1808． [5]顾明波．柳杰，杜庆新，等．中国汉族人群的线粒体DNA控制 区多态性研究．中国法医学杂志，2001，16：6-9． [6]DonatoTandAgostinoP．Pathogenicmechanismsofmitochondrial DNAdepletioninpatientswithHIV-linfection．CIinInfectDis。 2005，40：905．906． [7]CasulaM，VfisekoopN，WitFW，et81．MitoehondrialDNAdecline i11TcellsofHIV．1seroeonvertersmaybedependentonimmune activation．JInfectDis。2007，196：371-376． (收稿日期：2009-02．is) 万方数据