第7章 蛋白质的分离、纯化和表征

nullnull第7章 蛋白质的分离纯化和征null 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大pI通常在 6.0 左右一、蛋白质的两性电离及等电点null 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 二、蛋白质分子的大小null（一）根据化学组成测定最小分子量1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量null（二）SDS－PAGE测定相对分子质量蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状nullnull变性？迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键nullnullnullnull（三）凝胶过滤法测定相对分子质量null凝凝胶法只适于球状蛋白分子测量null三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液null蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质null（二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀： 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 null 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等Ⅱnull1.盐析法 加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性盐溶—盐析盐溶—盐析等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？盐析盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ null2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀null4.重金属盐沉淀 与带负电荷蛋白质结成不溶性盐 5.生物碱试剂和某些酸类沉淀 与带正电荷蛋白质生成不溶性盐 6.加热变性沉淀 天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态null四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料null血液透析小分子被带出透析机透析液加压血液2、密度梯度（区带）离心2、密度梯度（区带）离心null3、凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析3.有机溶剂分级分离法降低介电常数 争夺水化膜 （三)根据电荷不同的分离方法—电泳（三)根据电荷不同的分离方法—电泳原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同null等电聚焦电泳null双向电泳null离子交换层析（四）利用蛋白质选择性吸附的性质（四）利用蛋白质选择性吸附的性质羟磷石灰层析 疏水作用层析（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法亲和色谱颗粒具有极强的专一性null六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 （略）六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 （略）