中药指纹图谱的测定（04年省药分学术会）

null中药指纹图谱的测定 晁若冰 （四川大学华西药学院）中药指纹图谱的测定 晁若冰 （四川大学华西药学院） 一、测定中药指纹图谱的意义 中药指纹图谱的定义: 中药指纹图谱（Fingerprint）是经光谱、色谱或其他方法测定得到的中药组分群的特征图谱，带有综合、宏观、“模糊”的非线性特征，具有完整性和唯一性，是评价中药质量的重要手段之一。 一、测定中药指纹图谱的意义 中药指纹图谱的定义: 中药指纹图谱（Fingerprint）是经光谱、色谱或其他方法测定得到的中药组分群的特征图谱，带有综合、宏观、“模糊”的非线性特征，具有完整性和唯一性，是评价中药质量的重要手段之一。 测定中药指纹图谱的意义： 1. 对保证用药的安全、有效，保证药品质量的稳定具有意义。 2. 有利于中药作用机理的进一步深入研究。 3. 可以促进中药工业现代化，中药农业现代化。 4. 可以促进中药走向世界。 测定中药指纹图谱的意义： 1. 对保证用药的安全、有效，保证药品质量的稳定具有意义。 2. 有利于中药作用机理的进一步深入研究。 3. 可以促进中药工业现代化，中药农业现代化。 4. 可以促进中药走向世界。 二. 检测方法 （一）色谱法 1. 薄层色谱法（TLC） 薄层色谱法分离效能高，操作简便，图像直观、形象，有多种显色剂供选择使用，可以作多样品的平行分析，使用薄层扫描法可以得到定量的薄层指纹图谱。 需使用的和条件，才能得到高质量的、可重复的结果。 薄层色谱法多用于无紫外吸收，不能用HPLC测定的样品，也可以作为HPLC的补充和佐证。 二. 检测方法 （一）色谱法 1. 薄层色谱法（TLC） 薄层色谱法分离效能高，操作简便，图像直观、形象，有多种显色剂供选择使用，可以作多样品的平行分析，使用薄层扫描法可以得到定量的薄层指纹图谱。 需使用标准的材料和条件，才能得到高质量的、可重复的结果。 薄层色谱法多用于无紫外吸收，不能用HPLC测定的样品，也可以作为HPLC的补充和佐证。 二. 检测方法 2. 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，适用范围广，是指纹图谱测定应用最多的方法。 使用的检测器有：紫外检测器，蒸发光散射检测器，示差折光检测器，质谱（LC-MS）等。 多用反相色谱，也可以使用吸附色谱。如组分保留时间的差别很大，可以使用梯度洗脱。 二. 检测方法 2. 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，适用范围广，是指纹图谱测定应用最多的方法。 使用的检测器有：紫外检测器，蒸发光散射检测器，示差折光检测器，质谱（LC-MS）等。 多用反相色谱，也可以使用吸附色谱。如组分保留时间的差别很大，可以使用梯度洗脱。 二. 检测方法 二. 检测方法 3. 气相色谱法 (GC) 气相色谱法分离效能高，重复性好，准确性高，有通用型的检测器。主要用于挥发性样品的测定。二. 检测方法二. 检测方法 4. 毛细管电泳(HPCE) 毛细管电泳分离效能高，灵敏度高，对样品预处理的要求不太高。主要用于带电荷组分的分离，特别是大分子物质的分离，如蛋白质、多肽、核酸等。也可以用于小分子的或一般有机组分的分离。二. 检测方法二. 检测方法 （二）光谱法 1. 紫外分光光度法 是分子的电子光谱，反映生色团的特征吸收，不能反映组分整体的情况。紫外光谱的形状简单，易重叠，鉴别意义不大。 二. 检测方法二. 检测方法 2. 红外光谱法（IR） 是分子的振动−转动光谱，结构的信息量较紫外光谱大，但对多成分的混合物，难以确定归属。 二. 检测方法二. 检测方法 3. 核磁共振光谱(NMR) 核磁共振光谱的专属性强，信息量大，可以定量，是一种有前途的指纹图谱的测定方法。 三. 色谱指纹图谱研究的技术要求 三. 色谱指纹图谱研究的技术要求 （一）供试品的收集 以承认传统的功能主治和长期临床验证结果为前提，使用的标准样品应为经长期临床使用证明是安全、有效的样品。 要收集有代性的供试品，至少10批。（一）供试品的收集（一）供试品的收集 1. 原料药材 应有稳定和固定的来源，要进行基原鉴定，并经检验符合中国药典或国家药品质量标准。 药材的“批”是指相互独立的供试品。应有完整的采样原始记录。（一）供试品的收集（一）供试品的收集 2. 半成品（提取物） 用符合要求的药材为原材料，用规范的工艺生产的半成品。应有完整的制备和相关信息的记录。 （一）供试品的收集（一）供试品的收集 3. 成品 用符合要求的半成品和规范的工艺生产的产品。应有完整的制备和相关信息的记录。null （二）参照物 参照物：是指纹图谱测定用的参照物质。主要用于色谱峰的辨认，考察指纹图谱的稳定程度和重现性。 参照物一般选择容易获得的主要活性成分或指标成分，一个或一个以上。如无参照物也可以用指纹图谱中稳定的色谱峰作为参照峰。 参照物应有明确的化学结构、名称以及质量考察的指标。 （三）测定方法（三）测定方法 1. HPLC 色谱条件的选择：首选反相HPLC。色谱柱：比较不同类型、不同牌号的色谱柱，选出适合的色谱柱，确定色谱柱的来源与规格。应考虑使用多数实验普遍使用的色谱柱。 流动相：至少用三种不同组成的流动相进行比较，选出最适合的流动相。如需要使用梯度洗脱，应尽量采用线性梯度，并报告滞后时间。 （三）测定方法 （三）测定方法 测定波长的选择：既要满足主要有效成分的检测，也要考虑尽可能多地检出药物中的组分。通过比较不同波长的检测结果，选出合适的检测波长。（三）测定方法 （三）测定方法 2. TLC 薄层板：多使用硅胶薄层板，聚酰胺膜薄层板或纤维素薄层板。正式测定时，应使用有质量保证的商品预制板或高效预制板。 展开剂：至少比较三种不同的展开系统，选出最适合的展开系统。注意温度和相对湿度对色谱行为的影响。 （三）测定方法 （三）测定方法 显色：可以结合使用通用型显色剂和专属显色剂，以获得整体的和不同类别组分的图谱。 图象摄影：普通相机或数码相机（200万象素以上），可以用积分软件生成轮廓扫描图和积分数据，也可用薄层扫描仪进行积分和绘制轮廓图谱。 （三）测定方法（三）测定方法 3. GC 色谱柱：最好使用毛细柱，填充柱如能满足要求也可以使用。通过比较不同极性的色谱柱，以确定最适合的色谱柱。 柱温：可使用恒温或程序升温，程序升温宜采用线性程序，尽量避免复杂的多阶程序 其他测定条件：如进样器温度、检测器温度、气体流速等也应确定。 检测器：尽量使用FID。（四）色谱指纹图谱标准的建立 （四）色谱指纹图谱标准的建立 指纹图谱标准的建立包括标准指纹图谱（对照模式）的建立和样品指纹图谱的测定及相似性的判断。（四）色谱指纹图谱标准的建立（四）色谱指纹图谱标准的建立 1. 色谱峰的辨认 以相对保留时间为依据对色谱峰进行辨认，从原料药材出发，找出具有指纹意义的峰进行编号，缺峰缺号。（四）色谱指纹图谱标准的建立（四）色谱指纹图谱标准的建立 2. 相似性的评价的方法： 相似性：指两张指纹图谱之间相似的程度。包括供试品指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似性，供试品指纹图谱之间的相似性 （四）色谱指纹图谱标准的建立（四）色谱指纹图谱标准的建立 相似性包括两个方面： （1）色谱的整体面貌的相似性 峰的数目、各峰峰面积的比例，即总体面貌是否相似。 （2）总积分值的量化比较 供试品与对照样品或对照用指纹图谱总积分面积的差异（量的差异）。 （四）色谱指纹图谱标准的建立（四）色谱指纹图谱标准的建立3. 相似性的判断方法 （1）通过共有峰判断 （2）通过相似度判断 null （1）通过共有峰判断 共有峰：不同样品的指纹图谱中所共有的指纹峰称为共有峰。 重叠率： 重叠率=2×共有峰数 / 供试品与对照样品色谱峰总数 重叠率不得低于一定的限度。 供试品中共有峰与参照峰面积的比值与标准指纹图谱比较，不得超过一定的限度。 供试品中非共有峰的面积占总峰面积的比值，不得超过一定的限度 。 （2）通过相似度判断 （2）通过相似度判断 对照模式的计算：选10批标准样品，测定指纹图谱，计算对照模式。有两种算法： ① 平均矢量 平均矢量＝ 式中X1, X2, … Xn为矢量，代表第1，2 …到第n个样品的指纹图谱。 X1 =（x1,1, x1,2, …x1m） null ② 中位数矢量 中位数矢量＝median(X1j,X2j….Xnj) 中位数矢量是把对应的矢量按大小排列，取处于当中的矢量作为对照模式。如果样品数为奇数时，中位数只有1个；样品数为偶数时，中位数是当中两个数的平均值。 推荐使用平均矢量。null 相似度的计算： 把供试品和对照模式的指纹图谱作为两个矢量，矢量(x1, x2, …, xn)代表样品X的图谱，其中xi代表样品X图谱中第i个色谱峰的峰面积；矢量 (y1, y2 ,…,yn) 代表对照模式Y的图谱，yi代表对照模式图谱中第i个色谱峰的峰面积。可以用下面两种方法表示相似度。null ① 相关系数 相关系数＝ 相关系数越接近于1，两个样品越相似。 null ② 夹角余弦 夹角余弦＝ 夹角余弦是矢量 (x1, x2, …, xn) 和 (y1,y2,…,yn) 在矢量空间夹角的余弦。两张图谱可用多维空间中的两个点来代表，两个样品越相似，则其夹角越小，夹角的余弦值越接近于1；当两个样品等同时，夹角为0，夹角余弦等于1。 若2个样品中分别只有2个色谱峰，则每个样品可以用二维的向量来表示。2个样品可以表示为直角坐标系中的两个点，其夹角为α。 若2个样品中分别只有2个色谱峰，则每个样品可以用二维的向量来表示。2个样品可以表示为直角坐标系中的两个点，其夹角为α。 null α = β–γ 根据差角余弦定理， cos α = cos( β–γ ) = cosβ cosγ + sinβ sinγ = = = 一般相关系数或夹角余玄在0.9－1.0之间，相似度符合要求。 α = β–γ 根据差角余弦定理， cos α = cos( β–γ ) = cosβ cosγ + sinβ sinγ = = = 一般相关系数或夹角余玄在0.9－1.0之间，相似度符合要求。 （六）方法的考察 1．色谱系统适用性试验 一般按参照物计算。包括：柱效，主要色谱峰的分离度。 2．精密度 包括日内精密度，日间精密度，重复性。计算保留时间、相对保留时间和峰面积的RSD值，也可以计算一组测定结果的相似度。 3．耐用性 使用三根不同的色谱柱进行比较。 （六）方法的考察 1．色谱系统适用性试验 一般按参照物计算。包括：柱效，主要色谱峰的分离度。 2．精密度 包括日内精密度，日间精密度，重复性。计算保留时间、相对保留时间和峰面积的RSD值，也可以计算一组测定结果的相似度。 3．耐用性 使用三根不同的色谱柱进行比较。 （七）应用示例 1. 丹参注射液指纹图谱的测定 色谱条件：Luna 5u C18(2)柱，流动相A：水-冰醋酸（100∶0.8）；流动相B:乙腈-冰醋酸（100∶0.8），用梯度洗脱。280nm检测。 （七）应用示例 1. 丹参注射液指纹图谱的测定 色谱条件：Luna 5u C18(2)柱，流动相A：水-冰醋酸（100∶0.8）；流动相B:乙腈-冰醋酸（100∶0.8），用梯度洗脱。280nm检测。 nullnullnullnull（七）应用示例 2. 沙棘指纹图谱的测定 色谱条件：Shim-pack VP-ODS柱，流动相A：乙腈；流动相B：0.4%磷酸水溶液，用梯度洗脱，360nm检测。 （七）应用示例 2. 沙棘指纹图谱的测定 色谱条件：Shim-pack VP-ODS柱，流动相A：乙腈；流动相B：0.4%磷酸水溶液，用梯度洗脱，360nm检测。 nullnull 3. 中药枳壳的化学模式识别 枳壳供试液制备 精密称取不同来源的药材粉末(过4号筛)各2．0g，精密加入甲醇50ml，称定重量，冷浸1h，加热超声20min，静置冷却，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，置旋转蒸发仪回收溶剂，残渣用甲醇溶解，定容至5ml，即得。 3. 中药枳壳的化学模式识别 枳壳供试液制备 精密称取不同来源的药材粉末(过4号筛)各2．0g，精密加入甲醇50ml，称定重量，冷浸1h，加热超声20min，静置冷却，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液25ml，置旋转蒸发仪回收溶剂，残渣用甲醇溶解，定容至5ml，即得。 精密吸取上述枳壳供试液各4μl，分别用自动点样仪成条带状点样于硅胶G60预制板上，在相对湿度65％的调节缸中放置1h，取出，放入双槽展开缸中，以氯仿—甲醇—乙酸(75：25：5)为展开剂，展开，展距约15cm。取出薄层板，晾干，以2％三氯化铝乙醇溶液为显色剂，110℃加热5min，使斑点清晰。 精密吸取上述枳壳供试液各4μl，分别用自动点样仪成条带状点样于硅胶G60预制板上，在相对湿度65％的调节缸中放置1h，取出，放入双槽展开缸中，以氯仿—甲醇—乙酸(75：25：5)为展开剂，展开，展距约15cm。取出薄层板，晾干，以2％三氯化铝乙醇溶液为显色剂，110℃加热5min，使斑点清晰。 将显色后的薄层板置于薄层色谱扫描仪中扫描，光束狭缝：6.00×0.45mm；扫描速度：20mm/s；分辨率：50μm/step；扫描波长：300nm；扫描灯：D2；扫描模式：荧光；滤镜：K400。经过对11批枳壳样品薄层扫描图的分析比较和判断，确定了能体现枳壳药材共性、可对其进行有效鉴别的11个特征峰，这11个特征峰的Rf值分别为0.05、0.11、0.17、0.21、0.28、0.36、0.41、0．88、0.91、0.94、0.97。 将显色后的薄层板置于薄层色谱扫描仪中扫描，光束狭缝：6.00×0.45mm；扫描速度：20mm/s；分辨率：50μm/step；扫描波长：300nm；扫描灯：D2；扫描模式：荧光；滤镜：K400。经过对11批枳壳样品薄层扫描图的分析比较和判断，确定了能体现枳壳药材共性、可对其进行有效鉴别的11个特征峰，这11个特征峰的Rf值分别为0.05、0.11、0.17、0.21、0.28、0.36、0.41、0．88、0.91、0.94、0.97。 nullnull 4. 双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱 实验仪器：日本理学Rigaku D/max—2400粉末x射线衍射仪。实验条件为：Cu Kal辐射，石墨单色器，管压40kV，管流150mA，2θ扫描范围3°~60°，扫描速度8°/min，步长0.02°。 4. 双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱 实验仪器：日本理学Rigaku D/max—2400粉末x射线衍射仪。实验条件为：Cu Kal辐射，石墨单色器，管压40kV，管流150mA，2θ扫描范围3°~60°，扫描速度8°/min，步长0.02°。 nullnull 参 考 文 献 1. 中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术国家药典委员 会，国药典发（2002）第009号 2. 谢培山. 中药制剂色谱指纹图谱鉴别，中成药，2000，22 （6） 3. 黄黠. 丹参药材和丹参指纹图谱的研究，四川大学华西药学 院研究生论文 4. 陈雏. 川西高原产沙棘植物资源及生药学研究，四川大学华 西药学院研究生论文 5. 苏薇薇，等. 中药枳壳的化学模式识别研究，中药材， 2002，25（10） 6. 商素琴，等.双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱鉴定，中草 药，2002，33（11） 参 考 文 献 1. 中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南国家药典委员 会，国药典发（2002）第009号 2. 谢培山. 中药制剂色谱指纹图谱鉴别，中成药，2000，22 （6） 3. 黄黠. 丹参药材和丹参指纹图谱的研究，四川大学华西药学 院研究生论文 4. 陈雏. 川西高原产沙棘植物资源及生药学研究，四川大学华 西药学院研究生论文 5. 苏薇薇，等. 中药枳壳的化学模式识别研究，中药材， 2002，25（10） 6. 商素琴，等.双黄连胶囊的X-射线衍射指纹图谱鉴定，中草 药，2002，33（11）