Ag85B_ESAT6重组腺病毒肺结核疫苗的遗传稳定性

中国生物制品学杂志 2011年 1月第 24卷第 1期 Chin J Biologicals January 2011，Vol. 24 No. 1 结核病（Tuberculosis）是由结核杆菌引起的一种 世界性传染病，也是单一致病菌感染导致病死率最 高的感染性疾病，世界上 1 ／ 3的人口都潜在感染结 核杆菌［1］。据预测，2010年会有 980万新增病例，且 其中的 1 ／ 3会出现在中国和印度［2］。人口流动的增 加、结核杆菌多重耐药性菌株的出现及结核病与艾 滋病的伴发感染给全球结核病的防治带来了新的困 难［3］。而卡介苗仅在儿童中具有一定的保护力［4］，且 长期传代易产生基因丢失，也逐渐失去了在广泛人 群中具有的保护力［5］。因此，研发新型高效的结核 疫苗具有十分重要的现实意义。 预防肺结核的新型疫苗主要有以下 3种：大量 表达保护性抗原的重组卡介苗、删除特定基因的减 毒结核杆菌疫苗以及研究得最广泛的用于 prime- boost免疫策略的亚单位疫苗（包括融合蛋白疫苗、病 毒载体疫苗、DNA疫苗等）［6］。保护性抗原主要集中 在早期分泌抗原 ESAT6、Ag85B、CFP10、TB10. 4、 MPT63和 MPT64 等［7］，其中 RD1基因区的早期分 泌抗原 ESAT6可诱导机体产生强烈的 T细胞免疫 应答，释放高水平的 IFNγ［8］及相对分子质量 30 000 的分枝菌酸转移酶 Ag85B［9］。我们前期构建了重组 腺病毒 rADV-Ag85B-ESAT6，本文通过观察病毒体 外传代后的蛋白表达能力、生长繁殖能力、Ag85B- ESAT6外源插入基因的稳定性及腺病毒特征基因结 构的稳定性，评价重组腺病毒的遗传稳定性。 1. 材料与方法 1. 1 病毒及细胞 重组腺病毒 rADV-Ag85B-ESAT6和 HEK293细 胞均由本中心提供。 作者单位：吉林大学疫苗中心（长春 130012） 通讯作者：姜春来，E-mail：jiangcl＠jlu.edu. cn 中国图分类号 R378. 91+1 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2011）01-0067-04 【预防制品】 Ag85B-ESAT6重组腺病毒肺结核疫苗的遗传稳定性 吴漾 由庆睿 卫巍 姜德华 姜春来 【摘要】 目的 分析 Ag85B-ESAT6重组腺病毒（rADV-Ag85B-ESAT6）肺结核疫苗的遗传稳定性。方法 将纯化的重组腺 病毒 rADV-Ag85B-ESAT6在 HEK293细胞上连续传代 20次，观察细胞病变情况；PCR扩增及序列比对分析重组腺病毒基因的 稳定性；Western blot 分析重组腺病毒 Ag85B-ESAT6 融合蛋白的表达稳定性。结果 重组腺病毒 rADV-Ag85B-ESAT6 引起 HEK293细胞病变的速度和形态均未发生明显变化；第 10代和第 20代重组腺病毒均可扩增出 1 322 bp的外源基因片段和 860 bp的重组腺病毒特征基因 E2b片段，野生型腺病毒引物未扩增出特征条带；Western blot分析表明，第 10代和第 20代重组 腺病毒 rADV-Ag85B-ESAT6 在相对分子质量约 47 000处可见 Ag85B-ESAT6 融合蛋白表达条带。结论 重组腺病毒 rADV- Ag85B-ESAT6在体外传代 20次，表现出良好的基因结构稳定性。 【关键词】 结核，肺；Ag85B；ESAT6；重组腺病毒；遗传稳定性 Genetic Stability of Recombinant Adenovirus Expressing Ag85B-ESAT6 Gene against Tuberculosis WU Yang，YOU Qing-rui，WEI Wei，JIANG De-hua，JIANG Chun-lai（Vaccine Research Center of Jilin Uni－ versity，Changchun 130021，China） 【Abstract】 Objective To analyze the genetic stability of recombinant adenovirus expressing Ag85B-ESAT6 gene against tu－ berculosis． Methods The purified recombinant adenovirus rADV-Ag85B-ESAT6 was subcultured in HEK293 cells continuously for 20 passages，then observed for CPE，and analyzed for genetic stability by PCR amplification and sequencing． The stability of expres－ sion of Ag85B-ESAT6 fusion protein was analyzed by Western blot． Results The speed of CPE as well as morphology of HEK293 cells infected with rADV-Ag85B-ESAT6 after subculture for 20 passages showed no significant change． Both the exogenous gene frag－ ment at a length of 1 322 bp and characteristic adenovirus gene E2b fragment at a length of 860 bp were amplified from rADV- Ag85B-ESAT6 of passages 10 and 20，while no characteristic bands were amplified by using wild type adenovirus primers． The Ag85B-ESAT6 fusion protein bands，each with a relative molecular mass of about 47 000，were observed on the Western blot profiles of rADV-Ag85B-ESAT6 of passages 10 and 20． Conclusion The rADV-Ag85B-ESAT6 showed high genetic stability after subculture for 20 passages. 【Key words】 Tuberculosis，lung；Ag85B；ESAT6；Recombinant adenovirus；Genetic stability 67· · 中国生物制品学杂志 2011年 1月第 24卷第 1期 Chin J Biologicals January 2011，Vol. 24 No. 1 1. 2 主要试剂 DMEM培养基购自 GIBCO公司；胎牛血清购自 天津 TBD公司；病毒基因组抽提试剂盒购自上海生 工生物工程技术服务有限公司；Taq DNA 聚合酶、 dNTP购自 Fermentas公司；ESAT6和 Ag85B多克隆 抗体为本室制备；预染蛋白质 marker 购自 NEB 公 司；1Kb DNA ladder购自 Biolabs公司。 1. 3 重组腺病毒的传代 rADV-Ag85B-ESAT6在 HEK293细胞上连续传 代 20次，收集细胞，反复冻融 3次后，8 000 r ／ min 离心 3 min，取上清感染 HEK293细胞，48 h后，收 获病毒，按 1 ∶ 5的比例继续感染细胞，每次收获病 毒样品时，进行 PCR扩增和Western blot检测，同时 观察病毒在细胞上的生长特性（细胞病变、病变产生 时间等）。 1. 4 重组腺病毒Ag85B-ESAT6基因序列的稳定性 分析 1. 4. 1 目的基因的 PCR 扩增：根据 Ag85B-ESAT6 基因序列设计以下 3组引物：野生型：上游：5′-CCT- GCGAGTGTGGCGGTAAA-3′，下游：5′-CACAAGGG- CGTCTCCAAGTT-3′，扩增产物长度为 1 201 bp；E2b 基因：上游：5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′，下游： 5′-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3′，扩增产物长度为 860 bp；Ag85B-ESAT6 基因：上游：5′-GGGCCCATG- ACAGACGT-3′，下游：5′-TTAATTAATCAAGCGAAC- ATTC-3′，扩增产物长度为 1 322 bp。引物由 Shine Grene公司合成。用病毒基因组抽提试剂盒提取各 代次病毒基因组，操作按试剂盒进行，以其 为，进行 PCR扩增。PCR反应体系：10 × Taq buffer 1. 5 μl，templet 5 μl，上、下游引物各 0. 6 μl， 10 mmol ／ L dNTP 0. 3 μl，ddH2O 6. 3 μl，25 mmol ／ L MgCl2 1. 2 μl，共 15. 5 μl。PCR反应条件：94℃预变 性 5 min；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 80 s，共 30个循环；最后 72℃延伸 5 min。PCR扩增 产物经 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1. 4. 2 基因序列分析：提取重组腺病毒原代次和第 20代次的病毒基因组，操作按病毒基因组抽提试剂 盒说明书进行，扩增后进行胶回收，以外源基因Ag85B- ESAT6设计引物，上游：5′-GGGCCCATGACAGACGT- 3′，下游：5′-TTAATTAATCAAGCGAACATTC-3′，扩增 产物长度为 1 322 bp，送上海生工生物工程技术服务 有限公司测序。 1. 5 重组腺病毒 Ag85B-ESAT6融合蛋白表达的稳 定性分析 采用 Western blot法。收获的病毒样品中加入 RIPA细胞裂解液和 4 × SDS上样 buffer混合，煮沸 10 min，13 200 r ／ min离心 30 min，行 13. 5％ SDS- PAGE后，电转化至硝酸纤维素膜上，3％ PBS牛奶封 闭 1 h；PBST漂洗 3次，每次 5 min，分别加入兔源 ESAT6多克隆抗体（1 ∶ 500稀释）和 Ag85B多克隆抗 体（1 ∶ 500稀释）；室温下用含 1％牛奶的 PBS 漂洗 1 h，PBST漂洗 3次，每次 5 min，加入 AP标记的羊 抗兔 IgG抗体（购自北京鼎国生物技术公司，1 ∶ 1 000 稀释），室温作用 40 min；PBST漂洗 3次，每次 5 min， PBS漂洗 5 min，AP染色液避光染色 10 min，PBS终 止，膜晾干扫描。 2. 结果 2. 1 重组腺病毒在 HEK293细胞上的生长特性 重组腺病毒 rADV-Ag85B-ESAT6 连续传代 20 次，感染 HEK293细胞后，致细胞完全病变的时间稳 定在 48 h，细胞由贴壁的梭形变为圆形颗粒并逐渐 悬浮，且细胞病变状态维持稳定。 2. 2 重组腺病毒 Ag85B-ESAT6基因序列的稳定性 1％琼脂糖凝胶电泳分析显示，阴性和空白对照 未见基因条带出现，表明试剂没有污染，且空细胞无 相关基因干扰；重组腺病毒第 1 ～ 20代次以野生型 引物均未扩增出特征条带，表明无野生型污染，仍以 高纯度重组病毒形式存在，未发生回复重组突变；以 E2b基因引物均扩增出 860 bp的腺病毒特征条带； 以外源基因 Ag85B-ESAT6引物也均扩增出 1 322 bp 的特异基因条带。见图 1。 A：以 E2b基因引物扩增的产物；B：以外源基因 Ag85B- ESAT6引物扩增的产物（1：第 10代次重组腺病毒；2：第 20 代次重组腺病毒；3：HEK293细胞；4：空白对照；M：1kb DNA ladder） 图 1 重组腺病毒的 PCR扩增产物电泳图 Fig 1. Electrophoretic profile of PCR product of rADV- Ag85B-ESAT6 测序及序列比对结果显示，扩增的 Ag85B-ESAT6 bp M 1 2 3 4 10 0028 001 6 001 5 0014 001 3 001 2 000 1 500 1 000 517 BA 1 2 3 4 M bp 10 0028 0016 001 5 0014 001 3 001 2 000 1 500 1 000 517 68· · 中国生物制品学杂志 2011年 1月第 24卷第 1期 Chin J Biologicals January 2011，Vol. 24 No. 1 基因序列与预期一致，证明外源插入基因片段在序 列上未发生突变。 2. 3 重组腺病毒 Ag85B-ESAT6 融合蛋白表达的 稳定性 Western blot分析显示，第 10代和第 20代重组 腺病毒在相对分子质量约 47 000处可见特异的蛋 白表达条带，大小与 Ag85B-ESAT6融合蛋白相符， 而空细胞未见此蛋白条带，见图 2。表明重组腺病毒 经 20次传代后，Ag85B-ESAT6融合蛋白无明显降解 及表达量下降。 A：以 ESAT6多克隆抗体为一抗；B：以 Ag85B多克隆抗 体为一抗；1，5：预染蛋白质 marker；2，6：第 10 代次重组腺 病毒；3，7：第 20代次重组腺病毒；4，8：HEK293 细胞 图 2 重组腺病毒 Ag85B-ESAT6 融合蛋白表达的 Western blot分析 Fig 2. Western blotting of Ag85B-ESAT6 fusion protein expressed in HEK293 cells infected with rADV-Ag85B- ESAT6 3. 讨论 ADV载体疫苗的分子结构具有较好的稳定性， 并可在广谱细胞系中达到较高的扩增滴度。腺病毒 载体是有潜力的转基因载体。有研究发现，滴鼻免 疫 rAd-Ag85A 能在小鼠肺部和脾脏诱导 CD4 ＋和 CD8＋ T细胞免疫反应，且在 MTB攻毒后，滴鼻免疫 rAd-Ag85A显示出比 BCG 更好的保护力［10］。 本室前期研究发现，以高表达 Ag85B 的 rBCG 作为初免（Prime），表达 Ag85B-ESAT6 的重组腺病 毒作为加强（Boost），免疫 BALB ／ c小鼠，在 CTL细 胞毒性杀伤、刺激 T细胞分泌 IFNγ以及 TH1 ／ 2分 型试验中均取得了较好的结果，证明重组腺病毒产 生了较强的细胞免疫和体液免疫应答。 DNA病毒的突变率比 RNA 病毒低，但仍有许 多因素可降低重组病毒的稳定性，如涉及病毒的非 必需区筛选、插入外源片段后病毒基因组的构象、外 源基因表达产物对病毒的影响等。外界环境因素可 能影响野生型病毒重组，且据相关研究报道，重组腺 病毒基因大小如达到野生型的 105％，则其在体外传 代 3 ～ 4代就不稳定，而和野生型基因大小相近或 更小，则易维持稳定［11］。由于重组腺病毒需多次扩 增以达到 cGMP生产所需，因此，重组腺病毒载体疫 苗的遗传稳定性在临床应用上十分关键［12-13］。 本文探讨了重组腺病毒载体疫苗传代后基因 结构的稳定性及外源蛋白的表达情况，结果表明重 组腺病毒经体外传代 20次后，仍具有较好的稳定性， 体外插入的融合基因在 HEK293 细胞中可稳定表 达 Ag85B-ESAT6融合蛋白。无野毒污染可证明未发 生回复性重组突变，同时保证了 Ag85B-ESAT6外源 基因的稳定性和腺病毒特征基因 E2b的存在，证明 重组腺病毒基因遗传稳定性较好；经序列比对，证明 外源片段内部序列正确。 综上所述，该疫苗在体外维持较好的遗传稳定 性，为结核病新型疫苗的研究及重组腺病毒载体基 因工程疫苗的临床应用奠定了基础，也为制定毒种 的传代限定次数提供了参考。而 rADV-Ag85B-ESAT6 载体疫苗在体内传代的稳定性及其临床应用的生物 安全性等尚需进一步研究。 参考文献 ［1］Che n J，Su X，Zhang Y，et al． Novel recombinant RD2-and RD11-encoded Mycobacterium tuberculosis antigens are potential candidates for diagnosis of tuberculosis infections in BCG-vaccinat－ ed individuals［J］． Microbes Infect，2009，11（10-11）：876-885． ［2］Dye C，Williams BG． The population dynamics and control of tu－ berculosis［J］． Science，2010，328（5980）：856-861． ［3］Russell DG，Barry CE 3rd，Flynn JL． Tuberculosis：what we don’t know can，and does，hurt us［J］． Science，2010，328（5980）： 852-856． ［4］Wang D，Xu J，Feng Y，et al． Liposomal oral DNA vaccine（my－ cobacterium DNA） elicits immune response［J］． Vaccine，2010， 28（18）：3134-3142． （下转第 74页） Mr 1 2 3 4 75 000 50 000 25 000 A Mr 5 6 7 8 75 000 50 000 25 000 B 69· · 中国生物制品学杂志 2011年 1月第 24卷第 1期 Chin J Biologicals January 2011，Vol. 24 No. 1 （上接第 69页） ［5］ Jina TH，Tsao E，Goudsmit J，et al． Stabilizing formulations for inhalable powders of an adenovirus 35-vectored tuberculosis（TB） vaccine（AERAS-402）［J］． Vaccine，2010, 28（27）：4369-4375． ［6］Kaufmann SH，Hussey G，Lambert PH． New vaccines for tubercu－ losis［J］． Lancet，2010，375（9731）：2110-2119． ［7］ Parida SK，Kaufmann SH． Novel tuberculosis vaccines on the hori－ zon［J］． Curr Opin Immunol，2010，22（3）：374-384． ［8］ Shi S，Yu L，Sun D，et al． Rational design of multiple TB anti－ gens TB10．4 and TB10．4-Ag85B as subunit vaccine candidates a－ gainst Mycobacterium tuberculosis［J］． Pharm Res，2010，27（2）： 224-234． ［9］Kaufmann SH. 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