胆病从肝论治_在防治胆结石实验研究中的应用

·16· 中 医 药 信 息 lnfiJrrnationOilTra(1i!iorlalChineseMf-f¨ine 2010年第27卷第1期 V01．27，No．1，2010 “胆病从肝论治"在防治胆结石实验 研究中的应用 唐乾利1，黄名威1，俞渊2，赫军2，王清坚2，黄炜1 (1．广西中医学院，广西南宁530001；2．广西中医学院第一附属医院，广西南宁530023) 摘要：目的：以“胆病从肝论治”为原则研究大黄灵仙胶囊防治胆结石的作用机制。方法：使用致石饲 料诱发方法建立豚鼠胆囊结石模型，治疗组造模期间每日予大黄灵仙胶囊(制作成悬液)灌胃治疗，连 续8周。观察比较治疗组和模型组豚鼠胆囊结石形成率，检测各组豚鼠肝脏病理和超微结构变化情况 以及荧光定量PCR检测肝组织胆固醇、胆汁酸代谢相关酶的表达量。结果：模型组和治疗组豚鼠胆囊 结石形成率分别是100％和50％，差异有统计学意义(P<0．01)。治疗组豚鼠肝组织病变较模型组明 显减轻。胆固醇7a一羟化酶、胆汁酸盐输出泵基因表达分别是模型组的2．08倍和2．57倍(P<0．01)。 结论：大黄灵仙胶囊具有较好的防治结石功效，作用机制与其保护肝组织以及在转录水平上调胆固醇、 胆汁酸代谢相关酶的表达有关。“胆病从肝论治”在胆结石防治实验研究中具有重要的指导价值。 关键词：胆结石；胆病从肝论治；胆固醇7a一羟化酶；胆汁酸盐输出泵；超微结构 中图分类号：R657．42 文献标识码：A 文章编号：1002—2406(2010)01一0016—04 ●h-¨◆ntis◆巾●⋯·●Ⅲ-●¨●Ⅲ◆ “◆-“●帅●Ⅲ-◆-¨●Jnll-●IIpI-●InlF●¨ln◆一1It◆Ⅲ-·◆"◆"◆-¨◆“◆-¨’◆●。◆^I-◆”●-¨●¨●n◆-”●nrl◆rq．●-¨◆1．_◆Ⅲ◆lnla◆-"◆⋯◆¨_I◆口。◆-I。◆Ⅷ●·．_ 分为TNF—Ot和TNF—B两种类型，两者氨基酸序列 仅有28％同源性，但两者结合相同的受体，具有抗肿 瘤、免疫调节、抗病毒、致热作用，并可促进炎症反应， 引起恶液质【l，2J。有研究发现，温病湿热证与IlIL浆 ETX水平及血清TNF—d水平密切相关¨’4J。TNF—Ot 为内源性炎性致病因子，温病湿热证中这种冈子水平 显著升高，可促使机体产生炎症反应。本研究提示，病 毒组与肠菌组m清TNF—Ot水平明显增高，这与文献 报道一致。且病毒组比肠菌组有碌著的升高，推测 MHV—A59作为生物致病因子所致的湿热症模型炎 症反应更加剧烈。 4．2温病湿热证与血脂紊乱 有研究表明[5。J，高脂血症与中医的痰湿有十分 密切的关系，其中甘油三酯(TG)、总胆同醇(TC)及低 密度脂蛋白(LDL—C)在痰湿中尤为明显。血脂可为 痰的物质基础之一。 中医学认为，湿邪与痰饮都是津液代谢失调的病 理产物，痰饮的生成与湿邪有较大的关系，湿邪是痰饮 生成的主要来源，而痰湿的产生与脾胃密不可分。有 学者认为旧J，不论是外源性或内源性脂类异常，均是 造成了脾胃运输与转化功能障碍而发病。因此，湿、 基金项目：2006年国家自然科学基金资助项目(30660232) 作者简介：唐乾利(1961一)，男，教授，主ft医师，硕士研究牛导师，广西 名||T医，广西中医学院外科学学科带头人，从事中两医结合 外科I临床、科研及教学工作，主要研究方向：胆石病防治、烧 伤创疡治疗。 收稿日期：2009—09—12 修回日期：20139—10—16 痰、血脂这三者有着密切的关系，i者与脾胃损伤密切 相关，在某一阶段可能是同源异流，不能截然分开，将 血脂作为湿邪的代谢产物之一，或者作为湿邪的客观 之一是有理论和实验依据的。本研究结果显示， 两种模型小鼠m清TG水平的升高，与前期的研究一 致一]。因此，两种温病湿热证动物模型存在着脾胃损 伤，导致脾之运化水湿功能失司，湿聚成痰，而造成血 脂升高。两种模型小鼠的TG水平变化无差别，提示 了模型在本阶段，“内湿”的形成可能主要与肥甘饮 食、湿热外环境有关，与生物致病网子的关系相对较 小，因为，温病湿热证的典型发病特点是先有“太阴内 伤，湿饮停聚”，这样造成了“内湿”形成，血脂升高，才 有“客邪外至”，即生物致病凶子感染。 参考文献： 【1] 龚力菲．医学免疫学[M]．北京：科学出版社，2000：78，81，83， 155．248． [2]曾常茜，张逢春．医学免疫学[M]．北京：人民军医出版社，2005： 83—84． [3]熊宁宁，徐长照．家兔肾炎湿热证模型的实验研究【J]．辽宁中医 杂志，1991，18(4)：42． [4]周燕萍，高清华，李华锋，等．3种温病治法对温病湿热证模型血 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gall—stonemodelsofguineapigswereinducedbybeingfedwithlithogenicdiet，atthesametime，thetreatedgroup werefedwithlavageofDahuanglingxianCapsules(madeintosuspensionfluid)onceperday．Gall—stonesformation ratioofthemodelgroupandthetreatedgroupwerestatistlled8weekslater．Theroutinepathologyandultrastruetureof liverweredetected．Genesexpressionsofcholesterolandbileacidmetabolismrelatedenzymeswerequantitativelyana— lyzedbyrealtimePCR．Results：Gallstonesformationratioofthemodelgroupandthetreatedgroupwere100％and 50％respectively．Gallstonesformationratioofthetreatedgroupwassignificantlydecreasedcomparedwiththemodel group(P<0．O1)．Liverroutinepathologyanduhrastructureofthetreatedgroupwereobviousbetterthanthatofthe modelgroup．TheCYP7AlmRNAandBSEPmRNAexpressionsofthetreatedgroupwere2．08timesand2．57timesof thoseofthemodelgrouprespectively(P<0．01)．Conclusions：DahuanglingxianCapsuleshaveagoodeffectonpre- ventinggallstonesformation，themechanismofwhichwasassociatedwithitsliverprotectionandup—regulationofthe expressionsofcholesterolandtherelatedenzymesofbileacidmetabolismonthetranscriptionlevel．Theprincipleof “biliarydiseasestreatedbydifferentiatingsyndromesoftheliver”embodiesthevalueofguidanceintheexperimentalre— searchonpreventionandtreatmentofgallstones． Keywords：gall—stone；biliarydiseasestreatedbydifferentiatingsyndromesoftheliver；cholesterol7alpha—hydrolase (CYPTAI)；bilesaltexportpump(BSEP)；uhrastructure 中医学认为，胆与肝相连，附于肝之短叶间，肝胆 有经脉互为络属，构成表里关系，胆汁来源于肝之余 气，胆汁所以能正常排泄和发挥作用，亦依靠肝的疏泄 功能。故认为胆病多源于肝，主张“胆病从肝论治”。 虽然胆结石的形成机制未完全阐明，但是现代医学同 样认为，肝细胞产生病理性胆汁是胆结石形成的基本 要素⋯。因此，“月日病从肝论治”符合胆石病的治疗原 则。本文即应用这一原则来指导研究大黄灵仙胶囊保 护实验豚鼠肝组织和调节肝组织胆固醇、胆汁酸代谢 相关酶表达的作用，以了解其防治胆结石的作用机制， 同时为“胆病从肝论治”的应用提供理论依据。 1与方法 1．1材料普通豚鼠(广西医科大学实验动物中心 提供，证号：SCXK桂2003—0003)；大黄灵仙胶囊 (广西中医学院第一附属医院中心药房提供，医院内 制剂，桂药监注[2002]175号)；组织总RNA抽提试剂 盒、柱式胶回收试剂盒(购自BIOBASICINC公司)； 逆转录试剂盒、荧光定量PCRMix(购自大连宝生物t 程有限公司)；其他试剂均购自上海生工生物工程技 术服务有限公司。 1．2方法 1．2．1 造模和给药普通健康豚鼠60只，2509左 右，雌雄不拘，随机分为模型组20只、大黄灵仙胶囊治 疗组20只、正常对照组20只。模型组和治疗组参照 文献方法【21给予致石饲料喂养，正常对照组予常规饲 料喂养。各组动物饲养期间适量补充青饲料。造模开 始后大黄灵仙胶囊治疗组每日予大黄灵仙胶囊(制作 成悬液)按参考剂量∞’41灌胃1次，模型组和正常对照 组以等体积生理盐水灌胃对照。造模及治疗时间总共 8周。 1．2．2标本采集方法采集标本前禁饮食12h。以 水合氯醛腹腔注射麻醉后剖腹，观察肝脏、胆囊大体病 理，记录胆囊结石性状并计算成石率。剪开膈肌进入 胸腔，心脏穿刺抽血作生化(胆同醇、胆汁酸、胆红素) 检测。迅速切取芝麻大小的肝组织投入装有预冷的 2％戊二醛的小瓶中送电镜室制作切片观察，而后每只 动物在相同部位切取约50mg的新鲜肝组织提取总 RNA，同时适量备份肝组织液氮保存。 1．2．3豚鼠肝组织病理及超微结构的检测 各组豚 鼠肝组织常规病理切片检查，同时利用透射电镜检测 肝组织超微结构的改变情况。 万方数据 ·18· 中 医 药 信 息 lnfi)rmationonTradilionalChineseMlll|i(．ine 2010年第27卷第1期 V01．27．No．1。2010 1．2．4豚鼠肝组织胆同醇、胆汁酸代谢相关酶的表达 检测 根据课组研究获得的豚鼠胆同醇7a一羟化酶 (Cholesterol7alpha—hydrolase，CYP7A1)和胆汁酸盐 输出泵(bilesaltexportpump，BSEP)基因cDNA序列 (Genbank登陆号分别为GQ507494、GQl69125)以及 内参基冈B—actin序列分别设计荧光定量PCR引物 (CYP7A1基因扩增上游引物5TGGAGAAGGCAG GTCAA3，'下游引物5℃CATTACTGTAGAAGGTG GTC3，，产物330bp；BSEP基因扩增上游引物5qq'C TATGATCCCGACGAA37，下游引物5CGGCTGCTA TGACACrITrl3，产物190bp；内参基因扩增上游引物5 7AGCGTGGCTACACTTTCA3，．下游引物5GTYGGC ATAGAGGTCC1TAC3，’产物305bp)，定量检测两组 豚鼠肝组织CYP7AI和BSEP基冈的表达。 1．2．5血清胆同醇、胆汁酸和胆红素检测采用全自 动生化检测仪检测。 1．2．6统计方法采用SPSS13．0统汁分析软件处 理，计量数据以均数±标准差(面±s)表示，组问两两比 较用￡检验。 2结果 2．1 胆囊结石形成情况 结石形成的判定以胆囊内有肉眼可见的泥沙或团 块状结石为准。结果模型组豚鼠结石形成率达剑 100％(20／20)，而大黄灵仙胶囊治疗组则为50％(10／ 20)。经卡方检验结石形成率差异有统计学意义(P< 0．01)。所有模型动物的胆囊结石均为松软的团块或 泥沙样，黄绿色或黑褐色(图2一B)，经红外光谱分析 为胆红素盐类色素型结石。而从结石形成的大小及质 量分析，模型组结右量大且几乎为团块状，而大黄灵仙 胶囊治疗组动物的结石均为泥沙样，结石形成量少 (图2一C)。 图1 各组豚鼠胆囊及结石 图解：图1中为各组动物新鲜胆囊标本照片。其 中A为正常胆囊，胆囊壁薄，胆汁清澈透亮，胆囊内未 见结石影；B为模型组胆囊，可见胆囊壁增厚，内有团 块状结石形成；C为大黄灵仙胶囊治疗组胆囊，胆囊壁 增厚，可见少量泥沙样结石。 2．2各组豚鼠肝脏常规病理及超微构变化的比较 常规病理切片显示模型组豚鼠肝组织普遍存在脂 肪变、局灶坏死及早期纤维化改变，而大黄灵仙胶囊治 疗组豚鼠肝组织主要表现为肿胀及脂肪变。透射电镜 检测则显示，模型组和大黄灵仙胶囊治疗组豚鼠肝组 织超微结构均有不同程度改变，主要表现为细胞水肿， 核膜不规则，核旁细胞器减少，线粒体肿胀，脊模糊不 清，内质网扩张，毛细胆管扩张，腔内绒毛脱落减少甚 至消失。但从改变的程度分析，大黄灵仙胶囊治疗组 肝组织仍然保持较好的超微结构，明显优于模型组 (图2)，说明大黄炙仙胶囊具有较好的保护肝组织的 作用，与笔者较前观察的病理情况一致|3J。 图2各组豚鼠肝组织超微结构 图解：图A为正常肝组织，核圆，核膜完整规则，核仁清晰，线粒体丰富，脊清晰可见。图B为治疗组肝组织，核膜 完整，线粒体肿胀，呈双层膜改变，但脊仍可见，内质网扩张，为早期水肿改变。图C为模型组肝组织，核膜不规 则(未显示)，核旁细胞器明显减少，线粒体萎缩，结构不清晰，可见大量糖原颗粒。 2．3豚鼠肝组织胆同醇、胆汁酸代谢褶关酶的表达及 血清胆固醇、胆汁酸和总胆红素检测结果 CYP7A1基因是胆同醇代谢的关键酶，而BSEP基 因与胆汁酸盐的分泌关系密切‘5|，二者的功能缺陷都 可能影响胆固醇、胆汁酸的代谢而直接影响胆结石形 成。经过大黄灵仙胶囊治疗后豚鼠肝组织 万方数据 2010年第27卷第1期 V01．27．No．1．2010 中 医 药 信 息 InfomlationonTraditinnalChineseMedit·ine ·19· CYP7A1mRNA和BSEPmRNA表达量均明显上调，表 达量分别是模型组的2．08倍和2．57倍，差异均有统 计学意义(P<0．01)。本文在检测基冈表达的同时检 测各组豚鼠血清中的总胆同醇、胆汁酸以及胆红素含 量(见表1)。结果显示，模型组和治疗组豚鼠血清中 总胆固醇含量上升，而胆汁酸含量下降，与正常组比较 差异均有统计学意义(P<0．01)。而治疗组豚鼠血清 中的总胆固醇含量比模型组低，胆汁酸含量比模型组 高，差异非常显著(P<0．01)。血清总胆红素的含量 从低到高的组别为正常组、治疗组和模型组，各组问比 较差异均有统计学意义(P<0．01)。血清胆红素的变 化可能与各组豚鼠肝组织的损伤程度有关，同时与结 石的成分相关。 表l各组豚鼠血清胆固醇、胆汁酸检及总胆红素检测结果(元±s) 注：模型组和正常组总胆汁酸比较，“P<0．01；治疗组和正常组 总胆汁酸比较，△△P<0．OI；模型组、治疗组和正常组总胆红素比 较；一P<0．Ol。 3讨论 “胆病从肝论治”是治疗胆道疾病的基本原则之 一，内涵丰富，有充分的理论依据和广泛的I临床基 础阳J。大黄灵仙胶囊为广西名中医唐乾利教授治疗 胆石病的有效经验方，方中生大黄、芒硝攻下导滞、利 胆排石；金钱草、郁金、柴胡、枳壳、泽兰相伍，既有清热 利湿之功，又有理气祛痰之效；鸡内金、金钱草、威炙仙 为排石佳品；威灵仙、磁石为经验用药；黄芪、甘草意在 益气补虚，保护胃气。诸药合用共奏疏肝利胆，攻下排 石的功效【7J。本文即应用“胆病从肝论治”原则来指 导研究大黄灵仙胶囊保护实验豚鼠肝组织和调节肝组 织胆同醇、胆汁酸代谢相关酶表达的作用以了解其防 治胆结石的作用机制。研究结果显示，大黄灵仙胶囊 能湿著降低豚鼠胆囊结石的发牛率，治疗组豚鼠肝组 织病理改变和超微结构的变化明显较模型组轻，属于 早期口f逆性的水肿性病变。笔者认为，在致石饲料 (高脂高纤维素低蛋白)的持续作用下，肝细胞的代谢 出现紊乱，甚至出现肝细胞的变性坏死㈦’91，而肝细胞 的损伤直接导致胆固醇、胆汁酸代谢相关的酶受到影 响【10|，最终产生病理性胆汁而导致结石生成。本文的 研究表明，治疗组豚鼠总胆同醇含量较模型组低，而胆 汁酸含量则高于模型组，差异有统计学意义(P< 0．01)。在基因转录水平，模型组豚鼠肝组织的 CYP7A1和BSEP基因表达均显著F调，而治疗组豚鼠 肝组织CYP7A1mRNA和BSEPmRNA表达水平分别是 模型组的2．08倍和2．57倍，这说明大黄灵仙胶囊具 有在病理状态下上调豚鼠肝组织CYP7AImRNA和 BSEPmRNA表达的作用。 综七所述，中药制剂大黄灵仙胶囊防治胆结石的 实验研究表明，“胆病从肝论治”符合胆结石的防治原 则，治疗胆石病的关键在于，不仅要清除胆石“异物” 本身，更要恢复肝胆系统的正常生理功能，防止病理性 胆汁的产生。只有正本清源，才有叮能防止胆结石的 复发和再生，从根本上治愈胆石病。因此，“胆病从肝 论治”的原则应该贯彻到胆结石防治的全过程。虽然 彻底防止、逆转胆汁的成石性还很困难，但许多中药能 在多方面、多层次作用于肝细胞，有望从病理性胆汁形 成这一中心环节治愈胆石病⋯J，值得进一步深入 研究。 参考文献： [I]韩天权，蒋兆彦，张吊道．胆同醇结石形成机制的基因研究现状与 展望[J]．外科理论与实践，2009．14(2)：125—127． [2]邹移海．中医实验动物学[M]．第1版．暨南：暨南大学}l{版社， 1999：131． [3]黄名威，唐乾利，伍松合，等．胆通胶囊预防色素性结石形成的机 制研究[J]．中国中西医结合消化杂志．2005。13(4)：248—250． [4]徐叔云．I临床药理学[M]．第2版．北京：人民卫生出版社，2001： 207． [5]StiegerB，MeierY，MeierPJ．Thebilesaltexportpump[J]．Pflugers Arch，2007，453(5)：611—620． [6]朱堵庭．胆石病“从肝论治”要点[J]．上海中医药大学学报， 2007．2I(6)：1—3． [7]唐乾利，刘袒军。伍松合，等．大黄灵仙胶囊降低胆石症术后残石 率及复发率疗效观察[J]．新中医，2002，34(6)：17一19． [8]黄名威，唐乾利，赫军，等．慢性肝损伤与胆结石形成相关性研究 [J]．广西医科大学学报．2008，25(6)：876—878． [9]檀桥．三金排石汤治疗胆结白．症102例I临床观察[J]．中医药学 报，2008．36(2)：63． 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