蛋白质组学基本原理

nullnull第一讲：蛋白质组学基本原理null第一章 绪论null15 February 2001null一、蛋白质组研究的开端及蛋白质组含义 --2001年，人类基因组序列草图的完成，宣告了 “后基因组时代”的到来，其主体是功能基因组学 （functional genomics),而蛋白质是基因功能的执行体； 2. 人类基因组的完成并不表明人类基因组的所有基因 及间隔序列已完全确定； 3. 基因组计划即使已确定某生物基因组内的全部基因， 也不能确定哪些基因在何时、何地、以何种程度表达； 4. 生物的基因组只表达部分基因(30~80%)，表达的基因 类型及其表达程度随生物生存环境及内在状态的变化 而表现极大的差别；null5. 基因虽是遗传信息的源头,而蛋白质是基因功能的执行体； 6. 以往的蛋白质研究只是针对生命活动中某一种或某几种 蛋白质，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制； 因此， 无论是从基因组计划的局限、还是蛋白质研究的 自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质研究均是 势在必行。nullProteome : Protein +Genome （蛋白质组） Genome: 一个细胞或一个生物体包含的所有遗传信息； Proteome：一种细胞/组织/生物体某个时间段所包含的 所有蛋白质的存在形式及其活动方式。 蛋白质组及蛋白质组学的含义 null Proteomics（蛋白质组学）： 研究蛋白质组的科学， 阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式, 其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞 内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能 网络。 null 基因微阵列（microarray)提供了细胞中大量或全部基因表达的快速检测手段，然而从mRNA水平不一定能预测细胞中相应蛋白质的水平。因为： 各种mRNA不同的稳定性和不同的翻译效率 能够影响新蛋白质的产生； 二、研究mRNA作为基因产物null2. 蛋白质形成后在稳定性和转换速度上有很大不同，许多参与信号转导、转录因子调节和细胞周期控制的蛋白质迅速转换，这是其活性调节的一种方式； 3. mRNA水平没有告诉我们相应蛋白质的调节状态，蛋白质的活性和功能常有一些内源翻译后的改变，也会因环境因素而改变。三、蛋白质组学研究的内容三、蛋白质组学研究的内容① 结构蛋白质组学： 主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、 种类、数量确定等；蛋白质结构测定主要是 应用X-光衍射技术，蛋白质种类和数量测定主要是 应用双向电泳，蛋白质鉴定的手段是质谱法； null② 功能蛋白质组学： 研究蛋白质的功能， 确定蛋白质在亚细胞结构中的定位， 蛋白质-蛋白质的相互作用等。 蛋白质组学比较注重研究蛋白质类型与数量在 不同种类、不同时间和条件下的动态本质。四、蛋白质组学对分析的挑战四、蛋白质组学对分析的挑战 用DNA微阵列和相关方法分析基因表达依赖于两个重要工具：PCR和寡核苷酸与互补序列的杂交。但是没有类似的工具用于蛋白质分析。 1）没有PCR等价物。目前不可能有多肽分子以类似于核苷酸通过PCR复制的方式复制。 null 第二，蛋白质不能专一地与互补氨基酸序列杂交。 第三，细胞中每一个蛋白质产物并不一定只有一种分子实体。 因此，蛋白质组的分析需要一套不同于基因表达分析的工具，能够对修饰和非修饰的蛋白质进行检测和定量分析。五、蛋白质组学的工具五、蛋白质组学的工具 四种重要工具的发展和结合使用给我们提供了灵敏性和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。 1）数据库：蛋白质、EST（expressed sequence tags)、和基因组序列数据库共同提供了生物表达全部蛋白质的完整数据库目录。 2）质谱（MS）：目前认为MS是肽序列分析中的最新技术。MS数据为蛋白质鉴定提供了最有力和最精确的方法。 null 3）对数据库中特定蛋白质序列与MS数据进行比对的各种软件。 4）蛋白质的分析分离技术，2D-SDS-PAGE是最广泛用于蛋白质组学的技术，蛋白质分辨率达到成千上万种，完全可以用于组织与细胞中的大规模蛋白质分离。 null EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签 EST(expressedsequencetags)是cDNA克隆的末端序列,平均长度为300～500bp,称为表达序列标签,通常是从已有的cDNA文库中随机取出几百到几千个克隆一次测序产生,一般使用载体多克隆位点互补序列作为通用引物。一个EST代表生物体某种组织在某一时期的一个表达基因 。采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。 nullThe identification of ESTs has proceeded rapidly, with approximately 52 million ESTs now available in public databases (e.g. GenBank 5/2008, all species) 六、蛋白质组学的应用范围 六、蛋白质组学的应用范围 根据目前的实践，蛋白质组学包括三项主要应用： 1）蛋白质表达谱： 蛋白质表达谱是鉴定生物或细胞特定状态下蛋白质的表达或药物、化学或物理刺激下蛋白质的表达，获得蛋白质组图、蛋白质组成成分鉴定、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示。null2）蛋白质修饰谱：蛋白质修饰谱是鉴定蛋白质在何处、怎样被修饰的。许多蛋白质翻译后的修饰控制着蛋白质的靶向、结构、功能和转换。此外，许多环境化学因素、药物、和内源化学因素可产生修饰蛋白质的活性亲电体。 3）蛋白质网络谱： 蛋白质网络谱是在生物系统中测定蛋白质之间相互作用的蛋白质组学方法。这些相互作用决定蛋白质功能网络。null获 得： 阐释重要生命活动的分子机制，包括细胞周期、细胞分化与发育、细胞凋亡、肿瘤发生与发展、环境反应与调节，物种进化等。 医药靶分子寻找与分析，包括新型药物靶分子、 肿瘤恶性、人体病理介导分子、病原菌毒性成分等。每种疾病与~10个基因相关；每个基因又与 3~10个蛋白质相关；人类主要的100~150种疾病，则应该有3000~15000种蛋白质具有成为药靶的可能性。 因此，可能有几千或上万种新的药物靶标将被发现，将是 功能基因组学有可能带来一笔巨大的科学和经济财富。null 第二章 蛋白质组学的基本研究方法 Outline 一、概述 二、蛋白质的提取与样品制备 三、蛋白质的分离与二维电泳技术 四、蛋白质的检测技术 五、生物质谱技术与蛋白质的鉴定 六、蛋白质构象解析技术Outline 一、概述 二、蛋白质的提取与样品制备 三、蛋白质的分离与二维电泳技术 四、蛋白质的检测技术 五、生物质谱技术与蛋白质的鉴定 六、蛋白质构象解析技术1、蛋白质组学研究远比基因组学研究复杂 （1）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量 如人的基因组有3-5万个基因而蛋白质则有30-100万； （2）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的； （3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大 （最多105） （4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩增和自动测序技术 1、蛋白质组学研究远比基因组学研究复杂 （1）一个生物对象的蛋白质数量远大于基因数量 如人的基因组有3-5万个基因而蛋白质则有30-100万； （2）基因组的组成是固定的，蛋白质组组成是动态的； （3）细胞内蛋白质的拷贝数（108）远比基因拷贝数大 （最多105） （4）基因可采用PCR扩增和自动测序，而蛋白质还没有扩增和自动测序技术 null2、蛋白质组学研究技术进展 （1）1975年，2-DE技术建立,上世纪80年代，固相化pH梯度凝胶问世，使2-DE的重复性和加样量改善； （2）上世纪末期，MALDI-TOF-MS和ESI-MS可精确测定相对分子量和微量蛋白质的测定； （3）快速多肽序列分析； （4）90年代,多图象分析与大规模数据处理软件问世，复杂蛋白质图谱处理成为现实； nullMALDI-TOF MS: matrix assisted laser desorption ionization-time of flight Mass Spectrometry; ESI/MS/MS: electrospray ionization3、蛋白质组分析的首要要求3、蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测、分析 ； 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。null生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得null4.蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定二、蛋白质的提取与样品制备二、蛋白质的提取与样品制备二维电泳分析中的样品制备二维电泳分析中的样品制备制备原则： 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰因素。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白质，从而保证待研究蛋白质的可检测性。null 样品制备原则 1、尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质的损失。 （1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白质； （2）不同类型的蛋白质需要不同的方法； （3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法； 2、细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，从特殊亚细胞器提取蛋白还需分级分离。null3、样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80°C， 不要反复冻融样品； 4、通过超速离心清除所有的杂质，主要去除盐、小 分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、 脂类、酚类等 5、加入尿素之后，加温不要超过37°C，以防蛋白 质氨甲酰化。 null（一）细胞裂解的方法null1、温和裂解的方法： 适用于组成比较简单的样品或分析特定的细胞器 （1）渗透裂解：通常用于血细胞、组织培养细胞等 低渗溶液细胞； （2）冻融裂解：液氮快速冻融，然后在37°C融化, 反复几次,适合于细菌、组织培养细胞； （3）去污剂裂解：溶解细胞膜释放内含蛋白质，主 要针对组织培养细胞； （4）酶裂解：在等渗溶液中用酶去细胞壁，常用的 酶有溶菌酶(细菌)、纤维素酶 + 果胶酶(植物)、 溶细胞酶（酵母）。null2、剧烈的细胞裂解方法 主要针对难破碎的细胞、酵母细胞和细胞亚组织 （1）超声裂解法：利用超声波产生的切应力破碎细胞， 但要注意产生热量和气泡； （2）研磨法:加液氮和沙进行研磨，适合于固体组织和 微生物细胞； （3）机械匀浆法：破碎固体软组织和动物组织（切成小 片），同时要加入预冷的匀浆溶液； （4）玻璃珠匀浆法：适用细胞悬液或微生物，目的在于 破碎细胞，提取内含蛋白质。null3、蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解 防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH>9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物） （1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。 （2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。 （3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1mM，作用对象为金属蛋白酶。 4、蛋白质沉淀步骤 （1）硫酸铵盐析 原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离； 步骤：蛋白质浓度>1mg/ml，缓冲溶液浓度>50mM(含EDTA),缓慢加入(NH4)2SO4,搅拌10-30min，离心分离。 注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)2SO4会干扰IEF （2）TCA沉淀 三氯乙酸（终浓度10-20%）加到提取液中混均，置冰上30min，最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除TCA。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。 4、蛋白质沉淀步骤 （1）硫酸铵盐析 原理：高盐将蛋白质沉淀出来，从而与核酸分离； 步骤：蛋白质浓度>1mg/ml，缓冲溶液浓度>50mM(含EDTA),缓慢加入(NH4)2SO4,搅拌10-30min，离心分离。 注意点：只用作预分离和富集，且(NH4)2SO4会干扰IEF （2）TCA沉淀 三氯乙酸（终浓度10-20%）加到提取液中混均，置冰上30min，最后用丙酮或乙醇清洗沉淀除TCA。该法不易造成蛋白质变性和化学修饰。 null（3）丙酮沉淀 提取物加入3倍体积的冰丙酮，-20℃沉淀2小时， 离心空气干燥去丙酮。 （4）丙酮/TCA沉淀 用丙酮在10%的TCA中重悬样品溶液（含有0.01的 ß-巯基乙醇或20mmol/L),-20℃沉淀45min,离心 分离,丙酮清洗沉淀,空气干燥。 （5）苯酚提取 蛋白质提取到饱和酚中，加到甲醇溶液中NH4CA沉淀， 然后先用NH4CA洗涤，再用丙酮洗涤，空气干燥去丙酮。 本法适合于高杂质的植物样品。 5、清除影响二维电泳图谱的杂质 （1）盐、残留的缓冲液和电性小分子 盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。 （2）内源性小分子 这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。 （3）离子去污剂 SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液可除去。 5、清除影响二维电泳图谱的杂质 （1）盐、残留的缓冲液和电性小分子 盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。 （2）内源性小分子 这些物质通常带负电，使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。 （3）离子去污剂 SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液可除去。 （4）核酸 核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银染时出现高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMgCl2)冰上孵育,但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。 （5）多糖 多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可用(NH4)2SO4或苯酚- NH4CA沉淀后离心，或用超速离心去多糖。 （4）核酸 核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银染时出现高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 1mg/ml RNAase+50mmolMgCl2)冰上孵育,但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。 （5）多糖 多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物，可用(NH4)2SO4或苯酚- NH4CA沉淀后离心，或用超速离心去多糖。 null（6）脂类 脂类易和膜蛋白结合成复合物，改变蛋白溶解性、 等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。 （7）酚类 通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质， 可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。 6、裂解液的组成 目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样 品的完全溶解和变性 组成：尿素+去污剂+（有时）还原剂 原理： （1）尿素能溶解和解折叠蛋白，最低作用浓度为8M，硫脲可增加膜蛋白质的溶解 （2）去污剂防止疏水相互作用蛋白质聚合，常用的去污剂有NP-40、Triton-X100，同时加4%CHAPS或0.25%SDS效果更好。 6、裂解液的组成 null（3）还原剂用于断裂二硫键，常用的有DTT （二硫苏糖醇）、TDF （二硫赤藓糖）和 TBP（三丁基膦） null 使用注意点： ① 样品离心前在室温下至少保持1小时， 使完全变性和溶解； ② 样品含尿素不可加热，以防蛋白质修饰； ③ 样品类型不同，选择裂解液的组成也不同。三、蛋白质的分离与二维电泳技术三、蛋白质的分离与二维电泳技术(一) 二维电泳的基本原理 根据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第二方向按照分子量大小进行SDS-PAGE分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）。 (一) 二维电泳的基本原理 根据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第二方向按照分子量大小进行SDS-PAGE分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）。 1D-SDS-PAGE 1D-SDS-PAGE一 原理 在1D-SDS-PAGE中，蛋白质样品溶解在通常含有巯基还原剂（巯基乙醇或DDT)和SDS的上样缓冲液中。 SDS与蛋白质结合，以与分子质量约恒定的比例将负电荷（来自SDS硫酸基团）传递给蛋白质。高电压下，蛋白质- SDS复合物在交联的聚丙烯酰胺凝胶上迁移，其速度取决于它们穿越凝胶孔基质的能力。蛋白质按照分子质量次序分离形成条带。null 二 1D-SDS-PAGE的局限性 用1D-SDS-PAGE得到的分离度是相当有限的，显示 含有单一蛋白质的条带实际上可能含有多种蛋白质分子。 2D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE一 两种分离方法的结合 1）根据等电点用IEF分离蛋白质； 2）在聚丙烯酰胺凝胶上电泳进一步分离聚焦的 蛋白质。 2D-SDS-PAGE在第一向电泳根据等电点的不同， 第二向电泳根据分子质量的不同分离蛋白质。 null二 新式2D-SDS-PAGE 新系统使用固相PH梯度（IPG)胶条和相对简单的硬件，能很容易的从IPG胶条将蛋白质转移到SDS-PAGE平板凝胶中。在固相PH梯度中，聚羧酸两性电解质固定在支持物上，产生可重复的PH梯度。 null 三、 2D凝胶分离蛋白质的染色 通过2D凝胶分离蛋白质的显色使用通常的染色技术，包括银染、考马斯亮蓝和酰胺黑染色。银染和新的荧光染料是最灵敏的。 null五 2D-SDS-PAGE存在的问题 1）进行可完全重复的2D-SDS-PAGE分析是困难的。 2）某些蛋白质不适于进行第一维IEF步骤。许多较 大的疏水蛋白质在这种类型的分析中结果不理想；由于蛋白质存在不同等电点的多种形式，蛋白质的IEF常把蛋白质分离成许多不连续的条带。 3）作为检测技术的蛋白质染色的动态范围相对较小。点密度最多能反映100倍的蛋白质浓度范围。 2、二维电泳分辨能力 传统的二维电泳最好条件下20cm × 20cm的胶理论上可分辨10,000个蛋白点（各个方向100点）,实际上只能分辨3000个点. 2、二维电泳分辨能力 传统的二维电泳最好条件下20cm × 20cm的胶理论上可分辨10,000个蛋白点（各个方向100点）,实际上只能分辨3000个点. 3、二维电泳可提供的数据 二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。 3、二维电泳可提供的数据 二维电泳分离后的蛋白质经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。 null4、二维电泳结果说明 二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白， 由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键 还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除， 最终得到的是蛋白质的亚基。 nullCell cultureProtein extraction2-DESilver staining Image analysisScanningnullnullnull四、蛋白质的检测技术四、蛋白质的检测技术 （一）考马氏亮蓝染色 考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 mg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。 （一）考马氏亮蓝染色 考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250（红兰色）、R-350 （红兰色） 、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（ 595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20 mg ）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。 （二）银染 1、原理：二维凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后浸泡在银盐溶液中，蛋白与Ag+络合，凝胶空白背景中Ag+结合不牢而被冲洗，然后在酸碱环境中络合的Ag+被还原成金属银，蛋白点上金属银被曝光显示棕黄色或棕黑色。 （二）银染 1、原理：二维凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后浸泡在银盐溶液中，蛋白与Ag+络合，凝胶空白背景中Ag+结合不牢而被冲洗，然后在酸碱环境中络合的Ag+被还原成金属银，蛋白点上金属银被曝光显示棕黄色或棕黑色。 null2、特点 （1）银染分酸性（ AgNO3）与碱性（Ag(NH3)2+） 两种,酸性染色背景浅、容易控制，碱性灵敏度稍高， 但背景深、不容易控制。 （2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg。 （3）但由于存在戊二醛的特异性反应， 对下一步的酶切肽谱提取存在困难, 增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。 (三)负染 1、原理（锌-咪唑染料） 咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式 沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固， 留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域， 就是负染过程。 (三)负染 1、原理（锌-咪唑染料） 咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式 沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固， 留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域， 就是负染过程。 null2、特点 （1）负染能提高SDS-PAGE胶上蛋白质的回收率， 负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶 显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被 检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来。 （2）显色过程仅需5-15min （3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子 就可转移出蛋白质。 （4）灵敏度15ng。 （四）荧光染色 1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。 （四）荧光染色 1、原理：利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在一块2-DE胶上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。 null2、特点 （1）灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。 （2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能， 降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差。 （3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能 基团数不一样，灵敏度变化不一样。null二维电泳荧光检测 （五）总 结五、蛋白质序列测定和生物 质谱技术五、蛋白质序列测定和生物 质谱技术null质谱分析法： 质谱分析法(mass spectrometry)是将化合物形成 离子和碎片离子，按其质荷比(Ｍ/Ｚ值)的不同进行 分离测定，来进行成分和结构分析的一种分析方法。 null蛋白质、多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子 转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、 磁场将具有特定质量与电荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白质 离子分离开来，经过离子检测器收集分离的 离子，确定离子的Ｍ/Ｚ值，分析鉴定未知蛋白质。nullESI：electrospray ionization，电喷雾电离 MALDI： matrix-assisted laser desorption ionization，基质辅助激光解吸电离 MALDI-TOF-MS： matrix-assisted laser desorption ionization and Time of Flight, 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 null这两种电离技术可以使核酸或蛋白质、多肽等不易 挥发的生物大分子产生汽化的带单电荷或多电荷的 分子离子，从而能够测定其分子量，同时它们所具有的 高灵敏度和高质量检测范围使生物大分子的微量分析 成为可能。灵敏度可达：fmol(10-15)乃至amol(10-18)Instrumentation of MSInstrumentation of MSSource: produce ions from the sample； Mass analyzer（质谱仪）: resolve ions based on mass/charge (m/z) ratio； Detector（检测器）: detect the ions resolved by the mass analyzer； Data acquisition system（数据采集系统）: control the operation and record the MS data 。How MS Instruments WorkHow MS Instruments WorkWhat Do We Want from MS Data?What Do We Want from MS Data?Sensitivity: routinely obtain data on femtomole (10-15 mole) of peptides or less Resolution: reliably distinguish ions that differ in m/z values of at least 1 Da Mass accuracy: the measured values close to their real values Ion SourcesIon SourcesMatrix-assisted laser desorption ionization (MALDI)基质辅助激光解吸电离 Electrospray ionization (ESI)电喷雾电离MALDIMALDISince discovered by Tanaka, Karas and Hillenkamp in 1987, MALDI has become a powerful tool for protein and peptide analysis； The MALDI process is characterized by the use of matrix molecules which minimize analyte fragmentation and increase sensitivity； MALDI allows the desorption and ionization of analytes with very high molecular mass in excess of 100,000 Da MALDI : PrincipleMALDI : Principle分析物（analyte）分散在基质分子中，并形成晶体； The pulsed laser beam is directed at the matrix containing the sample； The matrix molecules emit the absorbed energy in the form of heat, causing crystals and sample to vaporize into the gas phase； The charged ions are then extracted into the TOF mass analyzer, and sent down to the detector. nullMALDI: Practical ConsiderationsMALDI: Practical ConsiderationsLaser wavelength and power density Nitrogen lasers (337 nm) are standard but other lasers are also used High laser power induces more fragmentation and loss of mass resolution Matrix selection and optimization Strong absorbance at the laser wavelength Low enough mass to be sublimable Vacuum stability Lack of chemical reactivity Sample preparation (“dried-droplet”) MALDI Spectrum of Peptide MixtureMALDI Spectrum of Peptide MixtureESI: PrincipleESI: PrincipleA strong electric field is applied to a liquid stream passing through a capillary tube； The field induces a charge accumulation at the liquid surface located at the end of the capillary, causing formation of highly charged droplets； These droplets then pass through a heated gas curtain to remove the last solvent molecules。 nullN2 (80 oC)N2 (80 oC)ESI: Practical ConsiderationsESI: Practical ConsiderationsTo observe a stable spray, a minimum amount of electrolyte in the solvent is required, but this is so low that normal solvents contain enough electrolytes for this purpose. The maximum tolerable total concentration of electrolytes to still have good sensitivity is about 10-3 MTypical ESI SpectrumTypical ESI SpectrumMass AnalyzersMass AnalyzersTime-of-flight (TOF) analyzer（飞行时间质量分析器） Quadrupole analyzer （四级杆分析器） Triple Quadrupole analyzer（三级四级杆分析器） Quadrupole ion trap analyzer（四级离子阱分析器） nullObjective: Generate a unique set of numbers For any protein1. Peptide Mass Fingerprint (PMF)2. Peptide Fragmentation (MS/MS)AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSERDVSTVLPDNFPRYPVGKFFQYDTWKQSTQRLRRGLPALLRARRGHVLAKELEAFREAKRHRPLIALPTQDPAHGGAPPEMASNRK563.32619.32624.38739.48764.391053.451134.531187.601654.84Protein sequenceEnzyme specific peptidesPeptide massesEnzymatic hydrolysis GIVEECCFRFragmentation in MS Enzyme specific peptideG I V E E C C F R 58171270399528630732879175322424526655784883996Masses of fragment ionsnull肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting)： 蛋白质被酶切位点专一的的蛋白酶水解后得到的肽片断 质量图谱。由于蛋白质的氨基酸序列不同，其肽混合物 质量数也具特征性，所以称为肽质量指纹谱， 用于蛋白质的鉴定。Peptide Mass Fingerprinting: OverviewPeptide Mass Fingerprinting: OverviewProtein identification technique involves the use of MS to measure the masses of proteolytic peptide fragments； The measured peptide masses are searched against corresponding peptide masses from protein sequence databases； The protein is identified if there is a good match between the experimental and theoretical masses.Peptide Mass Fingerprinting: Dual-Track ApproachPeptide Mass Fingerprinting: Dual-Track ApproachExperimental Computational Protein sequence databases or nucleotide sequence databases 1）Perform virtual digestion of all the proteins in a database into peptides with a chosen protease； 2）Calculate the peptide masses under given digestion conditions and generate a list of theoretical peptides； 3）Correlate the measured peptide masses with those in the list； 4）Report the best matched peptides in the order of decreasing significance.Intact protein from 2D-SDS-PAGE or HPLCPeptide mixtureMALDI-TOF MS determination of peptide massesDigestionnullMatches are made easy by search enginesCharacteristics of various search enginesCharacteristics of various search enginesSearch engineKey featuresScoring methodMascot http://www.matrixscience.comMS and MS/MS modes combined Automated searches are availableProbability basedMS-Fit/MS-Tag http://prospector.ucsf.eduMS or MS/MS modes Automated searches not availableMOWSE in MS mode match count in MS/MS modePeptIdent http://www.expasy.ch/ tools/peptident.htmlMS mode only Automated searches not availableGenetic algorithm based on the characteristics of TOF MS spectraProFound/Sonars http://www.proteometrics.comMS or MS/MS modes Automated searches availableBayesian approachSEQUEST http://fields.scripps.eduMS/MS mode only Automated searches availableCross-correlation methodThe search parameters of database search engines(Mascot)The search parameters of database search engines(Mascot)mass accuracy MS modemass accuracy MS modeamino acid modificationsorganism infodatabase namemass of precursorsreporting featuresenzyme specificitycharge state of precursorsSequence databases and information sources for protein identificationSequence databases and information sources for protein identificationProtein sequences from protein sequencingTranslated from full length cDNA sequencesTranslated from incomplete cDNA sequences (EST)Predicted from raw genomic sequencesSourceReliabilityVolume of dataExampleshighhighmediumlowlowmediumhighhighSWISSPROTSWISSPROT, TrEMBL, nrNCBInrNCBIdbESTPeptide Mass Fingerprinting: An Example with a Real PeptidePeptide Mass Fingerprinting: An Example with a Real Peptide14 peptides resulted from tryptic digestion of human hemoglobin alpha chain； One peptide VGAHAGEYGAEALEA with monoisotopic mass of 1528.7348 Da； Searching in the SWISS-PROT database (mouse and human proteins) yields two matches: IGGHGAEYGAEALER mouse 1529.7348 VGAHAGEYGAEALER human 1529.7348 Accurate protein identification requires multiple peptide matches。 Peptide Mass Fingerprinting: LimitationsPeptide Mass Fingerprinting: LimitationsImperfect mass data on peptides due to limited mass accuracy of instrument； Too many signals to be accurately identified； False-positive matches due to chance alone, rather than actual identify； Incomplete protein digestion by protease； Misrepresention of modified proteins in the database； Protein to be identified does not exist in the database.Protein Identification with MS/MS DataProtein Identification with MS/MS DataPeptide sequence determined on the basis of its MS/MS spectra is searched against a sequence database to identify the protein from which the peptide is derived； The matching process can be performed either manually (de novo interpretation) or with the aid of software tools such as Sequest； The use of the software tools eliminates the need to actually interpret each MS-MS spectrum individually, thus allowing automated, high-throughput identification of proteins。Correlating MS/MS spectra with database sequenceCorrelating MS/MS spectra with database sequenceCalculate peptide masses for each sequence in a database at given digestion conditions Find out every peptide that matches with measured one and generate a set of theoretical MS/MS spectra Compare the measured and theoretical spectra and calculate correlation scores Report the matches in order of significance Showing sequence coverage for matched protein based on correlation of MS/MS spectra to peptide sequencesShowing sequence coverage for matched protein based on correlation of MS/MS spectra to peptide sequencesComplicationsComplicationsProteins with unanticipated modifications cannot be identified correctly； Incorrect assignment of charge state (i.e., singly vs. doubly cha