液质联用法测定血浆中罗红霉素的内标法与外标法的比较

第 28卷增刊 2009年 12月 试验室 Chinese Journal of Ana．1vsis L出oratoⅣ Vo1．28．Suppl 20o9一l2 液质联用法测定血浆中罗红霉素的内标法与外标法的比较 张丽芳 ，薛飞群 (中国农业科学院上海兽医研究所 ，农业部动物寄生虫病学重点实验室， 中国农业科学院兽药安全与兽药残留检测重点开放实验室，上海 200241) 摘 要：建立一种准确可靠的测定血浆中罗红霉素的液质联用方法。通过比较 两种定量方法(内标法和外标法)的校正曲线的线性、方法的准确度和精密度等 参数最终确定选用内标法更能获得可靠的测定结果。 关键词：罗红霉素；液质联用法；内标；外标；校正曲线 罗红霉素是大环内酯类抗生素，具有口服吸收 良好、组织穿透力强、血药浓度高、体 内分布广 泛、副作用轻微、易耐受等特点。 近年来，由于液质联用技术具有高灵敏度和 高选择性的特点，因此它已广泛应用于生物药物 分析中，成为定量测定复杂基质中小分子化合物 的重要技术 卜 。但是随着研究的深入发现，以电 喷雾作为电离源的液质联用技术存在一个致命的 弱点——基质效应 ～ 。基质效应主要是由共提 物存在影响了待测物的离子化效率而引起的，这 种效应直接会影响分析方法的准确度和精密度。 在色谱定量分析中主要由两种校正方法 ：内 标法和外标法。本研究在建立血浆中罗红霉素的 测定方法时分别采用了上述两种定量校正方法， 通过比较两种方法的校正曲线的线性和准确度和 精密度等参数来确定一种可靠的定量方法。 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 2695型高效液相色谱仪(美国 waters公司)， Quattro micromass三重四极杆串联质谱仪 (美国 waters公司)，电喷雾电离源，Waters Masslynx 4．0 软件系统；XW-0A型涡旋混合器(上海医科大学 仪器厂)。 罗红霉素对照品(纯度 99．6％)，内标克拉霉 素(纯度 99．8％)均购于中国生物制品检定所；乙 睛为色谱纯(Fisher公司)．其余试剂均为分析纯； 分析用水 Millipore超纯水仪制备得；空白血浆由 上海中心血站供应。 标准储备液：准确称取罗红霉素标准品2 mg 于 10 mL容量瓶 中，用乙腈溶解并定容至刻度， 配制成浓度为 200 I．~g／mL的储备液，4℃下保存。 临用前用乙腈稀释成标准工作液。 内标溶液：准确称取克拉霉素标准品 1 mg于 10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制 成浓度为 100 p~g／mL的储备液 ，4 qc下保存。临用 前用乙腈稀释成 10~g／mL的内标工作液。 1．2 色谱与质谱条件 色谱条件：色谱柱 ：XTerra MS C1 3．5 m 2．1×100 mm。流动相：乙腈：0．1％甲酸水溶液 40：60(v／v)，流速：0．2 mL／min，柱温30℃。 质谱条件：选用电喷雾电离源，正离子模式， 毛细管电压 3．5 kV，源温 100 oC，脱溶剂温度 300 oC。质谱扫描方式为多反应监测 (MRM)，质 谱检测条件见 1。 表 1 质谱检测条件 1．3 样品前处理 1．5 mL的塑料离心管中精确加八血浆样品 200 L，精确加入 100 p．L内标工作液．加入乙腈 作者简介 ：张丽芳 (1970一 ．副研究员：E-mail·vuanzhexiao@yahoo．corn．cn 一 66 — 第 28卷增刊 2009年 12月 分析试验室 Chinese Joumal of AnMvsis I2J3oratoD' Vo1．28．Suppl 2o09—12 400 wE．涡旋 2 min，于 12000 r／rain离心 10 rain， 取上清液经0．2 m滤膜过滤后进样测定，进样量 20 L t．4 血浆标 隹曲线的制备 取空白血浆 100 L，分别精确加入不同浓度 的罗红霉素标准工作液，分别配成含罗红霉素浓 度为 1O、5、2、1、0．5、0．2和0．1 gg／mL的样品， 按“2．3项样品前处理”操作。记录色谱图，由罗红 霉素在血浆中浓度为横坐标(X)，罗红霉素与克 拉霉素峰的面积比为纵坐标(Y)，用加权最d~---- 乘法进行回归运算内标法校正曲线；以罗红霉素 在血浆中浓度为横坐标(X)，罗红霉素的色谱峰 面积为纵坐标(Y)，用加权最小二乘法进行回归 运算外标法校正曲线。 2 结果与讨论 2．1 专属性 分别采集空白血浆样品和空白血浆中加罗红 霉素对照品和克拉霉素对照品(内标)的加标样品 的色谱图(图 1)，结果显示空白血浆对待测物并 无干扰： { ／ 、＼、 碗葡融 ： 2．2 线 性 分别选用 1和1／X 两种权重系数并分别采用 内标法和外标法进行校正曲线( ：5)的制备 (图 2)。由图可知，由外标法建立的两种校正曲线的 校正系数 r 均小于0．99，权重系数的校正曲线在 低浓度时的残差较大，无法满足定量检测的要求； 而由内标法建立的两种校正曲线的校正系数 r 均 大于0．99，残差值均满足定量检测的要求。 2．3 精密度与准确度 在空白血浆中添加罗红霉素配置成高、中、 低三个浓度，按样品前处理方法处理样品，分别 以内标法和外标法定量测定，结果见表 2和表 3。 由表3可知．由外标法 (权重 ：1)测定的低浓度 的方法回收率只有9．00％，日内精密度 72．44％， 日间精密度115．7％，远远不能满足定量检测的要 求，而选用权重 彬=l／X2的外标法测定的精密度 和准确度数据虽能满足要求但不如内标法的测定 结果。 2．4 权重系数的比较 本实验分别选用普通最小二乘法和加权最小 二乘法检查校正曲线的线性。 当外标法选用普通最小二乘法(权重因子 乩t= 1)校正线性时，由于校正曲线上的每个浓度点的 绝对误差具有同等的重要性，所获得的校正曲线 在低浓度区域的测量值的相对误差大，而内标法 由于在一定程度上消除了偶然误差的影响，因此 一 67 — 第28卷增刊 2009年 12月 分折试验室 Chinese Journal of Analvsis L出orator~ Vo1．28．Suppl 2009—12 内标法选用普通最小二乘法所获得的校正曲线的 线性优于外标法的。 选用权重系数 =1／X2时，由于校正曲线上 0 nDa州 啊 r 脯 C∞—村 'a_■曲 t¨rtngE旧aB旺一2=n锄 §35 0棚ba■ma_’En嘲0●8● x+．0m ∞'∞ R喇 憎目 ptH_f■ {材(Rg2 -^-·‘(ISCo)clts r啊 l Q—●b_ILjr- a _nE J嚏 ■’ Nud．^ ·‘ n《None 詈 0．0 否 ． 10 0 6 C 墨 4 星 2 0 0．0 1．0 2．0 3 0 4．0 5 O 6．0 7．0 8．0 9．0 lO O (a、(u mU Compound r~4Rg： ● COr岫 硒 nc_●c■nt r 0．Sl~lt)a9．r^2tOj．o口 C●岛 a肿 B240¨ ’⋯ 33795 ResDom e4pt E●● lI铷 ^- cum 懈 ：Lh 一．( n：E 州 ^w· l’●r崎．' ^■ ⋯ N相 · O ． 20 (c)( mL) 的每个浓度点的权重随着罗红霉素浓度的不同而 不同，使罗红霉素的测定结果与各浓度添加量的 相对偏差在不同浓度问比较均衡(图2和表 2)。 Com∞ w ㈣ ． -T C 岫 鞠nco●■0-^t r=O搠 7O．1、 2-O■“ '舯 C●岫 培抽 n⋯ me9●975‘x●．o．03812柏 R●●口。啊 ●眦 lF- m●Is l Ret2 ’^●。¨ sC∞ ，B -^●} o L_-|r ：自州 ^ w● H_ ’帆 ．^ ■ t_●·H呻 · 亏 0．0 ’ ． 10．0 兰 6 00 ＆ 4 OO 2．O0 O．∞ x ； ’ 群 、 ： ： 0 0 1．0 2．0 3 0 4．0 5．0 6．0 7．0 8．0 9．0 10．0 (b)( mL) Cbm ∞ u州 n●m ● 口 ● C T_■ n 0∞ ■cIn【r鼍r 0 994350．r =0∞。7，2 C■m牲 ● 艚o 41‘x+1318．07 R● 惜 ●呻 ●：E)■f幛 I ．^ 。●● c 哺 t，口． LIn· orI。 E虹 Idt w● hnn口：Hu*．^■●n n·H∞ · 0 0 1 0 2．0 3．0 4．0 5．0 6．0 7 0 8 0 9 0 10．0 (d)(u mL) Fig．2 Internal standard(A：彬=1；B： =1／X2)and External standard(C： =1；D：11)=1／x2)calibration curves Table 2 Precision and Recovery of Roxithromycin in plasma in internal standard calibration f n=5 Table 3 Precision and recovery of Roxithromycin in plasma in external standard calibration(，l：5) 2．5 定量分析方法的确定 本方法样品预处理非常简单(只加一定沉淀 68 ．---—— 剂)，不易引入操作误差，按理应该选用外标法和 内标法均可，但从实验结果看，同样的样品按同 O O 0 阳 时0 。 枷 删 。 蚕 I)l吞 譬LlU蠹uv一 一 = 一 0 0f：c0 ∞0 _ 第 28卷增刊 2009年 l2月 分析试验室 Chinese Journal of Analysis Laboratory Vo1．28．Suppl 2o09一l2 样的样品前处理方法处理，分别按内标法和外标 法定量测定，结果完全不同，这主要是由于血浆 中待测物共提物的存在，影响了罗红霉素在电喷 雾离子源中离子化的效率和重现性。在考察线性 及线性范围的实验中，我们还发现，随着血浆中 罗红霉素浓度的增加，内标所测得的峰面积会减 小(表 4)，这说明由于待测物罗红霉素浓度的增 加，罗红霉素和内标互相竞争离子化，导致两者 都出现了离子抑制现象，从而影响了罗红霉素的 测定，因此内标的引入在一定程度上消除了这种 基质效应的影响。因此综上分析，定量方法选内 标法更准确。 Table 4 PeaJ‘areas of Roxitl~omycin and internal stand- ard in different concentration(n=5) 3 结 论 本实验通过比较两种定量方法(内标法和外 标法)，最终确定采用液相色谱串联质谱法以内标 法定量测定血浆中罗红霉素。 参考文献 [1]Michael Vogeser，Christoph Seger．Clinical Bioehemis— try ． ， 20o8，41：649 [2 Raymond Xu Naxing，Fan Leimin，Rieser Matthew J，E1一 Shourbagy Tawakol A．Journal of Pharmaceutical and Bi— omedical Analysis，2007，44：342 ：3 Chico J，Rt~bies A，Centrich F，Company6 R，Prat M D，Granados M．Journal of Chromatography A，2008， 1213，2(12)：189 [4]Taylor Paul J．Clinical Biochemistry．，20o5，38：328 [5 j Eduard Rogatsky，Daniel Stein．J Am Soc Mass Spec— trom，2oo5，16：1757 6] Jean—Philippe Antignaca，Katia de Waschb，Fabriee 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