肺炎链球菌表面黏附素A_PsaA_的研究进展

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 收稿日期 : 2007202225 作者简介 :何 斌 (19772)男 ,硕士 ,主要从事细菌检验和免疫学研究。 肺炎链球菌表面黏附素 A ( PsaA)的研究进展 何 斌 综述 ;朱 虹 审校 (军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室 ,北京 　100071) 摘 要 :肺炎链球菌表面黏附素 A ( PsaA)是各型肺炎链球菌共有的种特异性表面结合脂蛋白 ,具有较好的免疫原 性 ,在肺炎链球菌黏附呼吸道粘膜过程中起关键作用 , PsaA的编码基因 psaA在遗传上高度保守 , PsaA是目前肺炎 链球菌抗原研究的热点之一。本文就十年来 PsaA的研究进展作一简要综述。 关键词 :肺炎链球菌表面黏附素 A ( PsaA) ; psaA基因 ; 重组 PsaA 中图分类号 : R378. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 100525673 (2007) 0320084203 　　肺炎链球菌 (S treptococcus pneum on iae, Sp )是 细菌性肺炎的主要病原体 ,幼儿、老人及免疫力低下 者是高危人群。当 Sp从感染的原发部位传播 (散 ) 到循环系统、中枢神经系统或其它正常情况下无菌 部位时 ,会引起脑膜炎、菌血症等疾病。尽管使用抗 生素治疗 ,但 Sp感染性疾病在全球仍引起较高的发 病率和死亡率。 肺炎链球菌表面黏附素 A ( Pneumococcal sur2 face adhesin A PsaA )是各型 Sp共有的一种遗传保 守、种特异性的表面结合脂蛋白 ,分子量约为 37kD, 具有较好的免疫原性 ,在 Sp黏附呼吸道粘膜过程中 起关键作用 ,因此与 Sp的侵袭性和毒力有关。自 1990年首次发现并报道 PsaA以来 ,对于 PsaA的研 究日益受到关注。本文将近十年来在 PsaA方面的 研究进展综述如下。 1　PsaA蛋白的编码基因 PsaA蛋白的编码基因为 psaA, 该基因有 930个 核甘酸 , Sp 90个血清型均可扩增出 psaA 基因〔1, 2〕。 Samp son等〔3〕以 10种限制性内切酶对 80个 Sp菌 株 (包括 23价多糖疫苗中的 23个血清型 )的 psaA 基因进行 PCR2限制性片段长度多态性 ( PCR2RFLP) 分析 ,结果发现仅有 10%的菌株发生微小变异 ,即 在 146bp条带中含有额外的 Tsp509 I酶切位点 ,使 PCR2RFLP带型图谱总条带数由 5条增加为 7条 , 而其它限制性酶切位点无变异发生 ,上述结果表明 , 不同血清型 Sp的 psaA基因高度保守的。 2　PsaA蛋白的结构 PsaA是 Sp种特异性蛋白 ,分子量约为 37kD, 前体 PsaA包括四个区域 : 1个信号肽序列 , 2个 (β/ α) 4结构域 , 1个α螺旋接头。N端的信号肽序列由 20个氨基酸残基组成 ,其中包含 II型信号肽酶识别 位点 LXXC序列 ,信号肽自丙氨酸与半胱氨酸残基 处被酶切后 ,半胱氨酸残基即脂化将成熟 PsaA锚定 在细胞上 ,成熟 PsaA的空间结构为 1个α螺旋连接 2个 (β/α) 4结构域〔4〕。 3　PsaA蛋白的功能 近年来研究认为 , PsaA作为 Sp表面蛋白 ,其功 能可与细菌黏附作用有关。1994年 Samp son等〔5〕 首次 将 PsaA 分 别 与 血 链 球 菌 (S treptococcus sangu is) 的 SsaB 蛋白、副血链球菌 (S treptococcus pa rasangu is) 的 FimA蛋白进行氨基酸序列比对和 同源性分析 ,其氨基酸相似性分别为 80%和 92. 3% ,且 PsaA与 SsaB差异主要在 N端氨基酸序列 , 尤其是在信号肽序列内差异较大 ;已确认 SsaB 和 FimA分别与 S. sangu is和 S. pa rasangu is的黏附作 用有关 ,进而推测 PsaA在 Sp寄居鼻咽部并引起下 呼吸道疾病过程中 ,主要起黏附呼吸道表面的作用。 Berry等〔6〕采用 PCR扩增 Sp 2型 D39株 psaA 基因片段并克隆到载体 pVA891, 在 psaA基因处引 入插入突变 ,形成 PsaA21和 PsaA22两株独立的基因 psaA2突变株 ,用这两株基因 p saA2突变株于鼻内及 腹膜内攻毒小鼠 ,突变株 PsaA21和 PsaA22与野生型 D39菌株相比毒力明显减弱 ,且与 PsaA21衍生型 (经 完整 psaA基因重新克隆构建的回复突变型 )相比 , 突变株 PsaA21及 PsaA22毒力亦明显减弱 , PsaA21对 A549细胞 ( II型肺细胞 )的黏附能力只有 D39野生 型菌株的 9% ,说明 Sp毒力作用的减弱是由 PsaA 的缺失所造成 , PsaA虽然不是毒力因子 ,但通过黏 附作用间接影响 Sp毒力的强弱 ,这是 PsaA作为黏 48 微生物学免疫学进展 2007年第 35卷第 3期 　　Prog in M icrobiol Immunol Aug. 2007, Vol. 35 No. 3 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 附素的首次功能性证据。Hammerschm idt〔7〕也认为 PsaA通过与上皮细胞钙黏蛋白结合直接发挥黏附 作用 (图 1)。 图 1　PsaA黏附作用 4 重组 PsaA蛋白 天然 PsaA在各型 Sp中均低水平表达 ,进而大 量提取天然 PsaA进行结构、功能分析研究则较为困 难。Tharpe等〔8〕以加入 5%脱纤维羊血的胰酶大豆 琼脂培养 22F 型 Sp ,并用等电聚焦法提纯天然 PsaA ,研究中以牛血清白蛋白作为校正曲线 ,采 用 BCA法 ( Pierce公司 BCA蛋白分析试剂 )定量测 得每克湿菌体中约含 200μg的纯化 PsaA。结果表 明天然 PsaA在 Sp细胞内以低水平表达。据文献报 道〔5〕天然 PsaA的信号肽对于 PsaA在大肠杆菌中的 表达量是低效的。因此 ,克隆全长 psaA基因在大肠 杆菌中表达 ,也非大量获得 PsaA的有效方法。 为解决天然 PsaA 在 Sp 细胞内及重组 PsaA ( Recombinant pneumococcal surface adhesin A, rP2 saA)在大肠杆菌中低量表达的难题 , De BK等〔9〕采 用 Bac2to2Bac杆状病毒真核表达系统 ———穿梭质粒 载体 Bacm id法重组表达 PsaA,将全长 psaA基因构 建于杆状病毒启动子下 ,并转化于含 Bacm id DNA 的 E. coli菌株 ,重组了外源基因 psaA 的 Bacm id DNA转染昆虫 S f9细胞 ,病毒滴度均大于 3 ×108 pfu /m l,纯化后的 rPsaA量约为 3mg/L培养物 ,大约 是天然 PsaA提取量的 3～4倍。以杆状病毒为载体 的昆虫表达系统可高水平表达外源基因 psaA, 但昆 虫杆状病毒表达系统重组率低 ,病毒筛选困难 ,工作 周期长 ,还需进一步改良方法 ,实现高通量优化表 达。 2000年 , De等〔10〕又针对天然 PsaA信号肽对表 达的低效作用 ,采用分子生物学技术以伯氏疏螺旋 体外膜蛋白 A (O spA )信号肽基因序列替换基因 psaA的信号肽基因序列 ,将 870bp的功能性 psaA基 因片断 (不含信号肽基因序列 )连接于质粒 pLF100 (含 O spA信号肽全长基因序列 )上 ,构建表达载体 , 在大肠杆菌 HMS1742DE3 /pLysS (Novagen,Madison, W I)中表达 ,纯化后 rPsaA可达到 5 mg/L发酵液 , 且将纯化 rPsaA免疫接种 CBA /NCAHN2X ID雌性小 鼠鼻内 ,抗 rPsaA的抗体与天然 PsaA、rPsaA均可发 生反应。证明天然 PsaA 的信号肽被替换为 O spA 信号肽后 ,经大肠杆菌原核细胞表达系统表达 , rP2 saA表达量明显提高 ,且 rPsaA 在结构和免疫原性 上与天然 PsaA相似。 5　PsaA蛋白的应用 近年来 , PsaA主要应用于 EL ISA检测患者血清 抗体。1996年 , Tharpe等〔11〕首次以纯化 PsaA作为 捕获抗原 ,用 EL ISA检测患者血清中的 PsaA抗体 水平 ,检测用的 90份血清分别来自 30名 Sp感染患 者、10名支原体肺炎患者、10名衣原体肺炎患者、10 名嗜肺军团菌感染患者和 30名健康受试者 ,患者均 经标准血清学诊断试验确诊。检测以 EL ISA 读数 器 ( Dynatech laboratoried, A lexandria, Va. ) 读 取 410nm处 A值作为结果 ,用样本与正常对照血清样 本 A值比来消除板间差异 ,以未做任何疫苗接种健 康人群的 30天内采取的第 2份血样和第 1份血样 A值比作为正常基准线。以急性期与恢复期血清 A 值比的增长判读结果 ,当结果比正常均值高 1. 4倍 标准差时视为阳性 (正常均值和标准差分别为 1. 03 和 0. 28) ,其中 30份 Sp感染患者血样有 20份检测 为 Sp阳性 ,全部检测样本中仅有 1份为 Sp假阳性 , PsaA2EL ISA的敏感性、特异性分别为 67%和 97%。 实验显示 PsaA作为 EL ISA的捕获抗原 ,检测 Sp感 染患者血清中 PsaA抗体是可行的 , PsaA2EL ISA作 58微生物学免疫学进展 2007年第 35卷第 3期 　　Prog in M icrobiol Immunol Aug. 2007,Vol. 35 No. 3 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 为 Sp感染的诊断方法需进一步试验证实。 为探讨 PsaA 在成人肺炎诊断中的作用 , Scott 等〔12〕用重组 PsaA酶联免疫吸附法检测血清标本中 抗 PsaA IgG水平。血清来自 47名健康对照者、56 名无肺炎的临床对照者、109名 Sp患者和 93名非 Sp性肺炎患者。以抗体浓度 2倍升高判为阳性时 , 敏感性为 70% ,特异性为 98% ;以抗体浓度 1. 3倍 升高判为阳性时 ,敏感性为 89% ,特异性为 98%。 PsaA2EL ISA的检测结果不受 Sp血清型的影响 ,具 有较高的敏感性和特异性 ,是诊断成人肺炎链球菌 性肺炎的理想方法。 近年来 ,为检验 PsaA2EL ISA在侵袭性肺炎链球 菌疾病 ( Invasive pneumococcal disease IPD )婴幼儿 患者 ( 4 ～7 周 ) 中的诊断效果 , Scott等〔13〕又以 EL ISA法检测 IPD患儿血清中的抗 PsaA 抗体 IgG 水平 ,血清来自 98名患儿的双份血清、95名同龄疟 疾或贫血患儿双份血清和 97名同龄健康婴幼儿对 照血清。试验在排除鼻咽携带者后 ,以抗 PsaA抗体 浓度 2. 7倍升高判为阳性 ,结果显示 , PsaA2EL ISA 法在 IPD患儿及健康婴幼儿中的检测特异性、敏感 性分别为 97%和 42% ,说明 PsaA2EL ISA在婴幼儿 患者中敏感性非常低 ,因此不适合用于 IPD患儿血 清抗体的检测。 肺炎链球菌性疾病预防的唯一方法是免疫接 种 ,但目前使用的 Sp多糖疫苗存在两点不足 :一是 疫苗保护性为型特异 ;二是疫苗保护性还不完全 ,对 某些高危人群 ( 2岁以下婴幼儿和老年人 )非常低 效。为克服多糖疫苗的缺陷 ,学者们把研究候选疫 苗的焦点转向几种 Sp蛋白 ,其中 PsaA蛋白以其种 特异性、序列保守性和免疫原性成为肺炎链球菌性 疾病预防的蛋白疫苗研究的热点之一〔14〕,但仍有许 多问题需不断研究加以完善 ,我们相信随着研究的 不断深入 , PsaA将在肺炎链球菌性疾病的诊断和 预防中发挥积极的作用。 参考文献 : 〔1〕　Morrison KE, Lake D, Crook J, et al. 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