板蓝根活性部位抗单纯疱疹病毒1型分子机制的研究

时珍国医国药 2011年第 22卷第 2期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL．22 NO．2 作简便 ，重复性好，可作为甘遂饮片的质量控制方法。生甘遂和 制甘遂 中该成 分的含量分别 为：0．293 3～1．123 7 mg／g和 0．272 7～0．921 7 mg／g。 实验过程中对甘遂供试品溶液的提取溶剂和提取方法进行 了选择。采用氯仿作为提取溶剂较 甲醇和无水乙醇提取所得 的 指标成分多；分别采用超声、回流的方法进行提取，结果明超声 得到的指标成分多，且操作方便 ；甘遂饮片采用氯仿超声提取两 次后，可提取约98％的指标成分。 醋甘遂 z5是由生甘遂 S6经醋炙得到的样品，由表 1可以看 出，甘遂炮制后，DBDI的含量降低。 由图 1可以看出，l1 min的成分在甘遂中含量较多，也可以 与周围成分达到很好的分离，所以可以对其进行分离纯化，得到 纯度较高的对照品，对甘遂饮片进行多个指标的质量控制。 参考文献： [1] 国家药典委员会．中国药典，I部[S]．北京：化学工业出版社 ， 2005：60． [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 潘 勤，闵知大．甘遂中巨大戟萜醇型二萜酯类化学成分的研究 [J]．中草药，2003，34(6)：489． 程显隆，肖新月，李广华，等．甘遂中大戟二烯醇和表大戟二烯醇 的含量测定[J]．药物分析杂志，2009，29(9)：1444． 张 丽 ，束晓云，唐于平，等．醋甘遂饮片炮制工艺研究[J]．中国中 药杂志，2009，34(6)：683． 修彦凤，吴 瞍，王海颖，等．HPLC—ELSD指纹谱法研究甘遂炮制 前后成分差异[J]．中成药，2009，31(2)：249． 修彦凤，施 贝，王海颖，等．甘遂炮制前后量变成分的初步研究 [J]．上海中医药大学学报，2009，23(1)：67． Matsumoto T，Cyoun J C，Yamada H．Stimulatory effects of ingenols from Euphorbia kansui on the expression of maerophage Fc recepter[J]． Planta Med，1992，58(3)：255． Satoshi N，Susumu 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the anti—viral molecular mechanism of active constituent from Radix Isatidis against herpes sim— plex virus type 1 in vitro．Methods To detect the effect of active constituent from Radix Isatidis on the cellular activity of HSV一 1 infected vero cells by methyl thiazolyl tetrazoliym assay．To research the anti—viral effect of Radix Isatidis on thymidine kinase and DNA polymerase by real time RT—PCR．Results Active constituent from Radix Isatidis decreased TK and DNA polymerase copies in early stage by real time RT—PCR．Conclusion Effective components of Radix Isatidis can reduce mRNA of sortie herpes simplex virus type 1 immediate early genes，such as HSV 一1 thymidine kinase and DNA polymerase，and show its function a— gainst HSV 一1． Key words：Radix lsatidis； Herpes simple virus； Anti—virus 板蓝根(Radix Isatidis)系十字花科植物 lsatis indigotica Fort 菘蓝的根，具抗菌、抗病毒、增强免疫功能等作用。虽然已有板蓝 收稿 日期：2010-01—13； 修订日期：2010-07-07 基金项目：国家教育部博士点基金课题资助项 目(No．20093237120015)；江苏省中医药管理局科技研究专项基金(No．HZ07044)； 江苏省高校自然科学基金课题资助项 目(No．09KJB360006)；南京中医药大学青年自然科学基金(No．09XZR02) 作者简介：董 伟(1977 )，女(汉族)，陕西西安人，现任南京中医药大学讲师，硕士学位，主要从事中医药对细胞生命周期、基因突变和凋亡干预研究 工作 ． 通讯作者简介：詹 臻(1952一)，女(汉族)，江苏南京人，现任南京中医药大学教授，博士研究生导师，硕士学位，主要从事中医药对细胞生命周期、基 因突变和凋亡干预研究工作． · 396 · LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL．22 NO．2 时珍国医国药 2011年第 22卷第 2期 根抗单纯疱疹病毒 一1的研究 ，但鲜有其活性成分抗病毒分子机 制的报道。本文通过研究板蓝根活性成分抑制单纯疱疹病毒 一1 的分子机制，以解析传统中药的抗病毒作用。 1 材料与仪器 1．1 细胞株、病毒株 与菌株 Vero(非洲绿猴 肾细胞，上海细胞 所)；HSV一1 F株(人类单纯疱疹病毒 I型)；大肠杆菌 DH5c~由 本室保存，pMD19一T载体(Takara公司)。 1．2 试剂和耗材 板蓝根活性成分提取物 由南京 中医药大学药 学院何立巍博士制备惠赠。RPMI一1640培养基(GIBCO公司产 品)；新生小牛血 清(中美合资 兰州 民海生物工程有限公 司， 20050629)；胰蛋白酶(Sunshine产品，南京布克生物技术有限公 司)；噻唑盐 (MTI"，Genebase产品)；DMSO(分析纯，AR，上海凌 锋化学试剂有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；SYBR Primeseript RT—PCR试剂盒(Takara公司)；TaqDNA聚合酶 、质粒小量提取 试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(Takara公司)。 1．3 仪器 酶标仪 Bio—Teck产品，POwERwAVE 340；ABI Prism7500型实时荧光定量 PCR检测系统；普通 PCR仪等。 1．4 引物 根据 Genbank已收录的 HSV一1胸腺嘧啶核苷激酶 (HSV1一tk，GenBank V00470．1)和 DNA多聚酶(HSV1一dp，Gen— Bank：AB072389．1)的cDNA序列，应用引物设计软件 Primer 5和 oligo 6．0设计弓I物 P1：5 GGcAGCAAGAAGCCAcGGAAGT 3 P2：5 AACCCAGGGCCACCAGCAGT 3 P3：5 GGCGTGCGTGACA ITrCAA 3 P4：5 GCAACATFCGACGAGrITITI1CCT 3 其中HSV1一tk位于98 — 220，长度 123 bp；HSV1一dp位于 3504—3682，DNA长度 179 bp。 引物委托英潍捷基(Invitrogen)上海公司合成。 2 方 法 2．1 板蓝根活性部位的提取 板蓝根药材 以水提取 2次，水提 取液加入 95％乙醇至终浓度为70％，从沉淀中得到总多糖部位 ， 经水溶解后加乙醇分级沉淀。水提醇沉后的上清液浓缩至适当 体积，通过 D101大孔树脂 ，水洗后经 50％乙醇溶液洗脱 ，得到醇 洗部位(X)，选取部位 X进行后续试验。 2．2 病毒的传代及效价测定 以10％小牛血清 RPMI一1640培 养基培养 vero细胞，按 1×10 的浓度，接种到 96孑L细胞培养板 上 ，每孔 0．2 ml，18～24 h长成单层细胞，弃去上清液，备用。将 HSV一1和 HSV一2两种病毒稀释成不同浓度(1O ，10～，10～， 10 ，10～，10一，10～，10一，1O～，10 )，加入 20 l病毒液，每 个浓度 8个复孔 ，吸附 1 h，弃去未吸附的病毒，加入 2％小牛血 清 RPMI一1640维持液0．2 ml，37％ 5％CO，培养 72 h。根据出 现细胞病变情况，计算病毒的 TCID⋯ 2．3 药物对Veto细胞的毒性实验 称取待检样品适量，用2％小 牛血清的 1640培养基(维持液 )充分溶解，过滤除菌，4℃保存。 取长成单层 Vero细胞 的96孔细胞培养板，弃去上清液，将含不 同浓度药物的细胞培养液 0．2 ml加入细胞 ，每个浓度 4个复孔 ， 37℃ 5％CO 培养 72 h，每孔加入 20 l 5 mg／ml的 MTr溶液 ，继 续培养4 h，倾去上清，加入 0．2 ml DMSO，570～630 nil3双波长法 测 OD值，计算细胞存活率和药物半数细胞毒性浓度 (TC )。以 最大无毒浓度为起始浓度 ，倍比稀释几个浓度，进行抗病毒实验。 细胞存活率(％)=(药物组平均A值／细胞对照组平均 A值)x 100％ 2．4 药物抗病毒实验 设空白细胞对照、病毒对照、0．2 m ml ACV阳性对照和药物组，共 4个组。Vero细胞按 1 x 10 的浓度 接种于 96孔 板，长 成 单层 的 细 胞，弃去 上 清，加 入 20 l¨ 100TCID 。病毒液，吸附 1 h，用 PBS液洗去未吸附的病毒，加入含 不同浓度药物的细胞培养液 0．2 ml，每个浓度 4个复孔 ，37％ 5％CO2培养 72 h，每孔加入 20 l 5 m ml的 MTF溶液，继续培 养4 h，倾去上清液 ，加入0．2 ml DMSO，570 nm(630 HITI作为参考 波长)双波长法测 OD值 ，计算药物的病毒抑制率和 50％抑制病 毒细胞病变的药物浓度(IC )。 病毒抑制率(％)=(实验组平均 4值 一病毒对照组平均 A 值)／(药物组平均 A值 一病毒对照组平均 A值)×100％ C 。=Anti 。s(B+ — j i } x C) B=lg(抑制率小于50％的样品浓度)，C=lg(稀释倍数) 2．5 目的基因质粒的制备 2．5．1 扩增目的基因 Vero细胞按 1 x 10。接种于6孔板，待长 成单层 ，弃上清液 ，加入 800 l 100TCID 。病毒液吸附 1 h，用 PBS 液洗去未吸附的病毒，加维持液培养 48 h。吸弃培养液，用 Trizol 试剂提取病毒总 RNA，按 RT—PCR试剂盒说明逆转录出 cDNA。 PCR扩增目的基因，其中包括 10 x PCR buffer 2．5 l，200~mol／L dNTPs，上下游引物各0．2 m0l／L， 1 l，Taq DNA聚合酶 2 U，水补足至体系 25 txl。PCR反应条件 ：94℃预变性 5 rain，然后 94℃ 30 s，60℃ 30 s，72％ 30 s共 3O个循环，最后 72℃延伸 5 min。2％琼脂糖凝胶电泳观测记录结果。紫外线下切下 目的条 带，称重，按说明书用 DNA凝胶回收试剂盒纯化回收 目的条带， 定量。 2．5．2 产物连接、转化和鉴定 按 pMD一19T说明书进行两种基 因 PCR纯化产物与 pMD一19T载体的连接反应。将连接产物转 化感受态 E．eoli DH5a，经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落。然 后用 PCR和 DNA测序证实 HSVI—TK和 HSV1一DP是否插入 T 载体，基因序列有无突变。 2．5．3 质粒标准品的制备 以质粒小提试剂盒提取 T —HSV1一 TK和 T—HSVI—DP质粒，紫外分光光度计定量 ，～20％保存。 2．6 药物抗病毒的荧光定量PCR实验 2．6．1 目的核酸的提取与制备 Vero细胞按 1 x 10 接种于 6孔 板 ，待长成单层，弃上清，加入 800 l 100TCID 。病毒液吸附 1 h， 用 PBS液洗去未吸附的病毒 ，加不同浓度的药物分别培养 8，48 h，收集 8，48 h细胞，用 trizol试 剂提取 Vero细胞和 HSV1总 RNA，逆转录成 eDNA。收集 48 h药物作用上清液 ，用体液病毒 DNA提取试剂盒提取 HSV1总 DNA。 2．6．2 荧光定量 PCR实验 两种质粒以 10倍配制连续稀释，制 备标准曲线。按 SYBR Primeseript RT—PCR试剂盒说明书检测 目的基 因 HSV1一TK和 HSV1一DP。其 中上下游 引物各 0．4 m0L／L，ROX reference DyeⅡ0．4txl，SYBR混合液 1O l，模板 2 l，以超纯水补足至反应体系 20txl。反应条件为 93％ 2 min； 93℃ 25 s，65％ 35 s，40循环。 2．7 统计学处理 所有数据均采用 ±s表示，绘制曲线图。 3 结果 3．1 病毒 的效价 根据病毒致 细胞病变情况判断 HSV一1的 TCID 50为 10～。 3．2 药物对Vero细胞的毒性实验 不同浓度药物对Vero的毒 性主要表现在：细胞增殖减慢，胞浆颗粒增多 ，部分细胞脱落死 亡。MTF法实验结果显示药物 TC 为 l0．09 mg／ml。 3．3 药物抗病毒实验 结果见表 1。 表 1 MTT法测定药物抗病毒实验结果 在显微镜下观察 ，病毒对照完全病变，细胞对照没有病变，阳 性对照病变轻微。样品浓度在 0．625，0．3125，0．156 mg／ml时 ， M1Tr法检测发现板蓝根活性部位对 HSV一1的感染具有 比较明 显的抑制作用。该样品抗 HSV一1的半数有效浓度 (IC 。)为 - 397 · 时珍国医国药 2011年第22卷第 2期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL．22 NO．2 0．57 mg／ml。 3．4 T—HSV1一TK和 T—HSV1一DP质粒制备 RT—PCR反 应后，取 5 Ixl经 20 L琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出 123 bp和 179 bp的基因片段，与预期相符 (图 1)。RT—PCR产物凝胶回 收后与 pMD19一T载体连接，经南京捷倍思生物基因技术有限公 司测序证明基 因序列正确，分别命名为 T —HSV1一TK和 T— HSV1一DP 1．HSV1一tkPCR产物 2．HSV1一dpPCR产物 3．DI2000DNA marker 图 1 HSV1一tk 口HSVI—dp的 RT—PCR 3．5 药物抗病毒的荧光定量PCR实验 两种质粒 T—HSV1一TK和 T—HSV1一DP紫外分光光度计定量 ，分别调节浓度至 1O 和 10 ，10 倍稀释5个浓度 ，经定量 PCR绘制标准曲线。其中 T—HSV1一TK 公式 Y=一2．7913 64X+36．893 593，R2=0．98；T—HSV1一DP公式 Y=一3．087 385X+39．833 443，R =0．99。两基因溶解曲线呈现 单峰(图2～3)。经荧光定量 PCR测定8 h和48 h不同药物组中 HSV一1一TK和 HSV1一DP的拷贝数(图 4，表 2)。 实验结果表明，病毒感染后 48 h，药物的保护作用不明 显。而病毒感染后 8 h，出现病毒基因拷贝数与药物浓度的量效 关系，药物降低了 HSV一1的 TK和 DNA多聚酶的 mRNA，从而 达到抗 HSV一1的作用。其 中板蓝根活性部位对 HSV一1一TK 基因 mRNA的抑制更为明显。因为前期制备药物量很少，实验 重复和后续试验尚有待于更深入和更充分展开 ，板蓝根活性成分 抗 HSV一1的分子机制仍存在疑问。 一 -1 I 【 - I I I 『 J 60 65 70 75 80 85 90 95 Temlz㈣ t⋯ (C) Detct SYBR Tm=60 0 well(s)A4 A5，B4 B5，c4一C5，D4一D5， E4一E5，F4一F 5，G4一G5，H4一H5 DO⋯ ent dw090703(St⋯ d rd CurVe) 图2 HSV一1TK定量PCR溶解曲线 f 『 』 1 7 Tem13 eratUre(C1 D●tt“ 。r sI8B T- 80 O t1l Etj 3^ B 3 c3 ， E F 3 ∞ D 0 cu_·n- d⋯ 30 0 (st·n d‘r a curv·1 图3 HSV1一DP定量 PCR溶解曲线 图4 8 h药物作用HSV—TK和 HSV1一DP拷贝折线图 表2 荧光定量 PCR测 HSV1两种基因拷贝数 4 讨论 板蓝根是 中国的传统中药，其性寒，入心、胃经，味苦，有清 热、解毒、凉血消肿的作用⋯，可抗炎 、治流感、流脑 、乙脑、热毒发 斑、咽肿等疾病 。板蓝根提取工艺较多 ，本实验采用多种方 法分离提取了22个部位成分 ，并进行筛选试验 ，从中找到2个部 位具有较明显的抗 HSV一1作用 。虽已有板蓝根抗 HSV的研 究 j，但使用本文方法分离的板蓝根活性成分抗 HSV一1分子机 制探讨国内外尚未见报道。 HSV一1自然感染率高，全世界总人 口中约 70％ 的人血清 HSV抗体 阳性，超过 1／3的人有复发性 HSV感染。无环鸟苷 (ACV)是治疗 HSV感染的首选药物，但随着 HIV感染的流行及 器官移植手术的普遍开展，HSV耐药株不断出现，同时在免疫功 能正常的人也出现了 HSV耐药株感染 ，因此寻找新的高效低 毒的抗疱疹病毒药物显得尤为重要。 本研究着重探讨 HSV一1感染 Vero细胞后 ，板蓝根活性成分 体外抗病毒的作用机制。通过 MTT法研究受 HSV一1感染细胞 的活性，初步确定提取药物保护细胞，抑制病毒生物合成。TK和 DNA多聚酶是 HSV一1的即刻早期基因，具有控制病毒复制的关 键性作用。通过实时定量 RT—PCR，发现药物作用 8 h，TK和 · 398· DNA多聚酶的 mRNA拷贝数都较病毒对照组低，特别是对 TK基 因转录的抑制更为明显。推测板蓝根分离成分可能对早期 HSV 一 1的 DNA复制具有抑制作用 ，在防控病毒感染的初期具有更 好的效果，这也与体内动物实验结果相符。但药物是否以病毒复 制酶为作用靶点而抑制病毒感染尚无法定论 其直接作用于 HSV 一 1还是通过激活细胞发挥拮抗病毒的效应值得深入探讨。 参考文献： [1] 中华人民共和国卫生部药典委员会．中国药典，I部[S]．广州：广 东科技出版社，1995：171． [2] Shin EK，Kim DH．The Anti—Inflammatory Effects of a Methanolic Ex- tract from Radix 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