细胞DNA定量分析的其它用途

细胞DNA定量分析的其它用途 细胞DNA定量分析的其它用途 细胞DNA定量分析早期诊断肺癌 常规痰细胞学检查诊断肺癌敏感性很低 ​ 肺癌发达国家中病死率最高 ​ 没有广为接受的进行筛查及早期诊断 ​ 常规痰细胞学检查仅能得到10%--23%的阳性结果，即使是最有经验的细胞学医师，阳性率只可能达到20%--30%。 常规痰细胞学检查和DNA定量分析的比较性研究 ​ 痰标本来自833个体，其中 ​ 肺癌177例 ​ 非典型增生98例 ​ 无异常发现者558例 ​ 标本来自5个不同城市的7家医院 ​ 临床诊断 ​ 无异常发现：至少胸部x光检查正常 ​ 肺癌 非典型增生者均由病理学检查证实 ​ 双盲法分组研究，评估常规法、DNA定量法和两种方法联合使用可检出的痰细胞中 细胞DNA定量分析能提高肺癌的检出率 常规细胞学 敏感性 特异性 DNA定量分析 敏感性 特异性 腺癌 14% 90% 60% 90% 早期腺癌 14% 90% 45% 90% 细胞DNA定量分析早期诊断肺癌标本种类 ​ 痰 ​ 支气管灌洗物和刷取物 细胞DNA定量分析系统检测胸腹水中的癌细胞 腹水细胞学检查鉴别癌性和炎性腹水 ​ 腹水细胞学检查在鉴别癌性腹水和炎性腹水中起着关键性作用 ​ 63例腹水标本被包括在研究中 ​ 50~100ml腹水经离心后制片，巴氏和DNA染色 ​ 每例至少有4000个腹水细胞核接受DNA定量分析 细胞DNA定量分析用于炎性和癌性腹水的鉴别诊断 较常规细胞学方法更客观、敏感 腹水性质 例数 炎性细胞（%） 2倍体细胞（%） 异倍体细胞（%） 炎性腹水 急性炎症 4 46.8±6.6 46.0±8.0 0.4±0.1 慢性炎症 7 46.0±1.6 74.0±18.0 0.5±0.8 结核性 15 8.8±1.1 76.0±3.8 0.6±0.2 癌性腹水 恶性间皮瘤 4 5.8±1.0 66.0±11.0 3.4±1.6 转移性肿瘤 33 4.8±1.0 72.0±3.9 9.7±1.0 对炎性和癌性腹水的正确诊断率 炎性腹水 癌性腹水 常规细胞学检查 88% 84% DNA定量分析 100% 92% 细胞DNA定量分析的其它用途 ​ 使用细胞DNA定量分析对消化道、泌尿道、口腔及咽喉的脱落细胞进行肿瘤的诊断也已经获得令人满意的结果 ​ 乳腺包块和甲状腺包块的细针穿刺物也是DNA定量分析的合适标本 核酸检测技术 基本概念 定义：通过检测与疾病相关的DNA或RNA来检测和诊断疾病 简史：核酸检测技术是分子诊断领域中的重要组成部分，经历了前多聚酶链（PCR）期，PCR期和后PCR期。 核酸技术的发展过程 分期 时段 主要技术平台 前PCR期 1976-1985 核酸杂交技术 PCR期 1985-1995 PCR扩增技术 后PCR期 1995-今 DNA芯片等高通量技术 最活跃的几大领域： ​ 传染病和感染性疾病 ​ 各种病原的检测、耐药基因检测及分子流行病学调查 ​ 血液病学和肿瘤学 ​ 早期诊断、确诊、转移和复发的监测，预警，预后推测、耐药基因推测及化疗效果评估等 ​ 遗传病 ​ 家谱分析、诊断及遗传趋势分析等 ​ 鉴定试验 ​ 亲缘鉴定、移植物抗宿主免疫反应监测，刑事证据学等。 多聚酶链反应—PCR 基本原理：多聚酶链反应是一项根据DNA互补原理，使用耐热DNA聚合酶催化由引物起始链延长反应而复制新DNA分子的体外核酸扩增技术。PCR反应的精髓是在短时间内扩增出大量的特定DNA片片断。 ３０个 1~3小时 扩增 循环 十亿个扩增产物 PCR的使用引起病原学检测的一场革命： ​ 引起人类感染的病原仅有5%可以通过人工培养等常规方法进行检测 ​ 以PCR和杂交技术为代表的分子诊断技术有望检测其它95%的感染病原 PCR是目前检测感染病原的最敏感技术 人类乳头状瘤病毒的检测 人类乳头状瘤病毒 人类乳头状瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）是一组包括100余个亚型的DNA病毒，很多亚型与皮肤粘膜的良性及恶性病变有关。在人类生殖道已经分离和鉴定出40余个亚型，其中至少有15个亚型被确定与宫颈癌密切相 关，他们被称为高危人类乳头状瘤病毒（High Risk HPV, 简称HRHPV） 人类乳头状瘤病毒与宫颈癌 人类乳头状瘤病毒是最先被确定的致癌病毒之一，主要引起生殖道和肛门癌。持续携带HRHPV诱发宫颈癌的病理学现象已经被广泛接受，而分子检测技术的使用证实5～20％女性携带HRHPV, 35岁以上的女性多为持续携带，而HRHPV也与宫颈癌恶性变的程度密切相关。因此，在英、美等发达国家，HPV的检测已经成为宫颈癌普查常规的一部分，HRHPV的检出被作为宫颈癌预警、监测、早期诊断及病情进展的重要指标。 高危亚型人类乳头状瘤病毒与宫颈癌细胞形态分期的关系 细胞形 态分形 例数 HPV（％） HRHPV（％） HRHPV： LRHPV 正常和良性变（CIN0） 402 196 （48.8） 150 （83.3） 5:1 轻度不典型增生（CIN1） 199 133 （66.8） 109 （88.6） 8:1 重度不典型增生（CIN2） 119 119 （93.3) 103 (96.3) 26:1 原位癌（CIN3） 147 144 (97.9) 139 (99.3) 139:1 总计 864 581 (67.2) 501 (91.1) 10:1 资料来自于对1699例在宫颈癌普查中发现或怀疑细胞学异常者中的864例进行的人类乳头状瘤病毒检测和病理学诊断的平行研究 人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作用 1、大量的研究表明在两年之内，近30％的HRHPV携带者可发展为轻或重度不典型增生，而仅有3％的低危亚型(LRHPV)携带者发生相应的变化。 2、60～70％宫颈细胞学检查正常的HRHPV携带者，在四年内可出现宫颈细胞检查异常。 3、连续两次HRHPV检测阴性者, 在2～4年内一般不会出现宫颈细胞学检查异常。 万盖得建立的宫颈癌预警－监测－早期诊断系统 建立多重PCR技术检测全部15个HRHPV，用DNA定量分析进行宫颈细胞学检查。HPV检测可以筛选出潜在的宫颈癌高发人群，对这一人群定期进行HPV检测和DNA定量分析将极大地提高宫颈癌的早期检出率，从而提高治愈率。该系统基本如下： 宫颈标本采集、送检注意事项 1.​ 与万盖得门诊部联系，领取配套的宫颈刷、固定液及标本管等取材必备物品。 2.​ 以宫颈外口为圆心，用宫颈刷轻轻刷取3～5周，不要过分用力以免损伤引起出血。若白带过多，应先用无菌干棉球轻试去，再刷取标本。（见图） 3.​ 刷取完毕后用镊子将刷头取下放入盛有10ml固定液的标本收集管内，使细胞样品存留在固定液中。 4.​ 填写申请单，将条形码分别贴在标本管和申请单上。 5.​ 标本收集管请放置于阴凉避光处保存。当室温超过30℃，请放在冰箱内（4℃）保存。 6.​ 完成上诉步骤后，通知万盖得物流部完成标本运送过程。 7.​ 多重PCR检测人类乳头状瘤病毒（HPV）可以与DNA定量分析共用同一液基标本，也可单独采集宫颈分泌物送检。 慢性生殖道感染和性传播疾病病原检测 慢性生殖道感染和性传播性疾病 ​ 是一组全球范围内非常多见的疾病 ​ 美国每年有120万性传播疾病新发病例 ​ 每年全球有超过2000万例新发生的生殖道溃疡性疾病（也称软性下疳） ​ 国内在过去20年中发病率明显上升，但缺乏系统的发病率和流行病学统计资料 ​ 是一组可预防和可控制的疾病 ​ 行为改变：可减少被感染和感染他人的机会 ​ 生物医学介入：明确的诊断和恰当的治疗可治愈病人并减少传染来源 引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原 细菌和寄生虫类：沙眼衣原体、淋病奈瑟球菌、苍白密螺旋体、杜克嗜血杆菌、解脲支原体、生殖道支原体及阴道毛滴虫等 病毒类：1型和2型艾滋病毒（HIV-1和HIV-2），1型和2型单纯胞疹病毒（HSV-1和HSV-2），人类乳头状瘤病毒(HPV)，乙型肝炎病毒（HBV）及巨细胞病毒(CMV)等 对两组疾病的诊断困难造成对发病率统计的困难 ​ 较高比例的病人无明显临床症状 ​ 绝大多数病人无特异性症状 ​ 一定比例的病人为混合感染 ​ 对多数病原缺乏可靠的实验室诊断方法 可选择的实验检测方法及优、缺点 ​ 直接涂片镜检：简便快捷但缺乏敏感性 ​ 人工培养：中等敏感性、高度特异性，仅部分病原可人工培养 ​ 非扩增法 ​ 血清学抗体检查：回顾性 ​ EIA抗原抗体检查：中等敏感度，仅为回顾性 ​ 直接荧光抗体检查：中等敏感度 ​ DNA探针检查: 中等敏感度 ​ 分子扩增法：高度敏感和特异性，正成为很多病原检测的金，需分子技术支持 分子扩增技术的应用促进了对性传播疾病的了解 以沙眼衣原体为例，多聚酶链反应（PCR）为主体的分子检测技术提供了如下信息： ​ 发病早：在年轻人群开始发病，女性为15-19岁；男性为20-24岁 ​ 携带率高：人群中平均沙眼衣原体携带率为3-5%，美国育龄妇女携带率可高达25% ​ 性传播疾病患者中的高检出率：因性病就诊者中20%可查出沙眼衣原体 ​ 无症状携带者构成主要传染源：80%女性和50%男性感染沙眼衣原体者无临床症状 PCR已成为检测性病病原的金标准 沙眼衣原体不同检测技术的比较 方法 敏感性 特异性 培养法 70%-80% 100% 直接荧光抗体 70%-80% 约100% EIA 70%-80% 约100% 探针杂交 70%-80% 约100% PCR 100% 约100% 万盖得开发的多重PCR技术检测性传播疾病病原 病原选择： 被测病原 临床和实验室特征 淋病奈瑟球菌 全世界每年约有7800万新发病例，最优化的培养条件可达80~95%阳性率 沙眼衣原体 占非淋病性病的30~50%，培养阳性率低 生殖道支原体 新确定的性病病原，无法人工培养 解脲支原体 人工培养生长缓慢，也引起新生儿呼吸道及中枢神经系统感染 杜克嗜血杆菌 新确定的性病病原，无法人工培养 苍白密螺旋体 传统的性病病原，目前仍不少见 阴道毛滴虫 常见生殖道感染病原，每年全球约有1亿3千万新发病例，培养要求高，生长慢 万盖得多重PCR性病病原检测的方法学特征： ​ 两套引物确保检测结果的可靠性 ​ 第一套引物检测上述七种病原 ​ 第二套引物证实第一套引物扩增的阳性结果 ​ 敏感快捷 ​ 全部检测过程在24小时内完成 ​ 3×10-7ng的目的DNA可被测出 ​ 检测标本 ​ 女性：尿道和宫颈分泌物 ​ 男性：尿道分泌物和前列腺液 万盖得多重PCR性病病原检测的适用人群： ​ 性传播疾病的高危人群 ​ 冶游史者 ​ 性工作者 ​ 慢性泌尿生殖道感染人群 ​ 多数性病病原也可通过密切接触而发生慢性泌尿生殖系统感染 ​ 性病患者的性伴侣 ​ 婚前体检 ​ 筛查年轻的无症状携带者 ​ 防止婚后交互感染 脑脊液中病原的检测 中枢神经系统感染和诊断 重症中枢神经系统感染的病死率高，常规实验室诊断不能为临床提供有效支持。因此，需要新一代的实验诊断手段。如下原因造成常规检测方法的低敏感性： 1、​ 愈来愈多的病毒感染 2、​ 部分细菌性和多数病毒性病原不能用人工培养法检测 3、​ 采集标本前使用抗生素降低阳性检出率 人类疱疹病毒经常引起中枢神经系统感染 引起中枢神经系统感染的常见疱疹病毒如下： 1型和2型人类单纯疱疹病毒（HSV-1和HSV-2），带状疱疹病毒（VZV），巨细胞病毒（CMV），和EB病毒（EBV）。由于一些有效的抗病毒药已经用于临床，早期正确的诊断病毒性病原已经具有实际意义。 脑脊液中检测病毒的困难 ​ 传统试验诊断技术的局限性 ​ 活体脑组织中分离病毒阳性率仅为40%-60% ​ 脑脊液细胞培养的阳性率很低 ​ 脑脊液和血清ELISA病毒抗体检测阳性只能回顾性的证实感染曾经发生 ​ 脑脊液病毒抗原检测的敏感性还没有达到令人满意的程度 ​ 脑脊液病毒病原的分子检测 ​ 在英、美等发达国家PCR技术检测脑脊液中的病毒已被广泛接受 ​ PCR获得阳性结果的机会比传统法高88倍 PCR法检测脑脊液中疱疹病毒 （Mayo clinic, May1999-May2001） 病毒 检测例数 阳性例数 (%) 人类单纯疱疹病毒 1型 2型 带状疱疹病毒 巨细胞病毒 EB病毒 总计 12864 1079 1258 892 16093 522（4.0） 164（1.2） 358 (2.8） 128 (11.9) 28(2.2) 64(7.2) 742(4.6) 万盖得多重PCR检测脑脊液中的疱疹病毒 ​ 单管多重PCR同时检测7种疱疹病毒 ​ 人类单纯疱疹病毒1型和2型 ​ 带状疱疹病毒 ​ 巨细胞病毒 ​ EB病毒 ​ 人类疱疹病毒6型和7型 ​ 3×10-7ng的阳性对照DNA能被测出 ​ 最小标本需求量仅为200微升 细菌性中枢神经系统感染 ​ 细菌性脑膜炎仍为世界范围内的常见病 ​ 可为轻症，也可为重症致死性感染 ​ 单纯感染：病死率2～3％ ​ 伴中毒性休克：病死率高于50％ ​ 传统实验诊断的局限性 ​ 显微镜下观察：敏感性低 ​ 细菌培养：耗时长，阳性率低 ​ 免疫抗原检查：低敏感性 ​ 免疫抗体检查：“回顾性” PCR法检测脑脊液中病原明显优于传统方法 不同方法检测CSF中脑膜炎双球菌的比较 方法 标本数 　　　　　 阳性检出结果 　　 　　　　 用抗生素前（％）　用抗生素后（％）　总计（％） 涂片镜检 73 　 16/47(34） 5/18(27) 　 22/73(30) CSF培养 73 　　 9/47(19) 2/18(11) 　 11/73(13） 血培养 103 　　 17/66(25) 6/28(21) 　 23/103(22) CSF PCR 56 　 31/33(93) 14/16(87) 50/56(89) 血PCR 80 　 31/51(60) 21/25(84) 56/80(70) 服用抗生素对PCR检查不造成明显影响 　　用抗生素后不同时间采集标本阳性检出结果（％） 方法 　＜12h 12~48h 48~72h 总计 培养 　 0/20(0) 0/8(0) 0/2(0) 0/31(0) 镜检 　 6/20(30) 3/8(38) 0/3(0) 9/31(29) CSF PCR 　 1719(89) 4/5(80) 2/3(67) 23/27(85) 血PCR 　 9/9(100) 4/9(44) 0/0(0) 13/18(72) 万盖得建立的多重PCR同时检测6种以上细菌病原 ​ 被检测的细菌性病原 ​ 脑膜炎双球菌、流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、无乳链球菌、嗜单核细胞李斯特菌和大肠杆菌 ​ 其他细菌 ​ 技术特征：分两步三组多重PCR扩增鉴定上述病原 呼吸道感染病原的检测 呼吸道感染是人类最重要的感染之一 ​ 肺炎在成人和儿童都是最常见的感染之一 ​ 在发展中国家，病死儿童中30％是由于呼吸道感染 ​ 典型和非典型性肺炎 ​ 典型肺炎：约2／3由肺炎双球菌引起 ​ 非典型肺炎病原包括：肺炎支原体，肺炎衣原体，军团菌，百日咳杆菌等 ​ 病毒正成为呼吸道感染的优势病原 ​ 70％儿童呼吸道感染 ​ 30％成人呼吸道感染 检测呼吸道感染病原存在着不同的困难 ​ 病原学诊断不能为流行病学和临床治疗提供足够的支持 ​ 在部份分子方法使用后，仍有50％的呼吸道感染无法检测到病原 ​ 常规监测技术的局限性 ​ 直接涂片：低敏感性（细菌）或无法检测（病毒） ​ 培养：生长缓慢（非典病原）或不能生长（部分病毒） ​ 血清学检查：低敏感性或“回顾性” PCR检测细菌性非典型肺炎病原明显优于常规法 125份标本中肺炎双球菌、流感杆菌和结膜莫拉菌检测的比较性研究 ​ 29％PCR和培养均为阳性 ​ 没有培养阳性而PCR阴性的现象 ​ 48％为PCR阳性但培养阴性 ​ 77％至少一种细菌可以被PCR检出 PCR和培养法检测百日咳、副百日咳杆菌 （532例） 标本总数 PCR阳性（％） 培养阳性（％） 532 67（12.6％） 17（3.2%) 万盖得多重PCR检测细菌性非典型肺炎病原 ​ 被检测的主要病原 ​ 肺炎支原体：仅次于肺炎双球菌的肺炎病源，暴发流行常可发生，培养需要5周，发病2－3周后血清学可呈阳性 ​ 肺炎衣原体：占社区获得性肺炎的10％，难以人工培养 ​ 军团菌：条件致病菌，主要见于免疫功能低下者，占社区获得性非典型的3－8％，侵袭力增加使病死率达到30％，培养困难 ​ 百日咳杆菌：主要见于尚未接种疫苗的新生儿，及成人因疫苗接种时间过长后抗体减少而发病，在美国，占儿童和成人非典型的5~10% ​ 可以被包括在内的其他病原：肺炎双球菌和流感嗜血杆菌 PCR是检测病毒性非典型肺炎病原的最好方法 ​ 一个代表性的研究 ​ 临床标本：1118份取自由呼吸道感染症状儿童的鼻咽腔吸出物 ​ 九重RT-PCR被使用检测病原，阳性为395例 ​ 结果 病原 腺病毒 肠病毒 流感病毒A 流感病毒B 副流感病毒1 副流感病毒3 呼吸道合胞病毒 肺炎支原体 肺炎衣原体 检出率％ 12.9 10.6 20.0 2.8 3.5 4.3 37.5 8.1 0.2 万盖得多重RT-PCR检测病毒性非典型肺炎病原 ​ 可以被检测的主要病毒 ​ 腺病毒：为DNA病毒，常见的47个人类亚型 ​ 肠病毒：人类最常见和最重要的病毒性病原之一，常见的27个血清型可被测出 ​ 流感病毒A和B：可以测出全部亚型 ​ 副流感病毒1和3 ​ 呼吸道合胞病毒：可以测出亚组A和B ​ 可以被包括在内的其它病原：肺炎支原体和衣原体