水酶法提取黄粉虫油工艺优化

食品与发酵工业 FOOD AND FERM ENTATION INDUSTR IES 166　　 2010 V o l136 N o 11 ( To ta l 265 ) 水酶法提取黄粉虫油工艺优化 张立佳 ,张建新 ,王临宾 (西北农林科技大学食品科学与工程学院 ,陕西 杨凌 , 712100) 摘 　要 　对碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解黄粉虫提取黄粉虫油的工艺条件进行了研究。在酶解时间、加酶 量、液料比、温度、pH五个单因素试验的基础上 ,以提油率为评价指标 ,利用响应面分析法优化了温度、加酶量、 pH等酶法提取黄粉虫油的条件。优化的工艺条件为 :酶解温度 50104 ℃,加酶量 799138 U /g (原料 ) , pH 8149, 液料比 5∶1,酶解时间 120 m in,此条件下提油率为 78151 %。水酶法提取黄粉虫油品质优于石油醚提取 ,采用 GC2MS法对黄粉虫油脂肪酸组成进行分析 ,共检出 18种脂肪酸 ,其不饱和脂肪酸含量高达 76122 %。 关键词 　黄粉虫油 ,水酶法 ,脂肪酸 , GC2MS 第一作者 :硕士研究生 (张建新教授为通讯作者 )。 收稿日期 : 2009 - 08 - 14,改回日期 : 2009 - 11 - 06 　　黄粉虫 ( Tenebrio m olitor1L inneeus)别名面包虫 , 属节肢动物门 ,昆虫纲 ,鞘翅目 ,拟步行虫科 ,粉虫属 , 属于完全变态昆虫 ,含丰富的脂肪 [ 1 ] ,是优良的油脂 来源。目前 ,黄粉虫已形成规模化养殖 ,黄粉虫油的 开发利用是黄粉虫资源综合利用的重要组成部分 ,也 是提高黄粉虫附加值的有效途径。 昆虫油脂中不饱和脂肪酸含量较高 [ 2 ] ,大部分 昆虫中不饱和脂肪酸是饱和脂肪酸的 215倍以上 ,在 某种程度上 ,昆虫油脂的脂肪酸组成接近于鱼油 [ 3 ]。 相关研究明 ,昆虫油脂多为软脂酸和不饱和脂肪 酸 ,消化性能好 ,微量元素丰富 ,含糖量低。因此 ,昆 虫油脂脂肪酸无论是在量上还是在质上都具有巨大 的开发和利用价值。目前对黄粉虫的研究主要集中 于蛋白质和氨基酸的提取 [ 4 ] ,对黄粉虫油的研究较 少 ,其中酶法提取黄粉虫油的研究未见报道。本研究 以黄粉虫为原料 ,对碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合提取 黄粉虫油的工艺条件进行优化 ,并分析了黄粉虫油的 脂肪酸组成 ,为黄粉虫油的开发利用提供依据。 1　材料与方法 111　材料与试剂 原料 :黄粉虫幼虫 ,陕西秦虫黄粉虫科技发展有 限公司提供。 试剂 :碱性蛋白酶 (10 000 U /g)、胰蛋白酶 ( 250 U /mg) 由西安润德生物技术有限公司生产 ;其他试 剂均为分析纯。 主要仪器与设备 : FA2004分析天平 (北京赛多利 斯仪器系统有限公司 ) ; DF2101S集热式恒温加热磁 力搅拌 (郑州长城科工贸有限公司 ) ; PHS22酸度计 (上海第二分析仪器厂生产 ) ; KDC240低速离心机 (科大创新股份有限公司中佳分公司 ) ; Thermo Finni2 gan TraceDSQ 气相色谱 2质谱联用仪 (美国 Thermo Finnigan公司 )。 112　方法 11211　粗脂肪测定 参照 GB /T5512 - 1985。 11212　油脂品质分析 [ 5 ] 碘值测定 :参照 GB /T5532 - 1985;酸价测定 :参 照 GB /T5530 - 1985;过氧化值测定 :参照 GB /T5538 - 1995;皂化值测定 :参照 GB /T5534 - 1995。 11213　脂肪酸组成的测定 GC2MS分析 :采用 Thermo Finnigan TraceDSQ气 相色谱 2质谱联用仪。GC条件 : DB 2WAX弹性石英毛 细管柱 30 m ×0125 mm ×0125μm;载气为高纯氦气 , 恒流模式 ,流速 110 mL /m in;程序升温 150℃ ( 210 m in ) 6℃ /m in 230℃ (15 m in ) ,进样口 230℃,传输线 230℃;进样量 1μL,分流比 80: 1。MS条件 : E I离子 源 ,离子源温度 250℃,电子能量 70eV,电流 100μA, 电子倍增器 114 kV,溶剂延迟 210 m in ,全扫描方式 , 扫描范围 40 - 400amu。 11214　提油率 提油率 /% = A B ×C ×100 式中 : A—提取的黄粉虫油质量 ( g) ; B —黄粉虫 的质量 ( g) ; C—黄粉虫中粗脂肪的质量分数 ( % )。 11215　黄粉虫油提取工艺 黄粉虫幼虫 →烘干 →粉碎 →调液料比 →升温 → 分离与提取 2010年第 36卷第 1期 (总第 265期 ) 167　　 调 pH→加酶 →调 pH恒定酶解 →灭酶 游离油 Ⅰ ↗ →离心 →乳状液→冷冻破乳→游离油 II ↘ 酶解液 →喷雾干燥 →黄粉虫蛋白粉 11216　酶解工艺要点 黄粉虫幼虫 60 ℃烘干 12 h后粉碎备用。称取 10 g粉碎好的原料 ,按一定的液料比加入蒸馏水 ,于 恒温磁力搅拌器内升温到设定温度后调 pH,然后加 入适量酶 ,酶解过程中维持 pH恒定 ,酶解完后 95 ℃ 加热灭酶 10 m in, 4 000 r/m in离心 15 m in后得到上 层游离油 I、乳状液、酶解液及残渣。分别取出游离 油 I和乳状液 ,乳状液在 - 18 ℃冷冻 20h破乳 [ 6 ] ,离 心得到游离油 II,合并游离油 I、II即为提取的黄粉虫 油质量 ,重复 2次。 11217　单因素实验 1121711　酶解时间对提油率的影响 选择液料比 5∶1、加酶量 600 U /g原料、加入的 碱性蛋白酶与胰蛋白酶活力比为 1∶1 (下同 )、温度 55 ℃、pH 810、搅拌速度 200 r/m in,酶解时间分别为 30、60、90、120、150、180 m in进行酶解。 1121712　加酶量对提油率的影响 液料比 5∶1、温度 55 ℃, pH 810、搅拌速度 200 r/m in、酶解时间 120 m in,加酶量分别为 200、400、 600、800、1 000、1 200 U /g(原料 )进行酶解。 1121713　液料比对提油率的影响 加酶量 600 U /g (原料 )、温度 55 ℃、pH 810、搅 拌速度 200 r/m in、酶解时间 120 m in,液料比分别为 3 ∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1进行酶解。 1121714　温度对提油率的影响 液料比 5∶1、加酶量 600 U /g (原料 )、pH 810、搅 拌速度 200 r/m in、酶解时间 120 m in,酶解温度分别 为 45、50、55、60、65 ℃进行酶解。 1121715　pH对提油率的影响 液料比 5∶1、加酶量 600 U /g(原料 )、温度 55 ℃、 搅拌速度 200 r/m in、酶解时间 120 m in,酶解 pH分别 为 7、715、8、815、9进行酶解。 11218　中心组合试验 选择液料比 5∶1,加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶的 活力比为 1∶1,酶解时间 120 m in,在单因素试验的基 础上 ,选择温度、加酶量、pH三个主要影响因素为试 验因子 ,采用中心组合试验 (CCD )优化水酶法提取 黄粉虫油的条件。中心组合试验因素水平见表 1。 表 1　中心组合试验因素水平表 编码 因素 水　平 - 11682 - 1 0 1 11682 X1 温度 /℃ 461591 50 55 60 631409 X2 加酶量 /U·g - 1 (原料 ) 〕 2631461 400 600 800 9361359 X3 pH 71159 715 810 815 81841 11219　数据处理 采用 Design - Expert 710软件分析。 2　结果与分析 211　单因素实验 21111　酶解时间对提油率的影响 由图 1可知 ,提油率随酶解时间的增加而增大 , 酶解时间达到 120 m in后提油率变化不大 ,水酶法提 油过程中酶解时间过长会使乳状液趋于稳定 ,破乳困 难 ,对提油不利 [ 7 ]。综合考虑提油效果和经济因素 , 酶解时间以 120 m in为宜。 21112　加酶量对提油率的影响 由图 2可以看出 ,提油率随酶用量的增加而增 大 ,当加酶量达到 600 U /g (原料 )时提油率增长缓 慢 ,考虑到生产成本 ,加酶量应选择 600 U /g(原料 )。 图 1　酶解时间对提油率的影响 21113　液料比对提油率的影响 由图 3可以看出 ,随着液料比的增大提油率逐渐 增加 ,当液料比为 5∶1时提油率最大 ,继续增大液料 比提油率下降。液料比较小时 ,过高的底物浓度对酶 产生抑制而降低酶解效果 ,影响油脂的释放 ,提油率 低 ;液料比较大时则因底物浓度过小会降低酶的作用 食品与发酵工业 FOOD AND FERM ENTATION INDUSTR IES 168　　 2010 V o l136 N o 11 ( To ta l 265 ) 图 2　加酶量对提油率的影响 效果 ,同时还会对后续分离产生影响。因此 ,适宜的 液料比为 5∶1。 图 3　液料比对提油率的影响 21114　温度对提油率的影响 由图 4可知 ,提油率随温度升高而增大 ,当温度 达到 55 ℃时提油率最大 ,此时达到了酶的最适作用 温度 ,当温度超过 55 ℃提油率下降 ,温度过高使酶的 活性降低 ,所以适宜温度为 55 ℃。 图 4　温度对提油率的影响 21115　pH对提油率的影响 由图 5可知 ,提油率随 pH增加而增大 ,当 pH达 到 810时 ,提油率最大 ,此时达到了酶作用最适 pH, 当 pH为 815时 ,提油率有所下降 ,继续增大 pH酶活 性降低 ,提油率迅速下降 , pH以 810为宜。 图 5　pH对提油率的影响 212　水酶法提取黄粉虫油的工艺优化 选择液料比 5∶1,加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶的 活力比为 1∶1,酶解时间 120m in,在单因素试验的基 础上 ,以温度、加酶量、pH为试验因子 ,采用中心组合 (CCD)优化水酶法提取黄粉虫油的条件。中心 组合设计及试验结果见表 2。 表 2　中心组合设计及试验结果 试验 编号 自变量 X1 (温度 ) X2 (加酶量 ) X3 (pH) 响应值 Y 试验值 /% 预测值 /% 1 - 1 - 1 - 1 70140 70125 2 1 - 1 - 1 69156 68119 3 - 1 1 - 1 76124 75153 4 1 1 - 1 73192 73146 5 - 1 - 1 1 73120 72193 6 1 - 1 1 70140 70186 7 - 1 1 1 78132 78120 8 1 1 1 75156 76114 9 - 11682 0 0 72100 72192 10 11682 0 0 68180 69145 11 0 - 11682 0 68120 68174 12 0 11682 0 77144 77162 13 0 0 - 11682 71128 72163 14 0 0 11682 77176 77113 15 0 0 0 72104 71118 16 0 0 0 70185 71118 17 0 0 0 71124 71118 18 0 0 0 72118 71118 19 0 0 0 71116 71118 20 0 0 0 70159 71118 　　以提油率为固定变量 Y, 温度 ( X1 )、加酶量 (X2 )、pH (X3 )为因变量 ,经过统计分析得到的数学 模型为 : Y = 0171 - 01010 X1 + 01026 X2 + 01013 X3 - 01002 X1 X2 - 01003 X1 X3 + 010001 X2 X3 - 01002 X1 2 + 01007 X2 2 + 01011 X3 2 ,模型方差分析结果见表 3。 表 3　回归方程的显著性检验 方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值 Pr > F 复相关系数 模型 失拟 残差 总和 9 5 10 19 01017 01000 58 01000 79 01017 01001 801000 1201000 079 231302186 < 01000 13 301136 5 01954 5 分离与提取 2010年第 36卷第 1期 (总第 265期 ) 169　　 　　3 3 显著性在 1%水平 ;显著性在 5%水平。 　　由表 3可知 ,失拟不显著 ( P = 01136 5 > 0105) , 模型达到极显著 ( P < 0101)。模型的复相关系数为 01954 5,说明该模型能够解释 95145%响应值的变 化 ,拟合程度良好 ,实验误差小 ,可以用此模型对黄粉 虫油提油率进行分析和预测。模型系数显著性检验 结果见表 4。 表 4　数学模型的回归系数及显著性检验 项 系数 F值 P值 常数项 0171 X1 - 01010 18147 01001 63 3 X2 01026 120149 < 01000 13 3 X3 01013 30196 01000 23 3 X1 2 - 01002 0150 01494 7 X2 2 01007 8170 01014 63 X3 2 01011 30146 01000 33 3 X1 X2 - 01002 0133 01579 1 X1 X3 - 01003 0191 01361 8 X2 X3 01000 1 01001 0 01975 2 　　3 3 显著性在 1%水平 ;显著性在 5%水平。 由表 4可知 ,模型中一次项的温度、加酶量、pH 及二次项中的 pH对提油率影响均达到极显著水平 ; 二次项的加酶量对提油率影响达到显著水平 ,交互项 的温度和加酶量、pH和加酶量、pH和温度对提油率 影响均不显著 ,交互作用在此不另做分析。各因素对 提油率的影响顺序依次为 :加酶量 > pH >温度。 Design2Expert软件优化后得到的最优工艺条件 为 :温度 50104 ℃,加酶量 799138 U /g (原料 ) , pH 8149,黄粉虫油的提取率达到 78155 %。在上述优化 的工艺条件下 ,经重复验证 ,油的提取率为 78151 % , 与预测值接近 ,拟和性好 ,表明了模型的有效性 ,回归 方程能反映各因素对提油率的影响。 213　水酶法与有机溶剂提取黄粉虫油的品质分析 对水酶法和溶剂法提取的黄粉虫油主要理化指 标进行测定 ,结果见表 5。 表 5　不同方法提取的黄粉虫油品质比较 方法 水酶法提取 石油醚 (30- 60℃)提取 提取条件 色泽 50℃提取 2 h 淡黄色透明 50℃回流提取 8 h 黄褐色透明 酸价 / (mgKOH·g - 1 ) 01716 21803 过氧化值 / (meq·kg- 1) 31817 61271 碘值 / ( g·kg - 1 ) 1 06214 1 04415 皂化值 / (mgKOH·g - 1 ) 197152 168109 由表 5可以看出 ,水酶法提取的黄粉虫油色泽优 于石油醚提取。酸价和过氧化值是评价油脂品质的 重要指标 ,水酶法提取的黄粉虫油过氧化值和酸价均 小于石油醚提取 ,油中只含有少量的游离脂肪酸 ,说 明水酶法提取黄粉虫油的过程中 ,油脂发生氧化酸败 的程度小 ,能够较好的保留油脂中的营养成分。水酶 法提取的黄粉虫油的碘值和石油醚提取相差不大。 用石油醚提取的黄粉虫油皂化值小于水酶法提取 ,表 明油中可能含有一些不皂化的杂质 ,在提取过程中随 油一起被石油醚提出。 通过以上比较可以看出 ,水酶法提取的黄粉虫油 品质好于石油醚提取 ,提取过程中能够较好的保留油 中的营养成分 ,无溶剂残留问题。 214　黄粉虫油脂肪酸组成分析 水酶法提取的黄粉虫油采用 GC2MS进行分析 , 结果见表 6。 表 6　黄粉虫油脂肪酸组成及相对含量 序号 保留时间 /m in 分子式 化合物名称 相对含量 /% 相似度 1 4139 C12 H24O2 月桂酸 0136 92 2 5151 C13 H26O2 十三烷酸 0108 90 3 6181 C14 H28O2 肉豆蔻酸 4139 93 4 7114 C14 H26O2 肉豆蔻烯酸 0143 87 5 8114 C15 H30O2 十五烷酸 0112 91 6 9164 C16 H32O2 棕榈酸 16130 94 7 9198 C16 H30O2 92十六烯酸 3147 95 8 10151 C16 H28O2 1, 102十六碳二烯酸 0136 90 9 10197 C17 H34O2 十七烷酸 011 90 10 11131 C17 H32O2 72十七烯酸 0114 89 11 12146 C18 H36O2 硬脂酸 1193 94 12 12184 C18 H34O2 油酸 43131 94 13 13147 C18 H32O2 亚油酸 27138 93 14 14103 C19 H36O2 22辛基环丙烷辛酸 0104 83 15 14125 C18 H30O2 亚麻酸 0187 88 16 15109 C20 H40O2 花生酸 0108 89 17 15138 C20 H38O2 花生一烯酸 0116 91 18 16107 C20 H36O2 11, 132花生二烯酸 0106 85 食品与发酵工业 FOOD AND FERM ENTATION INDUSTR IES 170　　 2010 V o l136 N o 11 ( To ta l 265 ) 　　由表 6可知 ,黄粉虫油中共检出 18种脂肪酸。 主要含有油酸、亚油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸和 92十六 烯酸 ,含量分别为 43131 %、27138 %、16130 %、4139 %、3147 %。 由结果可以看出 ,黄粉虫油中的不饱和脂肪酸含 量占总脂肪酸的 76122 % ,特别是其中的油酸和亚油 酸含量较高 ,分别为 43131 %和 27138 %。必需脂肪 酸亚油酸和亚麻酸占总脂肪酸的 28125 % ,不饱和脂 肪酸和必需脂肪酸含量高 ,是一种理想的具有保健价 值的食用油资源 ;油酸、亚油酸还可应用于日用化工 及医药等领域 [ 8 - 9 ]。因此 ,黄粉虫油的开发利用有着 广阔的前景。 3　结论 (1)采用中心组合设计分析了影响酶法提取黄 粉虫油的因素 ,优化的工艺条件为 :温度 50104 ℃,加 酶量 799138 U /g原料 , pH 8149,液料比 5∶1,酶解时 间 120 m in,此条件下提油率为 78151 %。 (2)水酶法提取的黄粉虫油品质优于石油醚提 取 ,酶法提取黄粉虫油的过程中 ,油发生氧化酸败的 程度小 ,能够较好的保留油中的营养成分。 (3)采用 GC2MS法对黄粉虫油脂肪酸组成进行 分析 ,共检出 18种脂肪酸 ,其不饱和脂肪酸含量高达 76122 % ,油酸和亚油酸含量丰富 ,分别达到 43131 %和 27138 %。 参 考 文 献 [ 1 ]　杨兆芬 ,林跃鑫 ,陈寅山 ,等 1黄粉虫幼虫营养成分分析 和保健功能的实验研究 [ J ] 1昆虫知识 , 1996, 36 (2) : 97 - 1011 [ 2 ]　周琼 ,张健 ,侯东军 ,等 1昆虫功能性油脂的研究 [ J ] 1 粮油加工与食品机械 , 2003 ( l) : 37 - 391 [ 3 ]　刘晓庚 ,廖晓峰 ,徐明生 ,等 1昆虫油脂及其功能性成分 开发利用研究 [ J ]1粮食与油脂 , 2002 (2) : 24 - 271 [ 4 ]　吴福中 ,林华峰 ,刘志红 ,等 1中国黄粉虫产品开发利用 的现状及其对策 [ J ]1中国农学通报 , 2005 (8) : 72 - 751 [ 5 ]　卢艳杰 1油脂检测技术 [M ] 1北京 :化学工业出版社 , 2003: 107 - 2431 [ 6 ]　王瑛瑶 ,王璋 1水酶法从花生中提取油与水解蛋白的研 究 [ J ]1Food &Machinery, 2005 (21) : 17 - 201 [ 7 ]　Sengup T A R, Bhattcharyya D K1 Enzymatic extraction of mustardseed and rice bran[ J ]1Jam O il Chem Soc, 1996, 73 (6) : 687 - 6921 [ 8 ]　鲍万丽 1我国合成脂肪酸工业的发展与前景 [ J ]. 日用 化学工业 , 1990 (3) : 27 - 301 [ 9 ]　王景梓 ,徐贵发 1单不饱和脂肪酸与冠心病的关系 [ J ]. 食品与药品 , 2005, 7 (10A) : 21 - 231 O ptim iz ing Techn ique of Extracting Tenebrio m olitor1 L inneeus O il by Aqueous Enzyma tic M ethod Zhang L ijia , Zhang J ianxin,W ang L inbin (College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China) ABSTRACT　The p rocedure of extracting Tenebrio m olitor. L inneeus oil from Tenebrio m olitor. L inneeus by A lcalase and Tryp sin was studied. Based on single factor test including enzymatic hydrolyzing time, enzyme dosage, the ratio of water to material, temperature and pH, oil extraction yield as evaluation index, temperature, enzyme dosage and pH were studied for Tenebrio m olitor. L inneeus oil extraction by response surface methodology. The best conditions of aqueous enzymatic extraction of Tenebrio molitor. L inneeus oil are as follows: temperature of enzymatic hydrolysis 55 ℃, dosage of enzyme added 799. 38 U /g material, and the ratio of water to material 5∶1, pH 8. 49, time of enzymatic hydrolysis 120 m in. Under these conditions, the extraction rate is 78. 51 %. The quality of oil obtained by aqueous enzymatic method is better than thatwas obtained by petroleum ether. The oilwas determ ined by cap illary GC2MS, 18 compounds were identified, and the amount of unsaturated fatty acids reached 76. 22 %. Key words　Tenebrio m olitor1L inneeus oil, aqueous enzymatic method, fatty acids, GC2MS