HPV16型免疫胶体金诊断试纸条的制备

第24卷第2期 重庆理工大学学报(自然科学) 2010年2月 V01．24No．2 JournalofCbongqingUniversityofTechnology(NaturalScience) Feb．2010 -__●__-_--_-_Il●__l-__●I●I●-___ll_I_Illl_l_I■l●●●l-_l_●I__I____l_lIlIII●lI_●__-●-●IlII●_-_l●l__一 HPVl6型免疫胶体金诊断试纸条的制备 胡仁建，蔡家利，徐佳缘，张贵，梁晓媛，李夏庆，郭 萍，郑 洋 (重庆理工大学化学与生物工程学院，重庆400050) 摘 要：建立一种快速、准确、简便检测高危型人乳头瘤病毒16型的胶体金诊断试纸条，以 用于宫颈癌的早期筛查。用柠檬酸三钠还原法制备了酒红色的30am胶体金颗粒，胶体金颗粒 标记的单抗的实际标记量为6pg／mL。选用了2种稳定剂BSA和PEG20000获得了稳定的金标 抗体溶液。实验结果表明：第7种样品垫处理液和第7种结合垫处理液处理样品垫和结合垫组 装的试纸条效果最好；试纸务检测HPVl6E6蛋白为阳性，检测HPVl6L1蛋白为阴性。 关键词：人乳头瘤病毒16型；宫颈癌；胶体金；单克隆抗体；多克隆抗体；试纸条。 中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：1674—8425(2010)02一0034—06 PreparationofHPVl6ImmaneColloidalGoldDiagnosticStrip HURen-jian，CAIJia—li，XUJia—yuan，ZHANTGGui，LIANGXiao-yuan， LIXia—qing，GUOPing，ZHENGYang (SchoolofChemicalandBiologicalEnsineering，ChongqingUniversityofTechnology，Chongqing400050，China) Abstract：Arapid，accurateandeasycolloidalgolddiagnosticstripispreparedfordetectionofhi【gh— riskhumanpapillomavirustype16toscreencervicalcancerintheearlystage．The30nmcolloidal goldparticleswagpreparedbyTri—sodiumcitratereductionmethodandtheactuallabelingamountof McAbSis6u【s／mlbecausetwokindsofstabilizersBSAandPEG20000areusedtoobtainstablegold- labeledantibodysolutions．Testresultsshowthattheseventhkindliquidsofprocessingsamplepads andconjugationpadsarethebest；theseteststripsareusedtodetectHPVl6E6proteinaspositive， whileHPVl6L1proteinasnegative． Keywords：humanpapillomavirustype16；cervicalcancer；colloidalgold；monoclonalantibody； polyclonalantibody；teststrip HPv感染是宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和宫颈癌的明确病因‘¨。Mattheus‘23等报道，在99．7％的浸 润性宫颈癌中可以检测到13种高危型HPV，其中HPVl6(53％)、HPVl8(15％)等高危型的感染是引起 宫颈癌变的首要因素。 宫颈癌与高危型HPV感染关系密切，其自然病程有一个从宫颈上皮不典型增生到原位癌再到浸润 癌的一个连续发生、发展过程，大约有10年的时间，所以做好癌前筛查是防治宫颈癌的关键所在⋯3|。高 ·收稿日期：2009—1l—12 基金项目：重庆市教委科研项目“高危型人乳头瘤病毒免疫胶体金试纸条的研制”(KJ070615) 作者简介：胡仁建(1968一)，女，重庆人，高级实验师，主要从事微生物与生化药学研究。 万方数据 胡仁建，等：HPVl6型免疫胶体金诊断试纸条的制备 35 危型HPV感染可导致宫颈癌及宫颈癌前病变(CIN)，而持续性HPV感染与CIN病变进展的关系又甚为 密切，故高危型HPV检测对宫颈癌的早期筛查、防治及在预测CIN的自然转归、治疗后的随诊上都有重 要的作用H]。目前采用的HPV检测方法都有共同的局限：费时和操作程序复杂。本课组研制的高危 型人乳头瘤病毒16型免疫胶体金试纸条，能达到可在各级医院快速特异诊断高危型人乳头瘤病毒16型 感染的目的。 本实验选择的免疫胶体金层析【5。1(goldimmunochromatographyassay，GICA)是～种将胶体金标记免 疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在～起的固相标记免疫检测技术。免疫胶体金快速诊 断技术具有操作方便，易于判定，特异性好，灵敏度高，快捷迅速等优点，在检测样品时只需要5—10min 即可判断结果，因此可达到快速诊断的目的。 1与方法 1．1主要仪器及设备 磁力加热搅拌器，美国BIO—RAD生产；低温离心机，德国Sigma生产；电子天平，德国Sartorius生产； 超纯水器，美国Millipore生产；微量点样机，美国BIO．RAD生产；135硝酸纤维膜(NC)，美国Whatman 生产；玻璃纤维膜，美国Whatman生产。 1．2主要试剂 抗HPVl6E6蛋白单抗和多抗、兔抗鼠IsG抗抗体由笔者制备；氯金酸，国药集团化学试剂有限公司 出品；PVA，美国Sigma出品；PVP，美国Sigma出品；BSA，美国Roche出品；碳酸钾，中国成都化学试剂厂 出品；四硼酸钠，北京红星化工厂出品；柠檬酸三钠，美国Sigma出品。 1．3方法 1．3．130am胶体金颗粒的制备 据参考资料，本实验初步确定用30nm的胶体金，参照彭伏虎口1《胶体金试纸条检测H9亚型禽流感 病毒的研究》，取0．Ol％HauCL200mL倒入500mL平底烧瓶中，加热煮沸，快速加入3．6mL事先预热 至370C1％柠檬酸三钠，再加热15min，自然冷却至室温并补水至200mL，用0．1mol／L的K2CO，溶液调 pH值至8．2。 1．3．2待标记蛋白(抗HPVl6E6蛋白腹水型单抗)的纯化 用辛酸一硫酸铵法纯化单抗腹水13mL。 1．3．3用目测法确定抗HPVl6E6蛋白单抗的最适标记量 因待标记蛋白为单抗(见表1)，所以在将胶体金溶液的pH值调至8．2之后，分装9管，每管1mL，将 标记的单抗以0。005mol／LPh值为8．2的硼酸盐缓冲液系列稀释为1．25—30雌g／mL，分别取lmL加入 上列胶体金溶液中，混匀，对照管只加1Ml稀释液，5rain后，在上述各管中加人0．1mLlO％NaCl溶液，混 匀后静置2h，观察结果。 表l 待标记单抗体最适稳定量的确定 万方数据 36 重庆理工大学学报 1．3．4金标抗体的制备与纯化 将胶体金和单抗溶液分别以o．1mol／LK：CO，调pH值至8．2，取30mL胶体金溶液，在快速电磁搅 拌下，将4D4单抗溶液180Ixg缓慢加入胶体金溶液30Ml中，室温继续搅拌45rain，加入5％胎牛血清 (BSA)2．5mL，使BSA终浓度为o．4％，搅拌5min，分装，l500r／min，4。C离-t：,15min，弃掉沉淀，上清用 0．45p,m过滤器过滤除去聚合体后，在12000r／rain，4℃下离心30min，沉淀用含0．5％PEG20000的 0．005mol／LPBS(pH值为7．2)重悬沉淀至原体积，12000r／rain，4℃重复离心2次，用0．5mL含l％ BSA的2mol／L的硼酸缓冲液重悬沉淀，4℃保存备用。 1．3．5结合垫、样品垫处理液的选择 经过大量试验和文献资料，最后确定6种Ph值为7．5和1种pH值为7．4的结合垫处理液，如 表2所示。将结合垫(玻璃纤维膜)浸泡其中3h，烘干，喷样，观察结合垫释放金标抗体的效果。 表2结合垫处理液设计表 Na2840710H20／raM70 70 80 80 90 90 PVA／％0．10．2 0．2 O．2 0．1 0．1 Tween一20／％0．20．2 0．2 0．1 O．1 0．1 BSA／％0．30．3 0．3 0．3 0．3 0．2 pH7．4的PBS／(mmol／L)10 BSA／％ 2．O 吐温一20／％ 1．0 蔗糖／％ 2．5 PvP—lO 0．3 如表3所示，设计6种Ph9．6一10和1种pH7．4的样品垫处理液，将样品垫(玻璃纤维膜)浸泡其中 3h，烘干，组装试剂条后，观察样品液流速及非特异性反应程度。 表3样品垫处理液设计表 Na2B．0710H20／mM PVP／％ Triton—100／％ BSA／％ pH7．4的PBS／(mmol／L)10 BSA／％ 2．O 吐温一20／％ 1．O 蔗糖／％ 2．5 PVP一10 0．3 1．3．6结合垫、样品垫的预处理 将结合垫(玻璃纤维素膜)、样品垫裁剪成适当尺寸，浸泡在处理液中至少3h以上，37℃烘干(至少 16h)备用。 1．3．7金标抗体、单克隆抗体、兔抗鼠Igg喷涂量的确定 采用正交实验设计，如表4所示，评价指标是在检测阳性样本时检测线和质检线均清晰的出现。 1．3．8喷涂 将金标抗体、单抗、兔抗鼠IgG制成工作浓度，喷涂在结合垫和NC膜上，置37℃烘箱20一30min。 4℃保存。 姗 眈 呲 毗 啪 眦 吣 眦 Ⅺ 2 3 3 K m m m 加 眦 ¨ ¨ 0 2 2 3 7 m m m 0 l 2 3 7 m m 仉 万方数据 胡仁建，等：HPVl6型免疫胶体金诊断试纸条的制备 37 表4抗体喷涂量的正交试验设计表 0．5 O．75 1．O O．5 0．75 1．0 0．5 0．75 1．0 1．3．9免疫试纸条的组装 根据MQller—Bardoff法改进。整个测试条由2层吸水玻璃纤维、1层硝酸纤维素膜、吸水滤纸及白色 塑料垫板组成。将吸水纸、包被有多克隆抗体(检测线)及兔抗鼠IgG(对照线)的包被NC膜、喷涂玻璃 纤维(金标抗体)从上到下依次固定于白色塑料板上，裁切成O．4cm×5cm，与于燥剂一起装入铝箔袋 内，密封4℃贮存。 1．3．10检测方法 分别用HPVl6E6和HPVl6L1蛋白原液检测，滴在试纸条下端，反应10～15min 1．3．11评判 若在测试条上方仅出现l条红带，则表示为阴性；若在测试条上方出现2条红带，则表示为阳性：若 在测试条上方不出现红带，则表示测试条失效。 2 结果 2．1 待标记单抗最适稳定量的确定 本次实验目测法结果为：在单抗为1．25， 2．5，5和0恤g这4个管中出现蓝色沉淀，其余 的试管的颜色都没有改变，所以可以确定4IM 单抗的最适稳定量是5I山g／mL。在此基础上再 加上20％，即为稳定所需抗体的实际用量是 6斗g／mL。结果见图l。 2．2胶体金溶液的A，∞值测定结果 胶体金颗粒在波长510—550nm之间出现 最大吸收值峰。本次制备的30nm胶体金颗粒 的最大吸收值峰在520nm，用O．02mol／LpH 值为8．2的PBS液(含1％BSA，0．02％NaN，)将 胶体金蛋白试剂作l：20稀释，A跏=0．25左右。 ～般应用液的A锄应为0．2—0．4。 图1待标记单抗最适稳定量的确定 4 8 2 8 4 2 2 4 8 O O l 0 O l l 0 0 5 5 5 O 0 0 5 5 5 1 l 1 2 2 2 2 2 2 万方数据 38 重庆理工大学学报 2．3结合垫和结合垫处理液的选择 如图2，编号为Ⅶ的结合垫和样品垫处理液 浸泡过的玻璃纤维膜释放金标抗体的效果最好。 图2 不同缓冲液液浸泡过的结合垫释放金标抗体效果 2．4金标抗体、抗HPVl6E6蛋白多抗、兔抗鼠IgG喷涂量的确定结果 如图3所示，正交实验结果表明：4号效果最好，当稀释lO倍后，A，∞=0．60的金标抗体喷量为 2．0p,L／cm，兔抗HPVl6E6多抗(4．5mg／mL)喷量为0．8斗L／cm，兔抗鼠IgG(6．0mg／mL)喷量为 0．5p,L／cm时检测线、质控线最为清晰。 图3 3种抗体喷涂量的选择 图4 HPVl6免疫胶体金试纸条检测HPVl6E6 蛋白和HPVl6L1蛋白的结果 2．5 HPVl6免疫胶体金试纸条的检测结果 HPVl6免疫胶体金试纸条检测HPVl6E6蛋白时检测线和质控线都呈现红色，结果为阳性。检测 HPVl6L1蛋白时，只在质控线上出现红色，结果为阴性。如图4所示。 3讨论与展望 3．1胶体金颗粒的制备 本研究选择的免疫胶体金层析是一种将胶体金标记免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机 结合在一起的固相标记免疫检测技术。该技术涉及众多的实验参数，数据较多，工作量很大。胶体金标 记免疫检测技术涉及所用的玻璃器皿必须泡酸清洗得很洁净，否则影响实验结果。比如在制备金颗粒 时，三角锥瓶必须泡酸用超纯水清洗得很干净，否则制备的金颗粒溶液不呈亮的酒红色，而呈紫色，不是 好的金颗粒，会影响金标单抗的稳定性，从而影响试纸条的有效性。在加入l％的枸橼酸三钠时要迅速， 同时要搅拌，否则得到的金颗粒不均匀一致。好的金颗粒的获得为金标抗体的稳定性奠定基础。 万方数据 胡仁建，等：HPVl6型免疫胶体全诊断试纸条的制备 39 3．2金标抗体的制备和纯化 在用胶体金标记蛋白时，一定要确定最佳的pH值和最适抗体标记量，才能确保金标抗体的稳定性， 而金标抗体的稳定性直接影响试纸条的有效性和灵敏度等。本实验标记的蛋白是单抗，所以标记时的胶 体金颗粒和单抗的pH值均调至8．2，本实验通过目测法确定了最适单抗标记量为5斗g／mL，在实际标记 中增加了20％，所实际的标记量为6la,g,／mL。在标记时通过加入BSA和PEG20000两种稳定剂的比较， 发现选用含BSA和PEG20000的金标抗体更稳定。在纯化洗涤金标抗体时选用含PEG20000的pH值 为7．2的0．005moL／L的PBS更稳定，金标抗体稳定性时间的长短与试纸条的稳定性长短相关。 3．3样品垫和结合垫处理液的选择 不同的样品垫和结合垫处理液处理样品垫和结合垫后组装的试纸条在检测样品时，同一条件下释放 样品和金标抗体的效果不一样，实验发现第7种样品垫和结合垫处理液的配方最利于样品和金标抗体的 释放。 3．4金标抗体、多抗、兔抗鼠IgG的最佳喷涂量的确定 通过按照正交试验设计不同的金标抗体、多抗、兔抗鼠IgG喷涂量来喷涂，组装试纸条，然后检测试 纸条的有效性。比较后发现第4组的喷涂量较好。 3．5试纸条的组装 试纸条在组装时严格按照操作程序进行，才能保证其有效性。 3．6试纸条的有效性和特异性检测 通过检测HPVl6E6和L1蛋白，本试纸条只与HPVl6E6蛋白反应，与HPVl6L1蛋白不反应，显示该 试纸条具有较好的特异性。 3．7问题与展望 虽然本研究完成了高危型人乳头瘤病毒16E6的免疫胶体金试纸条的研制，检测HPVl6E6蛋白时可 以显色，但灵敏度只达7．5ng，不是很高，需要进一步优化实验条件。试纸条只是检测了HPVl6E6蛋白 阳性和HPVl6L1蛋白阴性，还需要检测500一l000例以上官颈癌患者的宫颈脱落细胞是否显色和检测 其他肿瘤蛋白是否显色。本研究的试纸条只是形成了HPVl6诊断试纸的基本生产，需要进行生工 艺和质量的研究、临床前和临床研究等，才能完成商品化的开发，所以仍有大量的后续工作。 参考文献： [1]BurdEM．Humanpapilomavirusandcervicalcancer[J]．ClinMicrobiolRev，2003，16：l一175． [2]Keating，InceT，CrumCP．SurrogatebiomarkersofHPVinfectionincervicalneoplasiascreeninganddiagnosis[J]．Adv AnatPathol，2001(8)：83—92． 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