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五氯酚钠诱导小鼠遗传损伤的研究

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五氯酚钠诱导小鼠遗传损伤的研究 950 中国公共卫生2004年8月第20卷第8期 Chin J Public Health Aug 2004 Vol. 20 No. 8 文章编号:1001-0580(2004)08-0950-03 中图分类号:R995 文献标识码:A 【实验研究】 五氯酚钠诱导小鼠遗传损伤的研究 魏雪涛,蒋建军,林静芳,张宝旭 摘 要:目的 观察不同剂量五抓酚钠(Na - PCP)在不同处理后引发小鼠体内免疫细胞的DNA链断裂损伤和 微核形成作用。方法 采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定ICR小鼠灌胃染毒0, 25, ...
五氯酚钠诱导小鼠遗传损伤的研究
950 中国公共卫生2004年8月第20卷第8期 Chin J Public Health Aug 2004 Vol. 20 No. 8 文章编号:1001-0580(2004)08-0950-03 中图分类号:R995 文献标识码:A 【实验研究】 五氯酚钠诱导小鼠遗传损伤的研究 魏雪涛,蒋建军,林静芳,张宝旭 摘 要:目的 观察不同剂量五抓酚钠(Na - PCP)在不同处理后引发小鼠体内免疫细胞的DNA链断裂损伤和 微核形成作用。方法 采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)分别测定ICR小鼠灌胃染毒0, 25, 50和100 m以掩后3和24 h脾细胞、胸腺细胞和巨噬细胞的DNA链断裂损伤。同时观察了连续灌胃染毒1个月,剂址分别为0,6.25,12.5和 25 mg/kg时脾细胞DNA链断裂损伤情况;微核试验观察染毒24和48 h骨髓嗜多染红细胞的微核形成。结果 在不 同剂量五抓酚钠染毒3h后,脾细胞出现DNA链断裂损伤的频率以及迁移距离在50和100 mg/kg组明显高于对照; 巨噬细胞在100 m以kg时出现明显的DNA损伤;但胸腺细胞在研究剂量范围内未见明显变化;染毒24和48 h后,所 有观察细胞均未出现明显的DNA链断裂损伤。五氛酚钠处理1个月未诱发脾细胞明显的DNA链断裂损伤。骨髓嗜 多染红细胞微核在研究剂量范围内未明显增高。结论 100 mg/kgNa- PCP可诱发小鼠体内脾脏细胞和巨噬细胞的 DNA链断裂损伤,50 m岁kg Na - PCP可诱导脾脏细胞DNA链断裂损伤,Na一PCP对胸腺细胞DNA损伤作用不明 显:Na - PCP连续1个月作用未诱导脾细胞出现明显的DNA链断裂损伤。25 --100 mg/ kg Na - PCP未诱导骨髓嗜多 染红细胞微核增加。 关锐词:五氛酚钠;免疫细胞;DNA链断裂;微核 Genotoxic damage induced by sodium pentachlorephen on mice WEI Xue-tao, JIANG Jian-jun,LIN Jing-fang, et al. Department of Toxicology, School of Public Health, Health Science Center of Peking University (Beijing 100083, China) Abstract: O讨ective To investigate DNA strand breaks and micronuclei induced by sodium pentachlorophen (Na一 PCP) in different phases and different dosages in viva.Methods Mice were treated through gavage with Na一PCP at a dose' of 0, 25, 50 and 100 mg/kg once time and 0, 6.25, 12.5 and 25 mg/kg for one month. Mice were sacrificed at the end of 3, 24 and 48 hours after once treatment or after one month treatment. DNA strand breaks were detected in the splenocyte, thy- mocyte, and macrophage through SCGE(Single Cell Gel Electrophoresis).At the same time after once treatment micronuclei in polychromatic erythrocyte in bone marrow were also detected. Results It was showed that 3一hours different dosages treatment of 50 and 100 mg/kg Na一PCP could induce DNA damage not only in the frequency of comet cell but also in the migration of DNA breaks in cells from spleen. Only 100 m岁kg Na一PCP could induce DNA damage in macrophage. In con- trast there was no change in cells from thymus in different dosage treatment and different treating period. Doring the research of different time一course study it was presented that 24一hour and 48一hour treatment was with no significant DNA strand breaks in each kind of cells. Na一PCP did not induce micronuclei in polychromatic erythrocyte under the condition of this as- say. Conclusion 50 and l00 mg/kg Na一PCP could induce DNA strand breaks in cells from spleen. 100 mg/kg Na一PCP could induce DNA strand breaks in macrophage. Thymus was insensitive to this kind of damage induced by Na一PCP and Na 一PCP did not induce the increase of micronuclei in polychromatic erythrocyte under the condition of this assay. Keywords: sodium pentachlorophen;immunocyte;DNA strand breaks; micronuclei 五氯酚钠(Na - PCP)是在世界范围被广泛使用的一种农 药,其对人类健康的影响引起了人们的普遍关注((i.2)。目前 对五抓酚钠遗传毒性研究的观点不一,Pavlica等(3)观察到斑 状贝暴露于大于等于80 ug/L五抓酚时DNA损伤明显增加。 斑状贝和大蜗牛暴露于10--450 pg/L五氯酚14d平均微核 率分别为0.69‘一7.500%(0)o Ziemsen等认为(5〕五氯酚 (PCP)在染色体水平并不诱导能够观察到的遗传损伤。DNA 链断裂损伤检测,是一种敏感的检测外源化学物对遗传物质 影响的方法。为了确定在一定染毒条件下,Na一PCP是否能 够对哺乳动物细胞在体内诱导DNA和染色体的损伤,进行 本项研究。免疫细胞对外源化学物诱导的损伤比较敏感,因 此,选择免疫细胞进行观察。 1 材料与方法 1.1 实验动物 ICR二级小鼠,雌性,6-10周龄,体重22- 作者单位:北京大学公共卫生学院毒理学系,北京100083 作考简介:魏雪涛(1969一),男,甘肃人,讲师,硕士,主要从事免疫毒 理学的研究。 24 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有动 物均食用由中国医学科学院实验动物部提供的饲料,自由饮 水、进食。 1.2 小鼠染毒方式及荆1 以灌胃的方式给小鼠染毒,剂量 分别为。,25,50和100 mg/kg五抓酚钠,分别于染毒后3,24 和48 h处死,进行检测;重复染毒的采用0, 6.25, 12.5和25 mg/kg五抓酚钠连续灌胃1个月,然后进行检测。 1.3 脏器单个细胞慈液的制备 将小鼠颈推脱臼处死,先用 Hanks'液冲洗腹腔,获取巨噬细胞,直接制备成细胞悬液备 用;然后取脾脏和胸腺,剥去结缔组织,置于盛有Hanks液的 平皿中,用塑料针芯将脏器在200目的不锈钢网中轻轻研磨, 即成单细胞悬液。 1.4单细胞凝胶电泳 参照5ingh (e7的方法,将单细胞悬液 与等量1%低熔点琼脂糖混合,包埋在磨沙载玻片上,制成凝 胶板,再将胶板裂解、解旋、电泳、中和,最后用碘化丙陡染色。 在荧光显微镜上,使用590 run的绿色激发光进行观察。记数 每100个细胞中出现的彗星细胞数以及彗星细胞的头长和尾 万方数据 中国公共卫生2004年8月第20卷第8期 Chin ,/ Public Health Aug 2004 Vol. 20 No. 8 951 长。 损伤细胞核出现的DNA片段泳动长度(迁移距离)来看,高剂 1.5 徽核试脸 将小鼠颈椎脱臼处死,剥离股骨,用小牛血 量组的损伤最为严重,且同样表现为中、高剂量组(分别为 清冲洗骨位腔,蘸取冲出的骨髓推片,自然干燥后用甲醇固 3.01和5.31 jcm)比对照组有明显的升高。对于巨噬细胞仅 定,Giemsa染色,流动水冲洗后晾干,阅片时计数1 000个多 在 100 mg/掩 组发现其出现 DNA链断裂损伤的频率 染红细胞,记录有徽核的细胞数。 (14.8%)和DNA片断迁移距离((7.01 lcm)均较对照组明显升 1.6 数据处理及统计分析 DNA链断裂损伤指标采用单因 高,表明出现明显的DNA损伤。对于胸腺细胞,在本研究条 素方差分析,小鼠骨髓多染红细胞微核试验采用泊松分布进 件下未观察到五抓酚钠诱导其出现DNA链断裂损伤。 行检验,使用SPSS软件在微机上完成。 2.2 不同荆贡五氛酚钠染毒后不同时问,各种细胞DNA链 2 结果 断v 4m伤情R(表2) 五抓酚钠染毒后3h,在 50和 100 2.1 不同荆全五氛酚钠染毒后3h不同细胞DNA链断裂损 mg/ kg剂量下能够诱导脾细胞出现明显的DNA链断裂损伤, 伤情%X,(表1) 由表1可见,五氛酚钠染毒3h后,在50和 随着时间的延长,在染毒后24和48 h,脾细胞的DNA链断裂 100 m以kg组小鼠脾脏细胞出现DNA链断裂损伤的细胞频 损伤情况与对照组没有明显的差别,即已经恢复到正常水平。 率与对照组相比明显升高,分别达到6.0%和9.4%,而且从 未出现明显的DNA链断裂损伤。 表1 五氮酚钠染毒后3h各脏器细胞DNA链断裂的情况(牙土:〕 Na一PCP (mg/kg) 彗星细胞(%) 迁移距离(Jim) 脾脏 胸腺 巨噬细胞 0.5土0.6 2.8土2.2 7.8士1.7 14.8士10.2 脾脏 胸腺 巨噬细胞 0.2士0.4 0.4土0.5 0.06士0.13 0.18 1 0.27 0.28士0.32 2.8士1.0 0.4士0.9 1.14士0.46 0.09土0.20 1.29士1.12 50 100 6.0士2.8' 9.4士3.8' 0.4士0.5 3.01士1.63 0.16士0.23 3.22士0.67 1.0士1.0 5.31士2.47' 0.4910.46 7.01士4.48' 注:与对照比,k P<0.01;动物数=4-5 表2 五抓酚钠染毒后不同时间脾细胞DNA链断裂的情况(牙1s) Na一PCP (mg/kg) 彗星细胞(%) 迁移距离(Am) 24 h 48 h 24 h 48 h 0.2士0.4 0.5士0.6 0.2士0.5 0.06士0.13 0.19土0.22 0.08士0.15 2.8士1.0 0.2士0.5 0.8士1.0 1.14士0.46 0.081 0.15 0.29土0.40 6.0士2.8 0.8士0.9 0.5士0.6 3.01士1.63' 0.34士0.39 0.26士0.32 9.4土3.8 1.0士0.8 0.5士0.6 5.31士2.47' 0.56士0.57 0.19士0.22 ?? ? ? ? ? ? ????? ?? ? ? ? ????????????????????? 注:与对照比,* P<0.01;动物数=4--5 巨噬细胞DNA损伤随着时间变化的趋势与脾细胞一 致,均在24和48 h后不再表现出DNA链断裂损伤;随着染 毒时间的延长也未发现五抓酚钠诱导胸腺细胞出现DNA链 断裂损伤。 2.3 不同荆全五氛酚钠染毒1个月后,脾细胞DNA链断裂 捆伤情况 五抓酚钠连续灌胃染毒1个月后,6.25,12.5和 25.0 mg/ kg的五抓酚钠均未诱导明显的DNA链断裂损伤, 彗星细胞频率和迁移距离与对照组没有显著性差异。 2.4 不同剂蚤五氛盼钠染毒后,骨越嗜多染红细胞徽核出现 情%X. 25,50和100 mg/掩五氯酚钠灌胃染毒后,小鼠骨髓 嗜多染红细胞内的微核无论在24h还是在48h均未表现出与 对照组有明显的差别。 3 讨论 五氛酚钠可致不同免疫细胞出现DNA链断裂损伤,且 对不同类型的细胞具有一定的选择性,脾细胞的DNA链断 裂损伤在灌胃3h时表现明显,而24和48 h后,与对照组比 没有明显的差别,可能DNA损伤己经修复,或者DNA损伤 的细胞已经在体内清除。对脾淋巴细胞的损伤作用在 50 mg/ kg即观察到,而对巨噬细胞的影响则在100 mg/ kg下出 现,表明不同细胞类型对五抓酚钠诱发的DNA链断裂损伤 敏感程度不同.脾脏细胞对于损伤作用更为明显。Lin(7)发现 五氯酚(PCP)在肝组织中代谢,产生的未结合四氯氢醒于摄 入PCP后4h达到高峰,其后开始下降进行排出,那么经过血 液循环达到其它脏器(脾脏,腹腔)的时间必然还要拖后;另外 在Dahlhaus(8)在研究中发现给予B6C3F雄性小鼠四氯氢醒2 周后肝细胞核DNA的8一OH- dG比对照组明显增多,但是 一次注射四氯氢酿在6和24h均未发现8一OH一dG的含量 增加,提示四氯氢酿在体内的作用表达较慢。因此本研究中, 染毒后3h观察到的DNA损伤,应是五氯酚钠本身的直接作 用。在五氯酚钠重复染毒1个月后,未观察到明显的DNA链 断裂损伤,可能是染毒的剂量小,或与取材的时间有关。在本 实验条件下五抓酚钠灌胃后24和48h小鼠骨髓嗜多染红细 胞微核试验结果显示各处理组与对照组有显著性差异,Pavli- ca等((4)观察到PCP诱导斑状贝和大蜗牛微核率增加,随着暴 露天数延长,在较低浓度下也出现微核细胞频率增加。与本 结果的差异可能是:(1)五抓酚在低等动物与高等动物之间所 产生的损伤效应谱不完全一致;(2)可能五氯酚钠诱导的微核 形成需要重复染毒产生一种累加的作用,还需要进一步探索。 参考文献: (1) Seiler JP. Pentachlorophenol[J]. Mutation Research, 1991, 257:27 一47. (2〕 邓星泉,冯亚萍,江夕夫,等 血吸虫病流行地区五氛酚的环境污 万方数据 952 中国公共卫生2004年8月第20卷第8期 Chin J Public Health Aug 2004 Vol. 20 No. 8 (3) (4) (5) tation of two levels of DNA damage in individual cells[ J l.Expcel Res,1988,175:184一191. (7) Lin PS, Waidyanatha S, Pollack MP, et al. Dosimetry of chlorinated quinone metabolites of pentachlorophenol in the livers of rats and mice based upon measurement of protein adducts [ J l.Toxicology and applied Pharmacology, 1997,145:399一408. (8) Dahlhaus M, Almstadt E,柳州KE . The pentachbrphenol metabolite tetrachloro一p一hydroquinone induces the formation of 8一hydroxy一2 一d斌旧 nosine in liver DNA of male B6C3FI mice[ Jl. Toxicology letter, 1994, 74(3) :265一274 (6) 染、人体接触盘及健康影响的研究【Jl.卫生研究,1997,26(1): 24一29. Pavlica M, Klobucar GIV, Moja N, et al. Detection of DNA damage in haemocytes of zebra mussel using comet assay[j].Mutation re- search, 2001,490:209一214. Pavlica M, Klobucar GIV, Vetma N, et al. Detection of micronuclei in haemocytes of zebra mussel and great ramshorn snail exposed to pentachlorophenol[J ] . Mutation research, 2000, 465:145一150. Ziemsen B, Angerer J, Lehnen Q. Sister chromatid exchange and chromosomal breakage in pentachlorophenol (PCP) exposed work- ers(l).Int Arch Occup Environ Health, 1987, 59(4):413一417. Singh NP, Mcloy MT, Tice RR, et al. A simple technique to quanti- 收稿B期:2004-01-16 (宋艳萍编辑 蔡天德校对) 文章编号:1001-0580(2004)08-0952-01 中图分类号:R373.2 文献标识码:B I墓层公共卫生] 大规模接种甲肝减毒疫苗副反应观察 刘卫民,何梅英,陈国草 甲肝减毒疫苗是我国使用多年的常规疫苗,对预防和控 制甲型肝炎的发生和流行起了非常重要的作用。以往使用的 液体甲肝减毒疫苗由于运输贮存要求高,近年已逐步被冻干 甲肝减毒活疫苗及灭活疫苗所代替。冻千甲肝减毒活疫苗也 是我国自主研发的产品,具有较高的免疫原性及安全性,但以 往的疫苗安全性评价存在现场范围小、观察人群单一、样本量 偏小等不足。因此,我们针对冻干甲肝减毒活疫苗现场接种 的安全性进行评价,并于2004年3-4月率先完成了现场接 种,现将疫苗接种后副反应分析如下。 1 材料与方法 1.1 接种对象 接种对象为深圳市罗湖辖区年龄为2一60 岁的人群(重点是各托幼机构、中小学校的在校在园学生)总 计60 832人。 1.2 疫苗 所用的冻干甲肝减毒活疫苗(批号20040301,有 效期至2005年10月)均由浙江普康生物技术有限公司生产, 由专车运送到现场。运输、贮存、现场使用均严格按照疫苗保 管进行,每天监测温度2次。 1.3 接种方法 由专职防疫医生、护士、记录员8人组成接 种小组,进行现场接种及记录,严格掌握疫苗的禁忌症。发热 :腋温)37.5r-。冻干甲肝减毒活疫苗每人0.5 ml上臂 外侧三角肌肌肉注射。 1.4 接种副反应分类 一般副反应分为3级:工级不影响正 常活动;n级对正常日常活动有影响;m级对正常生活严重影 响,根本不能从事正常日常活动。严重副反应:导致死亡或有 生命危险;需住院治疗或延长住院治疗时间;导致伤残或残 疾,构成实质性能力丧失。 1.5 建立监浏系统 所有接种对象接种完疫苗后在原地观 察15--30 min,公布接种咨询电话,所有报告由免疫接种专职 医生核实,并统一填写报告表。 2 结果 2.1 接种情%R 本次活动共接种冻干甲肝减毒活疫苗46 作老单位:深圳市罗湖区疾病预防控制中心,518020 作老简介:刘卫民(1970一),男,广东人,副主任医师,本科,主要从事 计划免疫工作。 039人份,接种率为75.68%,其中在校学生接种率为 87.0%0 2.2 A'1反应情%1L 发生一般副反应 69例,总发生率为 149.87八0万,男性38例,占55.07%,女性31例,44.93%o 69例症状发生在37人次中,其中男性21例,占56.76%,女 性16例,43.24%。两者无显著性差异(P>0.5)。接种对象 年龄为2一60岁,各年龄组均有副反应发生,并呈现低年龄组 发病趋势。 2.3 副反应表现 69例一般副反应中,共出现17种症状 (发热、乏力、皮疹、食欲不振、发冷、出汗、痛痒、恶心、心慌、咽 喉红肿、局部红肿、呕吐、头昏、胸闷、红斑等)37人次,只出现 1种症状的占32.43%,同时出现2种症状的占48.65%,同时 出现3种症状的占16.22%,同时出现4种(包括4种以上)症 状的占2.70%。排前4位的症状为发热占20.29%,乏力占 13.04%,皮疹占10.14%,食欲不振占10.14%,发生率分别 为30.4/10万、19.54/10万、15.2/10万、15.2/10万。 2.4 副反应分类 冻干甲肝减毒活疫苗一般副反应都比较 轻,大部分属轻、中度反应,自觉症状多在24 h内消失;皮疹 在24-72 h消失。疫苗副反应强度I级占45.95% (17/37), II级占40.54 % (15/37), DI级占13.51% (5/37)。其中有5 例体温达41r-,个别有乏力、食欲不振等症状,经医院对症处 理,2一3d恢复正常。 3 讨论 通过对冻干甲肝减毒活疫苗大规模接种副反应的调查研 究,对疫苗的现场接种进行了一次考核评估。本次大规模接 种冻干甲肝减毒活疫苗的接种副反应率仅为149.87/10万, 发热为主要副反应症状,所有报告病例均不严重,全部病例均 在短时间内恢复正常,无严重接种副反应发生。结果表明,冻 干甲肝减毒活疫苗是一种副反应轻微、副反应发生率低,安全 性较高的疫苗。可用于人群的大规模预防接种及疫情应急接 种处理,是一种免疫抗体稳定持久,使用安全的疫苗,值得推 广使用。 收稿日期:2004-04-10 (蔡天德编校) 万方数据
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