中医执业医师——谈中医药与血管新生研究进展

中医执业医师——谈中医药与血管新生研究进展 　　摘要： 　　血管新生（血管生成）是指在原有的血管上萌芽毛细血管（芽生）或在原有的血管中纵向分隔（非芽生）形成新血管的过程。血管新生可分为生理性和病理性两类，生理性的血管生成见于月经期中的子宫内膜、排卵后黄体以及创伤愈合等过程中；病理性的血管生成出现在慢性炎症与纤维化、肿瘤生长与转移等过程中。通过基础研究，血管生成的机制已被逐渐揭示：缺血、缺氧、炎症及物理化学刺激等条件的存在是激活血管新生的必要条件，而血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素（Ang）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）等生长因子在血管新生的过程中起到了主要作用；其中在血管生成中起重要作用的生长因子是VEGF.在血管内皮细胞表面有VEGF的两种受体，VEGFR1（Flt-1）与VEGFR2（Flk-1），而在血管生成中最重要的信号转导是由VEGF与VEGFR2（Flk-1）相互作用介导的。通过系列的作用促进内皮细胞增殖、迁移、抗凋亡和存活。新生血管仅由内皮细胞构成，通透性很高缺乏稳定性。Ang中的Ang1能与内皮细胞膜的受体Tie 2相互作用，转导血管成熟的信号，募集平滑肌细胞和外周细胞，稳定血管内皮细胞和平滑肌细胞的作用，使新生血管逐渐成熟。此外，如整合素（intergrin）、血管内皮细胞钙粘蛋白（VE-cadherin）、细胞间粘附分子（ICAM-1）及血管细胞黏附分子（VCAM-1）等细胞粘附分子也参与了新血管的形成与稳定。正是对以上血管新生机理的认识，肿瘤、缺血性心肌病和外伤等疾病的新的治疗策略展现出了诱人的前景。与此同时，对这种治疗的临床疗效和安全性评价尚未完成，但血管新生机制揭示无疑为我们研究防治肿瘤、缺血性心肌病等疾病提供了一条研究思路。笔者将有关中医药与血管新生研究的文献做一综述。 　　关键词：中药；方剂；血管新生；综述 　　1中药对血管新生的影响 　　1.1人参人参皂苷Rg3是从中药中提取的一个单体成分。倪氏等[1]采用细胞培养和药物干预方法探讨中药20（R）-人参皂苷Rg3（Rg3）对肺癌细胞和血管内皮细胞增生、凋亡以及细胞周期的影响。结果显示Rg3对A549细胞增生无明显抑制作用。浓度为1×104  mol/L的Rg3对内皮细胞的生长有较强的抑制作用。对于CM诱导的内皮细胞，Rg3对其增生有显著的抑制作用。当Rg3浓度为3×106 mol/L，持续作用120 h后，A549细胞凋亡明显。Rg3对A549细胞周期无明显影响，提示其可能不是通过影响细胞周期发挥作用的。通过透射电镜可观察到Rg3可使CM诱导的内皮细胞核膜缺损，染色质分散成若干小块，核仁萎缩，细胞间可见典型的凋亡小体，Rg3导致血管内皮细胞凋亡有可能是Rg3抑制肿瘤新生血管形成的机制之一。人参皂苷Rg3在体内、外抑制肿瘤新生血管生成、抑制细胞生长的机制是多方面的，除了影响细胞的增生、凋亡等因素外，药物浓度、作用时间、培养生长环境以及机体内神经、体液的调节等都与其有密切关系。陈氏等[2]为了研究人参皂苷20（R）-Rg3对肿瘤血管生长调控因子（VEGF，bFGF，MMP2）蛋白表达的抑制作用，进行了人肺腺癌细胞株A549、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC304细胞株培养、10-6 mol/L Rg3药物干预72 h，采用免疫组化、基因芯片技术，检测上述因子蛋白表达阳性率和灰度变化以及A549细胞基因的差异表达情况。结果Rg3干预后，A549细胞VEGF蛋白阳性表达率显著降低，VEGF、Flt、KDT以及MMP2蛋白阳性表达的强度较对照组均有显著下降，内皮细胞VEGF、Flt和KDT蛋白阳性表达的灰度较对照组均有显著下降。基因芯片差异性表达显示其中14个基因下调，10个基因上调。并得出结论：Rg3可显著抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的血管生长调控因子蛋白表达，通过不同靶点作用于肿瘤细胞，影响肿瘤新生血管生成。辛氏等[3]通过黑色素瘤实体瘤模型、MTT法观察Rg3对B16黑色素瘤的生长作用，采用新生血管计数实验、流式细胞术检测Rg3对肿瘤组织血管生成及细胞周期的影响，结果表明，不同浓度Rg3各组瘤重明显低于对照组，而且Rg3肿瘤组周围的血管数也明显少于对照组。体外实验中，MTT法见Rg3抑制B16黑色素细胞的生长，其IC50为（7.76±0.46）mg/L，并且Rg3可阻滞B16黑色素瘤细胞于G0/G1和S期，使G2/M期细胞数明显减少。结论：Rg3抑制B16黑色素瘤的生长，其机制可能是通过抑制肿瘤内血管生成及阻滞肿瘤细胞进入分裂期来发挥作用的。 　　1.2葛根素茅氏等[4]探讨了葛根素对糖基化终产物（AGEs）诱导的鸡绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成的影响，结果显示，不同剂量的AGEs均可明显促进CAM新生血管的形成，而大、中剂量葛根素对此有明显的抑制作用，并得出结论认为，葛根素对AGEs诱导的CAM新生血管的生成具有一定的抑制作用。 　　1.3灯盏细辛灯盏细辛被广泛用于中风、冠心病等心脑血管病治疗。周氏等[5]从抗癌的角度研究灯盏细辛的抗癌变效果并动态观察其对癌血管生成的影响。用αSalley法诱导金黄地鼠颊囊白斑癌变，以灯盏细辛干预，采用墨汁灌注图像分析、微血管树脂铸形、a-SMA免疫组化染色及组织病理对照等多种方法联合动态观察其变化规律。结果显示，灯盏细辛组较模型组白斑癌变率下降1倍，正常细胞率是模型组的近4倍。a-SMA值明显高于模型组（P<0.001）。血管面积与血管密度比值两组间相比，P>0.05，但树脂微血管铸形显示形态和空间构筑近似于空白对照组。并得出结论，灯盏细辛有确切的防止白斑癌变的功效。该药对白斑癌变过程中的血管增生和扩张无明显影响，但对血管构形、空间配置和血管壁的完整性有保护作用，可能是活血化瘀类中药发挥抗癌功效的“良性血管生成”基础。 　　1.4红景天有学者研究中药红景天对血管新生过程中的关键受体Flt-1和Tie-2影响做了缺血心肌血管新生实验研究，并观察到，红景天组大鼠心肌的Flt-1和Tie-2表达明显增加，与其它各组比较，差异有显著性[6].有学者用红景天与绛香做实验研究，红景天能降低血管抑素和内皮抑素的表达，提示红景天和绛香在一定程度上改变了缺血心肌中血管新生的平衡，通过直接或间接的方式，不但促进促血管新生的因子表达，而且降低血管抑素和内皮抑素的表达，从而使血管生长各因子的平衡向促进血管新生的方向发展[7]. 2  方剂对血管新生的影响2.1  参麦注射液尹氏等[8]研究参麦注射液对血管生成的影响，研究表明其能明显抑制牛内皮细胞增殖，与SMMC27721比较，差异有显著性；能抑制牛内皮细胞迁移，并可抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成。并得出结论认为，参麦注射液能抑制血管生成；抑制内皮细胞增殖和迁移可能是其抗血管生成的机理之一，同时也说明参麦注射液是一种特异性血管生成抑制剂。 　　2.2麝香保心丸 　　有学者对麝香保心丸促血管新生作用进行了一系列的研究，结果显示，麝香保心丸能促进鸡胚CAM培养的微血管内皮细胞的血管生成，促进内皮细胞释放VEGF、bFGF并表达其mRNA.在大鼠心肌梗死动物模型中进一步证实了麝香保心丸对整体动物的血管新生作用[9]. 　　2.3当归注射液 　　杨氏等[10]探讨当归注射液对鸡胚CAM血管生成的影响，结果当归注射液具有明显的促进鸡胚CAM血管生成的作用，但药效低于EGF对照组。 　　3中医治法与血管新生3.1  祛风通络法双龙丸是由蜈蚣、全蝎、地龙3种中药按比例组成的复方，具有搜风通络、破瘀散结等功效。杨氏等[11]应用大鼠急性心肌缺血（AMI）模型，通过免疫组化法检测AMI大鼠缺血心肌新生血管数量以及缺血心肌VEGF和bFGF的表达，RT-PCR法检测缺血心肌VEGFmRNA和bFGFmRNA的表达来探讨双龙丸对缺血心肌血管新生的影响和分子学机制。结果双龙丸大、小剂量组各期的缺血心肌新生血管数均比AMI对照组增多。表明双龙丸具有促进缺血心肌血管新生的作用，并且大剂量（6.72 g/kg）应用对VEGF、bVEGF及其mRNA均有明显的上调作用，也反映了中药作用位点的多样性。 　　3.2益气活血法根据冠心病为本虚标实之证，而气虚血瘀贯穿疾病的不同病理阶段，因此，益气活血法成为治疗心肌梗死的重要治法。韩氏等[12]观察了心肌梗死后大鼠缺血心肌局部新生微血管数微血管密度，以较特异和敏感的血管内皮细胞表面标志物CD34标记微血管，用新生血管数（MVC）、微血管面密度（MVD）来反映血管新生强度。实验结果显示：益气活血方能促进大鼠心肌梗死边缘区CD34的蛋白表达，其MVC、MVD亦较模型组显著增加。这表明益气活血方能促进心肌梗死后大鼠缺血心肌部的血管新生，改善缺血冠脉侧支循环，这为本方临床防治心梗后心室重塑提供了依据。实验还发现中药组存在量效关系，大剂量组促血管新生作用十分明显；而小剂量组有一定的作用倾向，其MVC较模型组有显著差异；小剂量组MVD虽有所增加，但与模型组无统计学差异。雷氏等[13]通过制备鸡胚CAM模型，探讨黄芪、当归不同配伍对CAM新生血管生成的影响，结果黄芪与当归按5∶1配伍后，在血管生成表现以及血管计数方面，均明显优于生理盐水对照组及其它配比组，具有较好的促进CAM新生血管生成的作用，表明当归补血汤原方配比为最佳组合。 　　内皮细胞是血管新生过程中的靶细胞，内皮细胞的迁移和增殖决定着血管新生的过程。李氏等[14]探讨黄芪与当归建立离体培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型，采用MTT法检测不同剂量黄芪与当归对细胞增殖的影响；流式细胞仪检测黄芪与当归对HUVEC增殖周期的影响；半定量RT-PCR检测黄芪与当归对HUVEC的VEGFmRNA表达的影响。结果细胞周期检测显示，黄芪及当归组S期细胞数显著增多。黄芪＋当归组G0/G1期细胞数明显减少，S期和G2/M期细胞数明显增多。RT-PCR结果表明，黄芪与当归使HUVEC的VEGFmRNA表达明显增强，黄芪＋当归（200 μg/mL）组是对照组的1.82倍；当归（200 μg/mL）组是对照组的1.88倍；黄芪（200 μg/mL）组是对照组的1.51倍。并得出结论，黄芪与当归及其复方具有促进内皮细胞增殖作用，黄芪＋当归可明显促进HUVEC的DNA合成及有丝分裂。黄芪与当归可促进HUVEC的VEGFmRNA表达，提示黄芪与当归通过刺激VEGF表达而促血管新生。 　　3.3补肾活血法 　　刘氏等[15]对子宫内膜异位症（EM）的模型研究表明，补肾活血方可通过调节VEGF、TGF-β在异位子宫内膜组织中的表达，抑制异位病灶及周围的新生血管形成，而抑制异位子宫内膜的生长发育可能是补肾活血方药临床有效治疗子宫内膜异位症的途径之一。 　　3.4活血利水法 　　韩氏等[16]用散血明目片对兔视网膜静脉阻塞（RVO）模型视网膜中VEGF作用机制进行研究，实验发现，RVO形成后VEGF浓度明显增多，而中药治疗组（C、D组）的VEGF浓度与对照组（B组）比较，P<0.05，且散血明目片治疗组（D组）低于血塞通片治疗组（C组）。说明散血明目片能有效的减缓视网膜缺血缺氧的状态，降低毛细血管通透性，修复受损的血-视网膜屏障，下调VEGF的浓度，以达到治疗RVO减少其并发症发生的目的。 　　3.5活血化瘀法 　　有学者研究表明，活血中药能够促进血管新生的作用，从而促进缺血区侧枝循环的形成。还有学者通过鸡胚CAM模型证实，有30多味中药具有促进血管新生活性，其中在4～6周时，促进血管新生作用明显[17].但也有学者认为活血化瘀的方法对肿瘤的血管新生具有抑制作用，如王氏等[18]认为，血瘀←→血管内皮细胞损伤←→血管内皮细胞增殖←→肿瘤血管生成。这其中存在着互为影响的内在联系。活血化瘀药物通过修复血管内皮细胞损伤，抑制其增殖，可有效改善组织缺血缺氧的“血瘀”状态，而消除肿瘤新生血管生成的条件，在血管形成前期阻断胃癌前病变进一步向恶性发展。 　　4结语 　　对血管新生机制的研究是治疗肿瘤、缺血性心肌病与外伤等疾病的集中点，通过治疗性血管新生或治疗性的抑制血管新生为治疗疾病提供了新的思路，并且有的研究成果已经进入临床试验阶段。通过以上对中医药与血管新生研究现状的分列，可以看出，在传统的中医药理论指导下运用中医药治疗疾病显示出不同的影响效应，部分中药既可抑制血管新生又可促血管新生，同一种治法针对不同疾病也具有不同的治疗效应，不同的治法针对同一种疾病亦有同种治疗效应。因此，中医药在血管新生的研究领域具有潜在的特色和优势，目前需要加强中医药学的药物配伍、治法研究来阐释它们在血管新生过程中的作用环节和作用机制。