放射线照射对体外培养的骨巨细胞瘤细胞

作者单位 :上海市交通大学附属第六人民医院骨科 ,2002333 上海市交通大学附属第六人民医院肿瘤放疗科 作者简介 :王韬 (19742) ,男 ,主治医师 ,医学学士 ,讲师。研究方向 :创伤 骨科与骨肿瘤。电话 :64835572 ·实验研究· 放射线照射对体外培养的骨巨细胞瘤细胞 作 用 的 实 验 研 究 王 　韬 　张先龙 　苏 　琰 　张 　强 3 　眭述平 　徐铮宇 　杨星光 摘 　要 　目的 : 对体外培养的骨巨细胞瘤细胞进行放射线照射 , 并观察其效应。方法 : 对 6 例经临床、X线和病 理组织学检查证实的骨巨细胞瘤标本进行体外细胞培养 , 传代后实验组进行放射线照射处理 , 对照组未进行放射线 处理。分别采用倒置显微镜观察、台盼蓝染色后计数、M TT 法测定和 FCM 来观察放射线照射对体外培养的骨 巨细胞瘤细胞的细胞毒性和细胞周期的影响。结果 : 放射线照射后 , 体外培养的骨巨细胞瘤细胞可见逐渐发生皱缩 和脱落 , 细胞存活率为 8127 %～13150 % , 细胞毒性指数为 83119 % , FCM 分析显示 G0 与 G1 期比例明显增加 , G2 与 M 期比例明显减少。结论 : 放射线照射对体外培养的骨巨细胞瘤细胞有较强的细胞毒性作用。 关键词 　骨巨细胞瘤 ; 　细胞培养 ; 　放射 中图分类号 　R687 　　　文献标识码 　A 　　　文章编号 　1005 - 8478 (2004) 17 - 1317 - 03 Experimental study for the effects of radiation on bone giant cell tumor in vitro ∥W A N G Tao , ZHA N G Xian2long , S U Yan , et al1 Depart ment of Orthopaedics , the 6 th A f f iliated People’ s Hospital , S hanghai Jiaotong U niversity , S hanghai 200233 Abstract 　Objective : To observe the effects of radiation on bone giant cell tumor in vitro1Method : Six samples of bone giant cell tumor were confirmed by clinical examination , X2ray and pathological examination , and tumor cells were cultured in vitro1After passage , the experimental group were treated by radiation , while the control group were not 1The effects of radia2 tion on cytotoxicity and cellular cycle of bone giant cell tumor were studied in vitro by inverted microscopic observation , cell count after trypan blue staining , M TT assay and FCM analysis1Result : After radiation , tumor cells of bone giant cell shrank and shed gradually1Cellular survival rate was between 8127 %～ 13150 %1Cytotoxicity index was 83119 %1FCM analysis showed that the proportion of G0 and G1 phrase increased , and the proportion of G2 and M phrase decreased apparently1Conclusion : Radiation had strong cytotoxical effects on tumor cells of bone giant cell tumor in vitro1 Key words 　Giant cell tumor of bone ; 　Cell culture ; 　Radiation 　　骨巨细胞瘤是常见的低度恶性骨肿瘤 , 目前治疗以手术 为主。但单纯的手术治疗其复发率较高 , 可达 26 %～60 %。 本实验对体外培养的骨巨细胞瘤细胞进行放疗 , 并观察其对 骨巨细胞瘤细胞的细胞毒性作用。 1 　材料与方法 111 　材 　料 RPMI21 640干粉、胰蛋白酶 (均购自于 Gibco 公司) ; 新 生小牛血清、M TT (均购自于 Sigma 公司) ; 细胞培养瓶、 35mm细胞培养皿、96 孔板、加样器 (均购自于 Corning 公 司) ; CO2恒温培养箱 ; 流式细胞仪 (Becton Dickinson 公司) ; 直线加速器 (Varian 1800) 。 112 　实验方法 11211 　细胞培养与传代 选用的标本术前均经临床、X 线和病理组织学检查证实 为骨巨细胞瘤。共 6 例。根据 Jaffe 分级 , Ⅰ级 2 例 , Ⅱ 级 4 例。采取酶消化法进行细胞培养。手术中无菌条件下 , 选择标本较为松软的组织约 1cm3 。去除脂肪、结缔组织和坏 死部分 , 在平皿中用 Hanks 液洗涤 3 次 , 剪碎组织成 1mm3小 块。加入 37 ℃预温的 0125 %胰蛋白酶 2ml , 消化 30min , 使 细胞解离 , 去除消化液 , 用 Hanks 液洗涤 , 离心后加入 RP2 MI21640 培养液 2ml 制成细胞悬液 , 以 5 ×108～8 ×108的细 胞浓度接种于含 20 %小牛血清的 RPMI21640 培养液的培养瓶 中 , 置于 37 ℃、5 %CO2恒温培养箱中培养。每 3～4d 换液一 ·7131·中国矫形外科杂志 　2004 年 9 月第 12 卷第 17 期 　Orthop J Chin , Vol112 , No117 　September 　2004 次。当肿瘤细胞增殖到已覆盖培养瓶壁表面时 , 用 0125 %胰 蛋白酶消化贴壁细胞后传代。传 2～3 代后用于本实验研究。 11212 　细胞处理 将来源于每个标本培养的骨巨细胞瘤细胞均分为实验组 和对照组。实验组对体外培养的骨巨细胞瘤细胞用 6MV 电 子束照射 TD 4 000CGy , 然后用 Hanks 液洗涤 2 次 , 再加入 含 20 %小牛血清的 RPMI21640 培养液 , 置于 37 ℃、5 %CO2 恒温培养箱再继续培养 3d。对照组则未进行放射线照射处 理 , 其余条件与实验组相同。 11213 　倒置显微镜观察 培养过程中 , 定期用倒置显微镜观察细胞的形态和生长 情况。 11214 　台盼蓝染色和细胞计数 实验组和对照组的骨巨细胞瘤细胞用 015 %的台盼蓝染 液染色 , 然后在显微镜下进行细胞计数。015 %的台盼蓝染液 可将死细胞染成蓝色 , 活细胞不着色。可以分别计算出活细 胞数和死细胞数。细胞存活率 = 活细胞数/ (活细胞数 + 死细 胞数) ×100 %。 11215 　M TT 法测定 将细胞分别接种到 96 孔板上 , 每孔 250ul (细胞浓度为 2 ×105/ ml) , 共接种 12 个孔。每 4 个孔为一组。以 RPMI2 1640 培养液为空白对照组 , 以未经任何处理的细胞为阴性对 照组 , 以经过放射线照射的细胞为处理组。将接种后的 96 孔 板置于 37 ℃、5 %CO2恒温培养箱继续培养 3d 后 , 加 M TT 50ul/ 孔 , 继续培养 4h , 弃上清液 , 加二甲亚砜 100ul/ 孔 , 在 平板离心机上以2 000r/ min 5min , 待结晶溶解后 , 用全自动 酶标仪 ( Sigma 960 型 , 波长 590nm) 测定每一孔的吸光度 A。重复 3 次。计算细胞毒性指数值 (CI) 。CI = (阴性对照 组 A 值 - 处理组 A 值) / 阴性对照组 A 值 ×100 %。 11216 　流式细胞仪 ( FCM) 分析 将来源于每个标本培养的骨巨细胞瘤细胞均分为 2 组 , 即未经放射线照射处理的细胞即对照组和经放射线照射处理 的细胞即实验组。分别收集 104个细胞 , 先用预冷 PBS 液洗 涤 2 次 , 再用体积分数为 70 %的乙醇进行细胞固定 , 于 4 ℃ 保存 24h , FCM 进行 DNA 含量测定 , 并计算各期细胞百分 比。 2 　结 　果 211 　倒置显微镜观察 肿瘤细胞接种后约 16～24h 开始贴壁。壁后可见单核基 质细胞呈长梭形、梭形或卵圆形 , 生长旺盛 , 排列成束状或 漩涡状。多核巨细胞体积较大 , 胞浆丰富 , 胞膜边缘常呈波 浪状。未见多核巨细胞的有丝分裂。传代后多核巨细胞逐渐 消失。放疗后 2～48h 可见贴壁的肿瘤细胞胞体皱缩 , 逐渐从 瓶壁上脱落。 212 　台盼蓝染色和细胞计数 骨巨细胞瘤细胞经放射线照射后并经台盼蓝染色 , 其活 细胞数、死细胞数和细胞存活率见表 1。 表 1 　放射线照射后骨巨细胞瘤细胞活细胞数、死细胞数和细胞存活率 标本 实验组 活细胞数 ( ×105/ ml) 死细胞数 ( ×105/ ml) 细胞存活率 ( %) 　 对照组 活细胞数 ( ×105/ ml) 死细胞数 ( ×105/ ml) 细胞存活率 ( %) 1 　　0144 2182 13150 3110 0124 92181 2 0132 2191 9191 3135 0116 95144 3 0138 2184 11180 3102 0151 85155 4 0142 3126 11141 3164 0131 92115 5 0156 3193 12147 3181 0118 95149 6 0135 3188 8127 4115 0126 94110 213 　M TT 法测定结果 骨巨细胞瘤细胞经放射线照射后 , 其吸光度 A、细胞毒 性指数 CI 见表 2。 表 2 　放射线照射后骨巨细胞瘤细胞吸光度 及细胞毒性指数 (n = 6) 分　组 A ( x- ±s) CI ( %) 阴性对照组 1113 ±01062 - 处理组 0119 ±01037 83119 214 　FCM 分析结果 正常对照组和经放射线照射后的处理组经流式细胞仪 ( FCM) 分析后的结果见表 3。 表 3 　流式细胞仪检测结果 (n = 6) 分　组 G0 与 G1 期 S 期 G2 与 M 期 对照组 38153 ±0157 32116 ±1167 28196 ±2148 处理组 65119 ±4162 3 25147 ±2174 10121 ±2117 3 P 值 P < 0105 P > 0105 P < 0105 注 : 均数间 t 检验分析 , 3 对照组与处理组比较有显著性意义 ( P < 0105) 3 　讨 　论 骨巨细胞瘤约占骨肿瘤发病的 15 %～20 %。多发年龄为 ·8131· 中国矫形外科杂志 　2004 年 9 月第 12 卷第 17 期 　Orthop J Chin , Vol112 , No117 　September 　2004 20～40 岁的青壮年。它起始于骨髓内间叶组织。肿瘤组织主 要由多核巨细胞和基质细胞组成。目前临床上以手术治疗为 主 , 合并其他治疗〔1〕。 放射治疗始于本世纪的三、四十年代 , 早期应用较多 , 主要用于复发及难于手术切除或不可手术切除的病例。其机 理为放射线在细胞内产生次级电子 , 引起电离。其作用包括 : (1) 射线直接作用于 DNA 分子链 , 引起单链或双链断裂。 (2) 射线使水分子电离 , 产生自由基 , 再与生物大分子作用 , 作用于 DNA 链。也有学者认为骨巨细胞瘤对放疗并不敏感 , 且放疗后骨巨细胞瘤有明显肉瘤变的倾向。这可能与早期 X 线治疗机骨组织吸收量高 , 射线穿透力弱等因素有关。随着 放疗设备的不断改进 ,60Co 和直线电子加速器广泛应用 , 很多 学者认为手术合并一定剂量放疗能有效地减少骨巨细胞瘤的 复发率 , 但并未证实肉瘤变和放疗之间存在着必然关系〔2～5〕。 本实验对体外培养的骨巨细胞瘤细胞进行放射线照射处 理后观察并探讨放疗对骨巨细胞瘤细胞的细胞毒性作用。倒 置显微镜下可见放射线照射后骨巨细胞瘤细胞逐渐发生皱缩 和脱落现象。台盼蓝染色后进行细胞计数可见放射线照射后 有大量死亡的肿瘤细胞 , 细胞存活率为 8127 %～13150 % , 而对照组为 85155 %～95149 %。M TT 法检测示放射线照射 后细胞毒性指数为 83119 %。FCM 分析显示放射线照射处理 后骨巨细胞瘤细胞的细胞周期有明显改变 , G0与 G1期比例明 显增加 , G2与 M 期比例明显减少 , 说明放射线照射后能促进 G2/ M 期向 G0/ G1期移行。根据以上的实验结果 , 作者认为放 射线照射对体外培养的骨巨细胞瘤细胞有较强的细胞毒性作 用 , 可为临床上手术同时合并放疗来治疗骨巨细胞瘤提供一 定的实验基础。但是 , 由于体外细胞培养并不能模仿体内的 三维结构 , 不能准确地反映放疗 - 肿瘤 - 人体的复杂关系 , 因此放疗对骨巨细胞瘤是否有显著的疗效 , 以及放射线治疗 剂量如何在术中、术后的合理安排 , 尚有待于临床上进一步 研究和探讨。 参考文献 : 〔1〕　周勇 ,范清宇 ,马保安 ,等. 长骨骨巨细胞瘤相关复发原因分析 J . 中国矫形外科杂志 ,2000 ,7 (3) :233～235. 〔2〕　Caudell JJ ,Ballo MT ,Zagars GK ,et al. 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(收稿 :2004203224 　修回 :2004205228) ·征订启事· 《中国骨伤》2005 年征订启事 　　《中国骨伤》杂志是中国中西医结合学会和中国中医研究院主办的国家级专业性学术期刊 , 是中国期刊方阵双奖期刊。本 刊坚持中西医并重原则 , 突出中西医结合特色 , 执行理论与实践、普及与提高相结合的方针。主要报道中医、西医和中西医结 合在骨科领域的科研成果、理论探讨和临床诊疗经验 , 反映我国骨伤科在医疗、科研工作中的新进展 , 以促进国内外骨伤科的 学术交流。 本刊主要设有专家述评、论著、骨伤论坛 (学术探讨) 、临床研究、实验研究、影像分析、诊治失误、经验交流、文献综 述、手法介绍、学习园地、科研思路与方法、临床病例、国内外骨伤科医学动态以及医学书刊等栏目。 本刊为月刊 , 每月 25 日出版 , 期刊内页采用 80g 亚光铜版纸 , 国际通用 16 开大版本 , 64 页 , 单价 8180 元 , 全年价 105160 元。国内外公开发行 , 全国各地邮局订阅 , 邮发代号 : 82 - 393。如错过征订机会 , 本刊编辑部亦可代办补订 (请直接汇款至编 辑部) , 国内订户我们将负责免费邮寄。 编辑部地址 : 北京东直门内南小街甲 16 号《中国骨伤》杂志编辑部 , 100700 电 　话 : (010) 64014411 - 2693 　　传 　真 : (010) 84036581 http : / / www1corthoptrauma1com 　　　E - mail : zggszz @sina1com ·9131·中国矫形外科杂志 　2004 年 9 月第 12 卷第 17 期 　Orthop J Chin , Vol112 , No117 　September 　2004