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盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定

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盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定 中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期 疾病防治 ·171 · 盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定 张桂贤 (山东临沂师 范学 院生命科学学院 ,临沂 276005) 摘要:本试验旨在合成盐酸四环素人工抗原,为其单克隆抗体的制备奠定试验基础。将盐酸四环素(TcH)发生霍夫曼降 解和重氮化反应生成重氮盐 ,再 与蛋白质 载体(BSA,0VA)偶 联生成 免疫原 和包被 原 ,对 偶联 产物采 用三氯化 铁及紫 外扫描 法鉴定偶 联成功 ,且免疫原 和包 被原 的摩 尔结合 比分别约为 3.4:1和 4.2:1...
盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定
中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期 疾病防治 ·171 · 盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定 张桂贤 (山东临沂师 范学 院生命科学学院 ,临沂 276005) 摘要:本试验旨在合成盐酸四环素人工抗原,为其单克隆抗体的制备奠定试验基础。将盐酸四环素(TcH)发生霍夫曼降 解和重氮化反应生成重氮盐 ,再 与蛋白质 载体(BSA,0VA)偶 联生成 免疫原 和包被 原 ,对 偶联 产物采 用三氯化 铁及紫 外扫描 法鉴定偶 联成功 ,且免疫原 和包 被原 的摩 尔结合 比分别约为 3.4:1和 4.2:1。用免疫原 免疫 BAI B/c小 鼠,用间接 ELISA 检测抗体效价 ,采用竞争 ELISA法测 IC 获得 了效价 为 1:51200、ICj。为 16.91 ng/mL的多克隆抗体 ,最终证 明人工抗原制 备成功 。 关键词:盐酸四环素;霍夫曼;重氮化;偶联;载体 中图分类号 :$859.79 6 文献标识码 :A 文章编号 :1671—7236(2010)03—0171一O4 四环素是以四并苯为母核 的一类抗生素 ,具有 抗菌谱广 、毒性小和过敏反应少的特点 ,能抑制革兰 氏阳性菌 、革兰氏阴性菌 、立 克次体 、病毒和原虫等 (尤启冬 ,2004),被广泛应用于畜牧业。但因该类药 物的滥用已给动物性食 品安全带来隐患,其在动物 体 内的残留对人类健康造成威胁 。目前动物源性食 品中,四环素类抗生素的检测普遍采用高效液相色 谱法(卢运战等 ,2006),此法操作复杂,所需试剂设 备昂贵 ,因此不能推广 ,而免疫分析法具 有简便 、快 速、准确等优点 ,因此建立 四环素类抗生素在动物性 食品中的免疫学检测法具有重要意义。四环素类抗 生素 具 有 两性 ,以其 盐 酸 盐 应 用 最 广 (顾 觉 奋 , 2001).本试 验 以盐 酸 四环素 (Tetracycline hydro— chloride,TCH)作为研究对 象,合成 人工抗原并免 疫 BALB/c小 鼠获得了多克隆抗体 ,为该类药物单 克隆抗体的制备奠定试验基础。 1 材料与方法 1.1 试验材 料 1.1.1 主要试剂 盐酸四环素(TCH)购 自北京鼎 国生物公 司;牛血清 白蛋 白(BSA)为中国医药上海 化学试剂公司产品;卵清蛋 白(OVA)购 自Sigma公 司;HRP标记羊抗 鼠 IgG购 自北京鼎国生物公 司; 邻苯二胺 (OPD)购 自上海 白鹤化工厂 ;弗氏完 全佐 剂和弗氏不完全佐剂购 自北京鼎国生物公司 。 1.1.2 主要溶液 盐酸四环素溶液:准确称取盐酸 四环素纯品 15 mg,加入 2 mL双蒸水 ,置于 4℃冰 收稿 日期 :2009—10—14 作者简介 :张桂贤(1977一),女 ,新疆 人 ,助 教 ,硕士生 ,研究 方 向 :动物疫病诊疗技术 。 箱保存 。蛋 白质 载体溶 液 :分 别准确称 取 BSA 和 OVA 20 mg于 1 mL双蒸水中,置 4℃冰箱保存 。 三氯化铁试液 :准确称取 FeC1。9 g,加 双蒸水溶解 至 100 mL,置 4℃冰箱保存 ,限 2 d内使用。次溴 酸钠试液 :准确称 取 NaOH 2O g,加双蒸水 75 mL 溶解后 ,加入溴水 5 mL,再加双蒸水至 100 mL,现 用现配。10 亚硝酸钠溶液 :准确称取 NaNO 10 g,加双蒸水溶解至 100 mL,置 4。C冰箱保存 。包被 缓冲液 :准确称 取 NaCO。0.85 g,NaHCO。1.4 g, 双蒸水定容至 500 mL,4|C冰箱保存 。洗涤液 :每 100 mL PH 7.4 PBS中加入 5O肛L的 Tween一2O,摇 匀即可 ,4。C冰箱保存 。封闭液 (5 脱脂乳):准确 称取 5 g脱脂奶粉溶于 100 mL pH 7.4 PBS中,4 。C冰箱保存 。抗体稀 释液 :pH 7.4,0.01 mol/L的 PBS,4℃冰箱保存 。底物缓冲液(枸橼酸一磷酸缓 冲液):枸橼酸 0.51 g,1.84 g Na。HPO ·12H2O 定容于 100 mL纯水中,4。C冰箱保存 。显 色液 :准 确称取 OPD(邻苯二胺)5 mg,溶于 1O mL底物缓冲 液中,再加入 3O ddH O 15 L,混匀即可,现配现 用 ,终止液(1o 硫酸):量取浓硫酸 10 mL,逐滴加 入到 90 mL双蒸水 中,混匀 ,室温保存 。 1.1.3 主要 器材 U一1800型紫外分光光度计为 日 本 日立公司产 品;sUNRISE型酶标仪为瑞 士 TE— CAN公 司产 品;96孔 可拆 式酶标板购 自浙江省临 海市华威分析仪器有限公司;TGL 16G型台式离心 机为上海安亭科学仪器厂生产 ;JA2003A型电子天 平为上海精天 电子仪器有 限公 司产品;SZ一97自动 三重纯水蒸馏器为上海亚荣生化仪器厂生产。 1.1.4 试验动物 SPF级 6~8周龄雌性 BALB/c 小鼠 4只,由临沂师范学院实验中心提供。 ·172 · 疾病防治 中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期 1.2 方法 成路线如图 1所示 ,其具体合成过程如下。 1.2.1 人工抗原的合成 盐酸四环素人工抗原合 0 ff N NC 0H CH3 protein protein—C00H HC1 ·}—————————————一 Cth }NaN02+HC1 ’ 图 1 盐酸 四环素人工抗原合成路线 1.2.1.1 霍夫曼反应 盐酸四环素 (结构式见 图 1)含有酰胺能在溴水碱液中发生霍夫曼降解生成少 一 个碳原子的伯胺盐 。准确量取 1.5 mL预冷 的盐 酸四环素溶液 ,滴加预冷的次溴酸钠溶液 ,直至溶液 变为棕色,同时用手振摇(蔡会武等 ,2007)。 1.2.1.2 重氮反应 将上述制备好的溶液加入预 冷的稀盐酸(1 mol/L),调 pH 为 2.5,然后在 阴暗 避光的环境下逐滴加入亚硝酸钠溶液 同时用手振 摇 ,期间用碘化钾试纸检验 ,变为深蓝色终止滴加, 置于 4℃冰箱中 1 h待充分反应,加入 2~3滴氨基 磺酸胺溶液以除去 NO/(滑静等,2007;蔡会武等, 2007)。 1.2.1.3 蛋白质栽体 与盐酸四环素偶联 将上步 制备好的溶液逐滴加入到蛋 白质溶液 中,然后用氢 氧化钠溶液(0.25 mol/L)调 pH为 7.5,置于 4℃ 冰箱 24 h,随后在此环境中用 PBS(0.01 mol/I ,pH 7.2)透析 2 d,期间换液 3次,收集透析液即得 目的 产物。 1.2.2 人工抗 原的 鉴定 1.2.2.1 三氯化铁法 盐酸四环素在酸性环境中 加入三氯化铁溶液 ,会变成红棕色,为盐酸四环素特 性(徐玫,2007),通过此法可判定透析外液是否含有 盐酸四环素 ,同时也可判定透析产物是否含有盐酸 四环素 。 1.2.2.2 紫外扫描 法 制备好扫描液及人工 抗原溶液 ,通过紫外分光光度计扫描 ,比较透析产物 的特征峰是否是盐酸四环素和蛋自载体特征峰的叠 加 ,且出现 了偏移 ,并根据孙远明等(2002)的方法计 算结合 比,依据朗伯 比尔定律 e—A/CI 计算 出 N 2 C1一 OH ,HC1 CHa TCH的摩尔消光系数 e ,再按下式计算摩尔结合 比。 n(TCH)/n(BSA)一 (ATCH-BSA/£TcH)/CBSA n(TCH)/n(OVA)==(ATcH一【)vA/eTcH)/CovA A 一BS ,A川 )vA分别 为偶联物 TCH—BSA 和 TCH—OVA在 TCH 最大波 长处 的吸收值 ;CBsA和 C wA分别为 BSA 和 OVA的摩尔浓度。 1.2.2.3 多抗血清的制备 将制备成功的免疫原 , 根据紫外扫描的D值参考杨立国等(1998)的方法, 当 D 8。 /D。 <1.5时,蛋 白质含量(mg/mL)一 (1.45×D。。。 ~0.74×D 。 )x稀释倍数,粗略估 算结合蛋白浓度,以确定免疫剂量。取制备成功 的 免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化,依据估算浓 度保证每只小鼠的剂量达到 100 g/只(李志勇, 2009),采用腹腔注射免疫 3只小鼠,剩下 1只作为 阴性对照 。第 14、35天将弗氏完全佐剂换成弗氏不 完全佐剂同法进行加强免疫 ,免疫原 的量逐步少量 增加。以后每次免疫后 7~10 d均断尾采血 ,2000 r/min离心 5 min,分离得到多抗血清。 l_2.2.4 多抗血清的检测 对小鼠编好号 ,断尾采 血 ,将包被原 1:40稀释,抗血清 1:100稀释 ,二抗 采用 1:1000稀释,按照 1间接 ELISA(李金明, 2005)测定抗血清效价,结果以测定参考值为阴 性对照值的 2倍 以上为临界判定值。结果判定:① 肉眼观察 :每孔与阴性对照孔和空白对照孔比较 ,含 有特异性抗体孔呈橙黄色,颜色随抗体量增加而加 深。②吸光度测定:用酶标仪测 D伽 值,以空白对 照调零,阴性对照 D 值为 N,阳性对照 D 。。 值 为 P。若 P/N>2.1判为阳性。 巾闷告牧 兽医 2010年第 37卷第 3期 疾病防治 · l73 · 注:每步结束后均需用洗涤液洗涤 3次.每次 4 rain。 1.2.2.5 多抗 血 清敏 感性 测 定 参 考 周 斌 等 (2002)的方法对多抗血清进行敏感性试验,其操作 程序 1~2步同“间接 EI ISA 的操作程序”,第 3步 在加一抗之前 ,先将血清稀释至 l:100后加至小离 心管内,180 L/管,然后加入系列浓度药物(浓度范 围为 l~ 10 ng/mI )20 I ,对 照管 只加 2O I PBS,置 37_( ',避光 15~30 rain,再加入到 96孔板 相邻两孔 ,100 I /-tL,其它过程 同上表 1,以 B/B0 的百分比为纵坐标和药物浓度的常用对数为横坐标 做抑制曲线 ,测定 I ⋯ 2 结果 2.1 人 工抗 原 的鉴 定结 果 2。1.1 三氯化铁法 对透析 2 d后的产物 l mI 加 入 200/xI 盐酸(1 tool/L),再加三氯化铁溶液 2滴 , 结果 现红棕色 ,说明透析后产物含有盐酸四环素 , 人 丁抗原制备成功 。 2.1.2 紫外扫描 法 将 BSA、OVA、TCH、TCH— BSA和 TCH—oVA 5个样品用磷酸缓 冲液配制好, 经紫外分光光度计 扫描后结果见 图 2,根据 UV吸 收的合加性原理可知,TCH—BSA 和 TCH一()VA的 吸收光谱是 TCH吸收光谱与蛋 白质 吸收光谱 的整 合 ,且偶合物 的吸收 曲线与半抗原和载体的吸收 曲 线不同时,表 明半抗原 TCH 已分别 与载体 BSA 和 OVA交联 成功。扫描 TCH—BSA, 值为0.678, 。 值为0.552,其蛋 白质含量为 0.575 mg/mI 。扫 描 TCH一()VA,D) 值为 0.446, 值为 0.582,其 蛋白质含量为 0.514 mg/m[ 。TCH在 361 nin波长处 的吸收值为 0.7183,浓度为0.00002 mol/L,依据朗伯 比尔定律 £一A/CL,计算出 TCH的摩尔消光系数为 3.45×10 ,依据公式计算出 TCH BSA和 TCH—OVA 的摩尔结合比分别约为 3.4:l和 4.2:1。 图 2 半抗原 、载体蛋 白质和偶联物紫外扫描 图 2.2 多抗血清的鉴定结果 对三免后的小 鼠断尾 采 ,间接 ELISA测定 D值 ,3只小 鼠均出现 了阳 性结 果 (表 2),且 效 价 达 1:51200。间 接 竞 争 EI ISA阻断试验结果 (图 3)表明,盐酸四环素浓度 在 1.7~316 ng/mI 范围内,小鼠多抗抑制 曲线呈 良好的线性关系,其 中鼠 1抑制性最好 ,其抑制曲线 回归方程为 y===一26.18X+82.15,R 一0.9944,鼠 l的 IC 。为 16.91 ng/mI ,低于 鼠 2和鼠 3。 3 讨 论 3.1 人 工抗 原的制备 盐酸 四环素分子 质量为 480.9 ku,不足以作为完全抗原免疫动物制备抗体 , 为此需要联结载体制备人工抗原。盐酸四环素含有 功能团酰胺基 ,能在溴水碱液中发生霍夫曼降解失 去 一个碳原子转变成伯胺盐 ,但是反应应在低温下 %∞踮舳 ∞∞%鲫 ∞ ∞ 坫 ∞ · 174 · 疾病防治 中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期 lg(TCH浓度) 图 3 间接竞争 ELISA检测鼠血清对 TCH的抑制曲线 进行 ,伯胺盐在亚硝酸钠的酸性溶液中生成重氮盐 , 而重氮盐能与蛋白质的酪氨酸偶联,从而制备人工 抗原。但因重氮盐不稳定 ,反应环境要严格控制在 暗室酸性低温环境下进行 ,笔者因没有控制好上述 反应的条件,合成产物出现絮状沉淀,导致制备失 败 ,而免疫动物周期长,重复试验而耗费 了很多时 间,因此制备的关键要控制好反应条件 ,保证在低温 暗环境 中操作 。 3.2 人工抗原的鉴 定 盐酸 四环素易被氧化剂氧 化,破坏其酚羟基而从 自身的淡黄色转变为棕色。 在合成免疫原过程中,酚羟基没有破坏,从而根据其 表 2 多抗 血清 D值 稀释倍数 100 200 400 800 1600 3200 6400 I2800 25600 51200 空白 阴性 特性采用三氯化铁溶液也可初步判定合成产物是否 联结成功。 盐 酸 四环素 因含 有酮 基和 烯醇 基 的共 轭双 键 ,在紫外扫描时分别在 350和 265 nm处 出现特 征峰(卢运战等 ,2006),本次扫描图谱基本符合上 述情况 ,合成人工抗原过程中先发生霍夫曼反应 、 重氮化,再与蛋白质偶联 ,影响 了盐酸四环素的共 轭双键系统,致使 350 nrD_处 的特 征峰消失 或 减小。 虽然以上鉴定 能 初步 断定 人 工抗 原制 备 成 功 ,但还 需要进 一步确认 ,笔者将 免疫 原免疫 小 鼠,断尾 采 血 ,用 间接 ELISA检 测 ,出现 阳性结 果并做 间接 ELISA检测 ,抑制 效果好 ,表 明盐 酸 四环素多抗产生 ,充分证 明免疫原及包 被原制备 成功 。 参 考 文 献 1 尤启冬.药物化学[M].北京:化学工业出版社,2004,482~486. 2 卢运 战,祁克宗 ,朱 良强.四环素类药物残 留检测 方法研究进展 EJ].家禽科学,2006(10):36~37. 3 孙远明,黄丽,潘科,等.测定克喘素免疫偶合物分子结合摩尔比 的紫外一可见分光光度法lJ].分析测试学报,2002,21(4):41~ 43. 4 李志勇.细胞工程[M].北京:科学出版社,2003,139. 5 李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社,2005, 11~ 87. 6 周斌,石德时,覃雅丽,等.氯霉素间接竞争 ELISA检测方法的建 立EJ].中国兽医学报,2002,22(1):77~79. 7 徐玫.药物分析[M].北京:中国医药科技出版社,2007,301~ 302. 8 滑静,徐修远,于同泉,等.氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体 的制备[J].药物检测,2007,21(4):32. 9 蔡会武,曲建林.有机化学实验[M].西安:西北工业大学出版社, 2007,172,216~ 218. Synthesis and Identification of Artificial Antigen against Tetracycline Hydr0chl0ride ZHANG Gui—xian (College of Life Science,Linyi Normal College,Linyi 276005,China) Abstract:Hofmann degradation and diazo—reaction of Tetracycline hydrochloride(TCH)happened and COnjugated to pro— tein-carrier(BSA,0VA).The COnJuagates were synthesized by the means of FeC13 resolution and UV scanning spectra,and mol conjugation ration of TCH to BSA was 3.2:1 and TCH to OVA was 4.2:1.The immunogen(TCH—BSA)was immunized to BALB/c mice and polycolnal antibodies were obtained.Tiler of the antibodies were 1:5 1 200 by the indirect ELISA and ICso was 16.91 ng/mL by the competitive indirect EI ISA.It showed that the artificial—synthesized antigen had immunogenicity. Key words:Tetracycline hydrochloride;Hofmann degradation;diazo—reaction;conjugation;carrier 佃 1 1 l O O 0 2 6 9 1 9 7 1 O 0 O O 0 1 1 7 9 4 4 4 5 4 0 O O 2 1 4 4 2 8 0 6 5 O 0 0 4 1 2 0 2 2 6 7 6 O 0 O 3 4 7 r0 1 8 7 o0 7 0 O 0 8 8 8 O O 0 4 2 7 1 1 6 9 9 9 0 0 0 3 4 5 8 4 6 O 9 O 1 0 1 0 3 O l O 1 ∞ 毖 J 1 1 } o0 1 2 2 4 1 6 2 2 11 1 1 1 2 3 鼠 鼠 鼠
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