盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定
中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期 疾病防治 ·171 ·
盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定
张桂贤
(山东临沂师 范学 院生命科学学院 ,临沂 276005)
摘要:本试验旨在合成盐酸四环素人工抗原,为其单克隆抗体的制备奠定试验基础。将盐酸四环素(TcH)发生霍夫曼降
解和重氮化反应生成重氮盐 ,再 与蛋白质 载体(BSA,0VA)偶 联生成 免疫原 和包被 原 ,对 偶联 产物采 用三氯化 铁及紫 外扫描
法鉴定偶 联成功 ,且免疫原 和包 被原 的摩 尔结合 比分别约为 3.4:1和 4.2:1...
中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期 疾病防治 ·171 ·
盐酸四环素人工抗原的合成及鉴定
张桂贤
(山东临沂师 范学 院生命科学学院 ,临沂 276005)
摘要:本试验旨在合成盐酸四环素人工抗原,为其单克隆抗体的制备奠定试验基础。将盐酸四环素(TcH)发生霍夫曼降
解和重氮化反应生成重氮盐 ,再 与蛋白质 载体(BSA,0VA)偶 联生成 免疫原 和包被 原 ,对 偶联 产物采 用三氯化 铁及紫 外扫描
法鉴定偶 联成功 ,且免疫原 和包 被原 的摩 尔结合 比分别约为 3.4:1和 4.2:1。用免疫原 免疫 BAI B/c小 鼠,用间接 ELISA
检测抗体效价 ,采用竞争 ELISA法测 IC 获得 了效价 为 1:51200、ICj。为 16.91 ng/mL的多克隆抗体 ,最终证 明人工抗原制
备成功 。
关键词:盐酸四环素;霍夫曼;重氮化;偶联;载体
中图分类号 :$859.79 6 文献标识码 :A 文章编号 :1671—7236(2010)03—0171一O4
四环素是以四并苯为母核 的一类抗生素 ,具有
抗菌谱广 、毒性小和过敏反应少的特点 ,能抑制革兰
氏阳性菌 、革兰氏阴性菌 、立 克次体 、病毒和原虫等
(尤启冬 ,2004),被广泛应用于畜牧业。但因该类药
物的滥用已给动物性食 品安全带来隐患,其在动物
体 内的残留对人类健康造成威胁 。目前动物源性食
品中,四环素类抗生素的检测普遍采用高效液相色
谱法(卢运战等 ,2006),此法操作复杂,所需试剂设
备昂贵 ,因此不能推广 ,而免疫分析法具 有简便 、快
速、准确等优点 ,因此建立 四环素类抗生素在动物性
食品中的免疫学检测法具有重要意义。四环素类抗
生素 具 有 两性 ,以其 盐 酸 盐 应 用 最 广 (顾 觉 奋 ,
2001).本试 验 以盐 酸 四环素 (Tetracycline hydro—
chloride,TCH)作为研究对 象,合成 人工抗原并免
疫 BALB/c小 鼠获得了多克隆抗体 ,为该类药物单
克隆抗体的制备奠定试验基础。
1 材料与方法
1.1 试验材 料
1.1.1 主要试剂 盐酸四环素(TCH)购 自北京鼎
国生物公 司;牛血清 白蛋 白(BSA)为中国医药上海
化学试剂公司产品;卵清蛋 白(OVA)购 自Sigma公
司;HRP标记羊抗 鼠 IgG购 自北京鼎国生物公 司;
邻苯二胺 (OPD)购 自上海 白鹤化工厂 ;弗氏完 全佐
剂和弗氏不完全佐剂购 自北京鼎国生物公司 。
1.1.2 主要溶液 盐酸四环素溶液:准确称取盐酸
四环素纯品 15 mg,加入 2 mL双蒸水 ,置于 4℃冰
收稿 日期 :2009—10—14
作者简介 :张桂贤(1977一),女 ,新疆 人 ,助 教 ,硕士生 ,研究 方
向 :动物疫病诊疗技术 。
箱保存 。蛋 白质 载体溶 液 :分 别准确称 取 BSA 和
OVA 20 mg于 1 mL双蒸水中,置 4℃冰箱保存 。
三氯化铁试液 :准确称取 FeC1。9 g,加 双蒸水溶解
至 100 mL,置 4℃冰箱保存 ,限 2 d内使用。次溴
酸钠试液 :准确称 取 NaOH 2O g,加双蒸水 75 mL
溶解后 ,加入溴水 5 mL,再加双蒸水至 100 mL,现
用现配。10 亚硝酸钠溶液 :准确称取 NaNO 10
g,加双蒸水溶解至 100 mL,置 4。C冰箱保存 。包被
缓冲液 :准确称 取 NaCO。0.85 g,NaHCO。1.4 g,
双蒸水定容至 500 mL,4|C冰箱保存 。洗涤液 :每
100 mL PH 7.4 PBS中加入 5O肛L的 Tween一2O,摇
匀即可 ,4。C冰箱保存 。封闭液 (5 脱脂乳):准确
称取 5 g脱脂奶粉溶于 100 mL pH 7.4 PBS中,4
。C冰箱保存 。抗体稀 释液 :pH 7.4,0.01 mol/L的
PBS,4℃冰箱保存 。底物缓冲液(枸橼酸一磷酸缓
冲液):枸橼酸 0.51 g,1.84 g Na。HPO ·12H2O
定容于 100 mL纯水中,4。C冰箱保存 。显 色液 :准
确称取 OPD(邻苯二胺)5 mg,溶于 1O mL底物缓冲
液中,再加入 3O ddH O 15 L,混匀即可,现配现
用 ,终止液(1o 硫酸):量取浓硫酸 10 mL,逐滴加
入到 90 mL双蒸水 中,混匀 ,室温保存 。
1.1.3 主要 器材 U一1800型紫外分光光度计为 日
本 日立公司产 品;sUNRISE型酶标仪为瑞 士 TE—
CAN公 司产 品;96孔 可拆 式酶标板购 自浙江省临
海市华威分析仪器有限公司;TGL 16G型台式离心
机为上海安亭科学仪器厂生产 ;JA2003A型电子天
平为上海精天 电子仪器有 限公 司产品;SZ一97自动
三重纯水蒸馏器为上海亚荣生化仪器厂生产。
1.1.4 试验动物 SPF级 6~8周龄雌性 BALB/c
小鼠 4只,由临沂师范学院实验中心提供。
·172 · 疾病防治 中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期
1.2 方法 成路线如图 1所示 ,其具体合成过程如下。
1.2.1 人工抗原的合成 盐酸四环素人工抗原合
0
ff
N NC
0H
CH3
protein protein—C00H
HC1 ·}—————————————一
Cth
}NaN02+HC1
’
图 1 盐酸 四环素人工抗原合成路线
1.2.1.1 霍夫曼反应 盐酸四环素 (结构式见 图
1)含有酰胺能在溴水碱液中发生霍夫曼降解生成少
一 个碳原子的伯胺盐 。准确量取 1.5 mL预冷 的盐
酸四环素溶液 ,滴加预冷的次溴酸钠溶液 ,直至溶液
变为棕色,同时用手振摇(蔡会武等 ,2007)。
1.2.1.2 重氮反应 将上述制备好的溶液加入预
冷的稀盐酸(1 mol/L),调 pH 为 2.5,然后在 阴暗
避光的环境下逐滴加入亚硝酸钠溶液 同时用手振
摇 ,期间用碘化钾试纸检验 ,变为深蓝色终止滴加,
置于 4℃冰箱中 1 h待充分反应,加入 2~3滴氨基
磺酸胺溶液以除去 NO/(滑静等,2007;蔡会武等,
2007)。
1.2.1.3 蛋白质栽体 与盐酸四环素偶联 将上步
制备好的溶液逐滴加入到蛋 白质溶液 中,然后用氢
氧化钠溶液(0.25 mol/L)调 pH为 7.5,置于 4℃
冰箱 24 h,随后在此环境中用 PBS(0.01 mol/I ,pH
7.2)透析 2 d,期间换液 3次,收集透析液即得 目的
产物。
1.2.2 人工抗 原的 鉴定
1.2.2.1 三氯化铁法 盐酸四环素在酸性环境中
加入三氯化铁溶液 ,会变成红棕色,为盐酸四环素特
性(徐玫,2007),通过此法可判定透析外液是否含有
盐酸四环素 ,同时也可判定透析产物是否含有盐酸
四环素 。
1.2.2.2 紫外扫描 法 制备好扫描
液及人工
抗原溶液 ,通过紫外分光光度计扫描 ,比较透析产物
的特征峰是否是盐酸四环素和蛋自载体特征峰的叠
加 ,且出现 了偏移 ,并根据孙远明等(2002)的方法计
算结合 比,依据朗伯 比尔定律 e—A/CI 计算 出
N 2 C1一
OH ,HC1
CHa
TCH的摩尔消光系数 e ,再按下式计算摩尔结合
比。
n(TCH)/n(BSA)一 (ATCH-BSA/£TcH)/CBSA
n(TCH)/n(OVA)==(ATcH一【)vA/eTcH)/CovA
A 一BS ,A川 )vA分别 为偶联物 TCH—BSA 和
TCH—OVA在 TCH 最大波 长处 的吸收值 ;CBsA和
C wA分别为 BSA 和 OVA的摩尔浓度。
1.2.2.3 多抗血清的制备 将制备成功的免疫原 ,
根据紫外扫描的D值参考杨立国等(1998)的方法,
当 D 8。 /D。 <1.5时,蛋 白质含量(mg/mL)一
(1.45×D。。。 ~0.74×D 。 )x稀释倍数,粗略估
算结合蛋白浓度,以确定免疫剂量。取制备成功 的
免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化,依据估算浓
度保证每只小鼠的剂量达到 100 g/只(李志勇,
2009),采用腹腔注射免疫 3只小鼠,剩下 1只作为
阴性对照 。第 14、35天将弗氏完全佐剂换成弗氏不
完全佐剂同法进行加强免疫 ,免疫原 的量逐步少量
增加。以后每次免疫后 7~10 d均断尾采血 ,2000
r/min离心 5 min,分离得到多抗血清。
l_2.2.4 多抗血清的检测 对小鼠编好号 ,断尾采
血 ,将包被原 1:40稀释,抗血清 1:100稀释 ,二抗
采用 1:1000稀释,按照
1间接 ELISA(李金明,
2005)
测定抗血清效价,结果以测定参考值为阴
性对照值的 2倍 以上为临界判定值。结果判定:①
肉眼观察 :每孔与阴性对照孔和空白对照孔比较 ,含
有特异性抗体孔呈橙黄色,颜色随抗体量增加而加
深。②吸光度测定:用酶标仪测 D伽 值,以空白对
照调零,阴性对照 D 值为 N,阳性对照 D 。。 值
为 P。若 P/N>2.1判为阳性。
巾闷告牧 兽医 2010年第 37卷第 3期 疾病防治 · l73 ·
注:每步结束后均需用洗涤液洗涤 3次.每次 4 rain。
1.2.2.5 多抗 血 清敏 感性 测 定 参 考 周 斌 等
(2002)的方法对多抗血清进行敏感性试验,其操作
程序 1~2步同“间接 EI ISA 的操作程序”,第 3步
在加一抗之前 ,先将血清稀释至 l:100后加至小离
心管内,180 L/管,然后加入系列浓度药物(浓度范
围为 l~ 10 ng/mI )20 I ,对 照管 只加 2O I
PBS,置 37_( ',避光 15~30 rain,再加入到 96孔板
相邻两孔 ,100 I /-tL,其它过程 同上表 1,以 B/B0
的百分比为纵坐标和药物浓度的常用对数为横坐标
做抑制曲线 ,测定 I ⋯
2 结果
2.1 人 工抗 原 的鉴 定结 果
2。1.1 三氯化铁法 对透析 2 d后的产物 l mI 加
入 200/xI 盐酸(1 tool/L),再加三氯化铁溶液 2滴 ,
结果 现红棕色 ,说明透析后产物含有盐酸四环素 ,
人 丁抗原制备成功 。
2.1.2 紫外扫描 法 将 BSA、OVA、TCH、TCH—
BSA和 TCH—oVA 5个样品用磷酸缓 冲液配制好,
经紫外分光光度计 扫描后结果见 图 2,根据 UV吸
收的合加性原理可知,TCH—BSA 和 TCH一()VA的
吸收光谱是 TCH吸收光谱与蛋 白质 吸收光谱 的整
合 ,且偶合物 的吸收 曲线与半抗原和载体的吸收 曲
线不同时,表 明半抗原 TCH 已分别 与载体 BSA 和
OVA交联 成功。扫描 TCH—BSA, 值为0.678,
。 值为0.552,其蛋 白质含量为 0.575 mg/mI 。扫
描 TCH一()VA,D) 值为 0.446, 值为 0.582,其
蛋白质含量为 0.514 mg/m[ 。TCH在 361 nin波长处
的吸收值为 0.7183,浓度为0.00002 mol/L,依据朗伯
比尔定律 £一A/CL,计算出 TCH的摩尔消光系数为
3.45×10 ,依据公式计算出 TCH BSA和 TCH—OVA
的摩尔结合比分别约为 3.4:l和 4.2:1。
图 2 半抗原 、载体蛋 白质和偶联物紫外扫描 图
2.2 多抗血清的鉴定结果 对三免后的小 鼠断尾
采 ,间接 ELISA测定 D值 ,3只小 鼠均出现 了阳
性结 果 (表 2),且 效 价 达 1:51200。间 接 竞 争
EI ISA阻断试验结果 (图 3)表明,盐酸四环素浓度
在 1.7~316 ng/mI 范围内,小鼠多抗抑制 曲线呈
良好的线性关系,其 中鼠 1抑制性最好 ,其抑制曲线
回归方程为 y===一26.18X+82.15,R 一0.9944,鼠
l的 IC 。为 16.91 ng/mI ,低于 鼠 2和鼠 3。
3 讨 论
3.1 人 工抗 原的制备 盐酸 四环素分子 质量为
480.9 ku,不足以作为完全抗原免疫动物制备抗体 ,
为此需要联结载体制备人工抗原。盐酸四环素含有
功能团酰胺基 ,能在溴水碱液中发生霍夫曼降解失
去 一个碳原子转变成伯胺盐 ,但是反应应在低温下
%∞踮舳 ∞∞%鲫 ∞ ∞ 坫 ∞
· 174 · 疾病防治 中国畜牧兽医 2010年第 37卷第 3期
lg(TCH浓度)
图 3 间接竞争 ELISA检测鼠血清对 TCH的抑制曲线
进行 ,伯胺盐在亚硝酸钠的酸性溶液中生成重氮盐 ,
而重氮盐能与蛋白质的酪氨酸偶联,从而制备人工
抗原。但因重氮盐不稳定 ,反应环境要严格控制在
暗室酸性低温环境下进行 ,笔者因没有控制好上述
反应的条件,合成产物出现絮状沉淀,导致制备失
败 ,而免疫动物周期长,重复试验而耗费 了很多时
间,因此制备的关键要控制好反应条件 ,保证在低温
暗环境 中操作 。
3.2 人工抗原的鉴 定 盐酸 四环素易被氧化剂氧
化,破坏其酚羟基而从 自身的淡黄色转变为棕色。
在合成免疫原过程中,酚羟基没有破坏,从而根据其
表 2 多抗 血清 D值
稀释倍数 100 200 400 800 1600 3200 6400 I2800 25600 51200 空白 阴性
特性采用三氯化铁溶液也可初步判定合成产物是否
联结成功。
盐 酸 四环素 因含 有酮 基和 烯醇 基 的共 轭双
键 ,在紫外扫描时分别在 350和 265 nm处 出现特
征峰(卢运战等 ,2006),本次扫描图谱基本符合上
述情况 ,合成人工抗原过程中先发生霍夫曼反应 、
重氮化,再与蛋白质偶联 ,影响 了盐酸四环素的共
轭双键系统,致使 350 nrD_处 的特 征峰消失 或
减小。
虽然以上鉴定 能 初步 断定 人 工抗 原制 备 成
功 ,但还 需要进 一步确认 ,笔者将 免疫 原免疫 小
鼠,断尾 采 血 ,用 间接 ELISA检 测 ,出现 阳性结
果并做 间接 ELISA检测 ,抑制 效果好 ,表 明盐 酸
四环素多抗产生 ,充分证 明免疫原及包 被原制备
成功 。
参 考 文 献
1 尤启冬.药物化学[M].北京:化学工业出版社,2004,482~486.
2 卢运 战,祁克宗 ,朱 良强.四环素类药物残 留检测 方法研究进展
EJ].家禽科学,2006(10):36~37.
3 孙远明,黄丽,潘科,等.测定克喘素免疫偶合物分子结合摩尔比
的紫外一可见分光光度法lJ].分析测试学报,2002,21(4):41~
43.
4 李志勇.细胞工程[M].北京:科学出版社,2003,139.
5 李金明.临床酶免疫测定技术[M].北京:人民军医出版社,2005,
11~ 87.
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立EJ].中国兽医学报,2002,22(1):77~79.
7 徐玫.药物分析[M].北京:中国医药科技出版社,2007,301~
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8 滑静,徐修远,于同泉,等.氯霉素人工抗原的合成及多克隆抗体
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9 蔡会武,曲建林.有机化学实验[M].西安:西北工业大学出版社,
2007,172,216~ 218.
Synthesis and Identification of Artificial Antigen
against Tetracycline Hydr0chl0ride
ZHANG Gui—xian
(College of Life Science,Linyi Normal College,Linyi 276005,China)
Abstract:Hofmann degradation and diazo—reaction of Tetracycline hydrochloride(TCH)happened and COnjugated to pro—
tein-carrier(BSA,0VA).The COnJuagates were synthesized by the means of FeC13 resolution and UV scanning spectra,and
mol conjugation ration of TCH to BSA was 3.2:1 and TCH to OVA was 4.2:1.The immunogen(TCH—BSA)was immunized
to BALB/c mice and polycolnal antibodies were obtained.Tiler of the antibodies were 1:5 1 200 by the indirect ELISA and ICso
was 16.91 ng/mL by the competitive indirect EI ISA.It showed that the artificial—synthesized antigen had immunogenicity.
Key words:Tetracycline hydrochloride;Hofmann degradation;diazo—reaction;conjugation;carrier
佃
1 1 l
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