HPLC 基础理论

nullnull 液相色谱基础理论 美国瓦里安技术中国有限公司 液相色谱基础理论液相色谱基础理论培训课程大纲 1 液相色谱法发展史与分类 2 色谱方法基本原理 3 流动相及色谱柱的选择 4 样品方法开发 1 液相色谱发展历史与分类1 液相色谱发展历史与分类1.1 色谱的起源 1.2色谱的发展历程 1.3色谱的定义 1.4 色谱中的分离过程 1.5 色谱的分类 1.6 色谱仪介绍1.1 色谱的起源 (1903)1.1 色谱的起源 (1903)M.S. Tswett1.2 色谱的发展历程1.2 色谱的发展历程1.2 色谱的发展历程1.2 色谱的发展历程1.3 色谱的定义1.3 色谱的定义IUPAC definition of chromatography (1993) : Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary while the other moves in a definite direction. 固定相（stationary phase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。 流动相（mobile phase）：带动样品向前移动的另一相。 色谱法：是一种物理化学分离方法，它利用不同组分与两相（固定相和流动相）之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，样品在两相中做相对移动时，各组分在两相间进行多次平衡，使不同物质达到相互分离。1.4 色谱中的分离过程1.4 色谱中的分离过程组分为何需要分离???1.4 色谱中的分离过程1.4 色谱中的分离过程流动相固定相利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离1.5 色谱的分类1.5 色谱的分类按流动相的物态分: –气相色谱(Gas Chromatography, GC)： 用气体作为流动相(又叫载气) –液相色谱(Liquid Chromatography, LC)： 用液体作为流动相(又叫洗脱剂)􀂃 按固定相的形态分: –平面色谱􀂃 纸色谱􀂃 薄层色谱 –柱色谱 􀂃按流动相和固定相的相对极性 –正相色谱(Normal Phase Chromatography) 固定相的极性大于流动相 –反相色谱(Reversed Phase Chromatography) 固定相的极性小于流动相1.5 色谱的分类1.5 色谱的分类 反相色谱目前应用最普遍液相和气相色谱目前最常用HPLC 与 GC 的应用差异HPLC 与 GC 的应用差异HPLC 与 GC 的应用差异HPLC 与 GC 的应用差异挥发非挥发疏水性亲水性糖环氧化合物多氯联苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5 碳氢化合物无机离子氨基酸糖类衍生物香精油聚合物单体甘油三酸酯磷脂亚硝胺有机磷 杀虫剂酒精多环芳烃芳族胺脂溶性维生素抗体天然食用色素类黄酮抗生素腈类抗氧化剂乙二醇脂肪酸磺胺类挥发性羧酸醛酮类甘草膦合成食用色素苯酚黄曲霉毒素酶糖醇吸附法吸附法固定相为固体 硅胶 和 氧化铝 是最常用的固定相 因一连串吸附/脱附步骤形成分离 不同物质与固定相之间的吸附程度不同造成分离分配法分配法溶质基于在两相之间的分配系数而分离 保留时间长的物质与固定相亲和力较强 两种基本操作模式 正相：极性固定相、非极性流动相 反相：非极性固定相、极性流动相分子排阻法分子排阻法依照分子大小分离 固定相具有不同大小孔径 大分子先流出，因其走的路径较短 应用在判定聚合物、蛋白质分子量及其范围离子交换法离子交换法固定相面带与分析物相反电荷 一般使用弱离子交换树脂 因电荷相互作用力的强弱产生分离 1.6 色谱仪介绍1.6 色谱仪介绍ProStar 和 PrepStar产品 ProStar 和 PrepStar产品 从分析、半制备到生产规模 制备液相色谱的专业公司 半制备液相色谱中试规模制备色谱工业规模制备色谱分析液相色谱HPLC 模块HPLC 模块泵：ProStar 210 单泵，二元高压泵，ProStar 230(三元泵），ProStar 240（四元泵），PrepStar 218，SD-1，SD-2 检测器：ProStar 325 UV/VIS 检测器，ProStar 335 二极管阵列， ProStar 363荧光检测器，ProStar 355 示差检测器， ProStar370 电化学检测器，ELSD，MS，MS/MS 自动进样器：ProStar400，410，420，430 组分收集仪：ProStar 701， 704 柱温箱：ProStar500， Metertherm 循环系统： Prostar530 液相色谱的应用 液相色谱的应用 瓦里安高效液相色谱产品系列瓦里安高效液相色谱产品系列传输泵 自动进样器检测器质谱2. 色谱方法基本原理2. 色谱方法基本原理色谱基本理论色谱基本理论色谱的主要理论 热力学理论 以相的平衡观点研究色谱过程 塔板理论为代表 (Martin & Synge) 动力学理论 以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 Van Deemter 方程为代表MartinSynge 分离的原理 分离的原理样品组分在固定相和流动相之间的分配 流动相带动样品经过色谱柱 不同组分与固定相之间相互作用 的强度不同 不同组分在固定相上移动速度不同， 形成分离 分配系数 KD Xm Xs KD1 = [Xs] / [Xm] Ym Ys KD2 = [Ys] / [Ym] 固定相流动相 样品组分的分离 样品组分的分离 进样、分配、移动、流出、分离 KD2< KD1 ，所以 Y 先流出來 分配系数K 分配系数K分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。 在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。 在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。 在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。 样品组分分离情况样品组分分离情况A. 样品与色谱柱固定相无任何作用 三种样品在 t0 时间流出， 无保留 无保留时间 B. 样品组分保留时间一致 与色谱柱作用力相同 C. 样品组分保留时间不一致 样品各组分与色谱柱作用力不同 D. 实际分离状况 高斯分布曲线 色谱出峰形状 色谱出峰形状实际出峰形状为高斯分布曲线 (Gaussian curve) 样品的扩散效应无扩散 样品扩散 分离度 分离度 分离度（Resolution) 两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示： R=? 时两峰认为已分开? 不同分离度 R 不同分离度 R相邻两吸收峰分离度 R=1.0, 98%, 基线分离 R=1.5, 99.7% R＞=1.5 時，完全分离（中国药典） 两色谱峰被视为 分开 分离度R 的数学表达 分离度R 的数学表达分离度R的基本公式: (塔板理论, Martin & Synge) k’: 容量因子 (capacity factor) 反映吸收峰的保留特性 : 选择因子 (selectivity factor) 反映相邻两色谱峰的分离程度 ——色谱过程热力学因素 N: 理论塔板数，反映色谱柱的分离效率 (column efficiency)——色谱过程动力学因素有关容量因子选择因子柱效 容量因子 k’ 容量因子 k’ 测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数（量）之比 与温度有关 (GC) 与流动相溶剂种类及组成有关 (LC) 容量因子 k’（续） 容量因子 k’（续）k’ 决定样品能进入色谱柱固定相的量 k’太小，在固定相上保留太短，很快流出，难以确定保留时间 k’太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长， 理想的 k’为 1～5 分离效果与 k’ 值的最优化 分离效果与 k’ 值的最优化 k’值的优化 改变溶剂成分、梯度条件 (洗脱强度) 选择因子 选择因子 色谱柱分开两组份的能力  ＞1 时两组分分离 表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。 Injectiont0t’R1t’R2选择因子  的影响因素选择因子  的影响因素影响  的因素 改变流动相成分，包括改变 pH 值 改变柱温 (在 LC 不明显) 改变固定相成分 使用特殊化学效应选择因子  的影响因素 （续）选择因子  的影响因素 （续） 改变色谱柱类型理论板数 N理论板数 N塔板理论 热力学平衡理论 色谱柱效的量化 从分馏法技术衍生而来 分离法依组分挥发性不同而分馏 色谱法依组分分配系数不同而分离 分配系数 K=Cs/Cm 理论板数 N、塔板高度 H 柱效随 N增大和 H减小而增加 分配色谱模型理论塔板数 N的表达 理论塔板数 N的表达 理论塔板数N 与半峰宽W1/2和保留时间的关系如下 在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高 k’,  和 N之间的关系 k’,  和 N之间的关系速率理论速率理论塔板理论的限制 不连续步骤的平衡可成功解释 吸收峰流出曲线 评价柱效 不符合实际分离状况 分配平衡与纵向扩散 无法解释柱效随流动相流速改变而不同 速率理論的提出 1956 年Ven Deemter 提出 GC 速率理论公式 1956 年Giddings & Snyder 提出 LC 速率理论公式H 线性流速实验发现 GC 载气流速低时 层析峰尖銳，超过某一流速 時层析峰变宽影响塔板高度H的因素影响塔板高度H的因素Ven Deemter 公式解释色谱柱行为 A：涡流扩散，与填料粒径成正比 B/u：纵向扩散，流速越快纵向扩散越不显著 Cu：质量传递，流动相流速越高，平衡时间越短H = A + B/u + Cu涡流扩散 (A)涡流扩散 (A)取决于色谱柱填料的粒径和形状 与固定相粒径有关 与色谱柱填充方式有关 在毛细柱中可忽略H = A + B/u + Cu涡流扩散 (A)涡流扩散 (A)A=2λdp λ：不均匀因子 dp ：固定相平均粒径 使用 3-10 um 填料 柱子填充技术影响极大 填料粒径越小、A 值越小 A 值越小、塔板高度越小填料粒径大小H = A + B/u + Cu纵向扩散 (B/u)纵向扩散 (B/u)分子在气相中扩散 液相色谱纵向扩散不明显 (～0) 主要取决于流量 流速与纵向扩散成反比 流速越慢纵向扩散越明显H = A + B/u + Cu纵向扩散 (B/u)纵向扩散 (B/u)B/u=2γDM /u u：流动相线速度 γ：阻碍因子 充填管柱 = 05.-0.7；毛細管 = 1 DM：扩散系数 与载气分子量平方根成反比 在液相色谱中可忽略，B/u～0 H = A + CuH = A + B/u + Cu质量传递 (Cu)质量传递 (Cu)分子在流动相与固定相间传递的难易度 溶质在流动相与固定相间平衡需花一点时间 相当程度地由流量及固定相的总量決定 流速越快、平衡时间越短，变宽效应变大H = A + B/u + Cu柱外效应柱外效应柱外死体积 进样阀、连接管路、接头、检测器流动池高效能的色谱分析的要求高效能的色谱分析的要求从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施： ①进样时间要短。 ②填料粒度要小。 ③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。 ④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度，在此线速度时，H最小。 ⑤较小的检测器死体积。 分离效能的最优化 分离效能的最优化增加容量增加选择因子增加柱效增加 k’ 值可增加分离度 但会增加分析时间改变流动相、固定相成分 增加  值可增加分离度 但不能因此影响 k’ 值null3. 流动相及色谱柱的选择 流动相导论流动相导论溶剂系统 可以是一种或多种水溶液与有机溶剂 携带样品经色谱柱至检测器 当分离发生时与样品产生交互作用 溶剂必须考虑以下因素 极性与溶剂强度 纯度、过滤和脱气 与其他溶剂的混合性 缓冲溶液与PH值 等度或梯度洗脫分析溶剂的化学性质溶剂的化学性质混合性 混合性不佳的溶剂会产生气泡 预实验 粘度 高粘度溶剂会产生高的柱压，降低柱效 溶剂混合时粘度呈非线性变化溶剂互溶表溶剂互溶表溶剂的化学性质溶剂的化学性质压缩性 折光指数 (RI) 一般溶剂折光指数介于：1.30-1.40 高分子或含卤素溶剂其折光指数介于：1.35-1.50 芳香族溶剂折光指数介于：1.50-1.55 检测质量将与溶剂和溶质的折光指数差有关溶剂的化学性质溶剂的化学性质折光指数 (RI) 折光指数差与示差检测器的检测限相关 RI 差距越大，检测限越低 对紫外检测器而言， 溶质与溶剂 RI 差距越小，基线、信号越稳定溶剂的化学性质溶剂的化学性质溶剂的极性 分子的偶极距总和 总和 ＝ 0、非极性 总和 ≠ 0、极性溶剂的化学性质溶剂的化学性质溶剂强度 (strength) 强流动相会造成较少的物质保留，得到较短的分析时间反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇溶剂的化学性质溶剂的化学性质溶剂强度 (strength) 离子：反相色谱 随有机相百分比增加，分离速度也增加 高百分比的有机溶剂强度较大溶剂的化学性质溶剂的化学性质选择性 常用溶剂可分成八组，同一组有相似之特性 某种溶剂无法给出良好的分离选择性，可以用另一组来替代流动相的制备流动相的制备如何配置溶剂 混合、脱气、过滤 溶剂的混合 每一组成的溶剂在混合前必須分开测量体积再混合 两溶剂混合后的体积通常不是分开体积的总和流动相的制备流动相的制备气泡的形成 空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂 多余的气体离开溶剂形成气泡过滤过滤将流动相种的微粒去除 储液罐需加盖保护 过滤头置于溶剂进口处添加剂添加剂缓冲溶液 用來维持溶剂的 pH 值 维持生物活性或酸碱交互作用 至少添加 50-100 mM pH>7 可能会造成填料溶解 需避免发生沉淀而造成系统损伤 抗氧化剂 保护样品与溶剂选择正确的流动相选择正确的流动相恰当的流动相选择 对改善分离效果会产生重要的辅助效应 要求 本身必須稳定且不会改变色谱柱的性质 与检测器匹配 对样品具有足够的溶解能力 具有低的粘度 高纯度 容易购买且价格不能太高 避免使用显著毒性溶剂反相色谱溶剂反相色谱溶剂多数使用水当作是主要的流动相组成 (A) 水极性很强 除极性与离子溶质外所有疏水性物质都会附在固定相上造成保留 必須使用 LC 级纯水，避免系统污染 调整有机溶剂 (B)浓度 改变保留性质的主要力量 三种常见有机溶剂 乙腈, 甲醇, 四氢呋喃正相色谱溶剂正相色谱溶剂使用非极性溶剂当作主要的流动相组成 (A) 以一或多种极性较强的溶剂作改性剂 (B) 极性交互作用造成分离 流动相和固定相竞争溶质 流动相能吸附在固定相上造成溶质在固定相上吸附力減弱 痕量的水足以改变吸附表面活性 控制水含量是得到重复結果必要条件离子交换溶剂离子交换溶剂使用缓冲溶液在一 pH 值下让样品带电 酸性样品：pH 必須大于 5 碱性樣品：pH 必須小于 5 当缓冲溶液浓度增加、溶剂强度变强，减少保留 加入有机溶剂能改变保留特性与选择性 离子对试剂通常为短链离子等度与梯度洗脫等度与梯度洗脫等度溶剂不能完成所有分离 某些样品过于复杂 较早出现的峰分离度太差 晚出來的出峰变宽或拖尾 考虑梯度洗脫等度与梯度洗脱等度与梯度洗脱梯度洗脫时流动相强度随溶剂组成的改变而增强 梯度洗脫广泛适用于许多样品与生物聚合物的分离 在实验结束后可应用梯度洗脱以强溶剂清洗色谱柱 对未知样品可使用梯度洗脱找到适当的等度条件 梯度洗脫梯度洗脫梯度洗脫程序 強、弱、急、缓不需等待这一段时间全部洗脱出时即可停止null色谱柱导论色谱柱色谱柱色谱柱是色谱的心脏 分离就是在色谱柱中完成 热力学因素 分离物与固定相交互作用机理 填料的设计、合成与选择 理论板数：Martin & Synge, 1941 动力学因素 分离过程中操作参数对分离的影响 速率理论：Van Deemter, 1956 null液相色谱柱的分类按分离模式null按分离模式null按分离规模硅胶硅胶液固色谱法应用最广的极性固定相为硅胶 早期：无定型硅胶颗粒 >100 um、传质速度慢、色谱柱效率低 中期：薄壳型硅胶固定相 玻璃珠涂布硅胶微粒层 30-40 um、孔径均一渗透性好，溶质扩散快 高效、分离快速，但样品负载量少 后期：全多孔微粒固定相 <10um、粒度均匀、孔径均匀 样品负载量大 裝填短柱可实现高效、快速分离键合相键合相全多孔或薄壳型硅胶 机械強度好、表面反应活性高、表面积与孔径易控制 硅胶表面具活性強的 silonal group 加入硅烷化试剂与之反应 仍有未反应 silonal group 影响非极性键合相疏水性 吸附极性化合物或溶剂 须以小分子硅烷化试剂进行封尾处理 其他无机基质其他无机基质硅胶的缺点 化学稳定性：仅能在 pH=2-8 之间使用 残余 silanol 基团、金属离子 对碱性溶质造成不可逆吸附 易使生物样品变性，或产生特 异性吸附 氧化铝 在碱性介质中稳定性较硅胶好 表面修饰较困难 氧化锆 具有极好的酸碱稳定性，适用范围达pH=1-14 null液相色谱柱的选择样品分子量>2000 溶于水分子量>2000 溶于 THF分子量<2000溶于水溶于有机溶剂极性非极性中等极性离子性非离子性Cationic IonoSpher C Anionic IonoSpher COmniSpher C18 Microsorb C18 ChromSpher C18 Microsorb C8 ChromSpher C8 Microsorb C4OmniSpher C18 Microsorb C18 ChromSpher C18 Microsorb C8 ChromSpher C8 ChromSpher PAHChromSpher Si Microsorb SiMicrosorb CN Microsorb ODS Microsorb NH2null色谱柱的选择null色谱柱的选择除固定相选择外，还需考虑 内径、柱长、填料粒径与质量 色谱柱内径 柱子容量随内径增加而增加 小内径柱柱效较高而且省溶剂null色谱柱的选择填料粒径 10um 对某些分离来说分离度已经足够 一般建议采用5um 3um 柱效非常高，但所产生的反压很高，只能适用于短柱 当填料粒径降低，其污染与阻塞的几率就升高色谱柱的安装色谱柱的安装避免死体积、漏或是伤害柱子 使用正确的接头 尽可能缩短管路长度，降低柱外效应 管路切口必须平整 在接上管柱前先將管路中的空气排出 色谱柱安裝有方向性 接头不能锁太紧 打开输液泵，检漏null色谱柱的维护保养色谱柱的寿命 C8 或 C18 柱子一般寿命比中等极性或极性柱长 Polymer 填料具有比較高之穩定性與壽命 色谱柱的维护 避免筛板阻塞 避免机械敲打 避免吸附杂质 避免化学冲击null色谱柱的维护保养选择适当的保护柱 与管柱相同的填料 受污染时应及时更换 安裝在线过滤器去除固体颗粒 若使用一般色谱柱在 pH>8 下使用简易使用预柱null色谱柱的维护和保养流动相中不能有沉淀物 特別是有机溶剂与缓冲溶液、离子对溶液混合 色谱柱切勿在含缓冲溶液和离子对溶液中静置超过一天 环境或是生物类样品常造成吸附问题 在适当 pH 范围内使用色谱柱null色谱柱可利用化学方法再生 当发生：反压升高、柱效下降、拖尾或保留时间不对时 ◎清洗：  多次进样后，以20倍柱体积的90－100％的甲醇、 乙醇、乙腈、四氢呋喃等强溶剂清洗  对用过缓冲液的柱子，先以同浓度但不含缓冲液 成分的流动相洗20倍柱体积后，再以强溶剂洗。  有时可直接以纯水洗至柱内无盐后，再以强溶剂洗脱。 色谱柱的维护和保养null  如上述情况无效，则换用更强溶剂情况， 如逐步置换至乙酸乙酯乃至烃类情况。 返回原系统时亦应逐步更替。  可用于清洗的溶剂体系： 100％甲醇；100％乙腈 75％乙腈+25％异丙醇； 100％异丙醇 100％氯仿； 100％正已烷 50％DMSO或DMF/H2Onull 如使用有UV吸收的溶剂（如氯代烃）则需将基线洗至稳定的基线  过高的粘度会导致高压，应注意不使其超压 “掉头使用”：一般无妨，但注意若进口滤片孔大时，不可掉头  掉头使用时宜卸下检测器 null ◎蛋白质分离用柱子的清洗： 推荐的清洗溶液： 1％ 乙酸 1％ TFA 0.1％TFA－丙醇（40：60v/v） TFA－丙醇（40：60v/v，pH2.5） 尿素或盐酸胍（5－8mol/L） 无机盐（0.5-1.0 mol/L） DMSO-H2O（50：50 v/v） （DMF）  20倍柱体积以上 必要时以胰蛋白酶1%消化。null色谱柱的维护和保养色谱柱的保存 以正确溶剂保存色谱柱 色谱柱不用时将两端封住 null4. 样品分析方法开发 方法开发 方法开发 如何逐步开发HPLC方法？ 收集数据 选择固定相/色谱柱 准备样品 进行分析 优化开发新HPLC方法的主要步骤开发新HPLC方法的主要步骤收集数据验证准备仪器收集有关样品的信息 收集有关样品的信息 溶解性 检测可能性 分子量 基质 样品数据 定量分析 预期检测限 预期定量限 样品/内标 空白基质定性分析 标准样品 空白基质 数据收集什么化合物参数能用于分离 ?什么化合物参数能用于分离 ? 分子量不同 MW > 2000 凝胶渗透 / 凝胶过滤 离子化分子 离子对/ 离子交换 极性不同 吸附/ 反相色谱 同系物 / 苯系物 反相 中性、酸和碱类化合物 反相 生物分子 亲和/凝胶过滤/反相 立体异构体 吸附 手性化合物 手性色谱 判断数据收集选择初始色谱柱选择初始色谱柱选择色谱柱: 固定相 柱直径 柱长 填料粒度 孔径对于一般到较难的分离，典型的初始色谱柱为: 4.0 - 4.6 x 150-250 mm, 3.5 - 5 µm填料 80-120 Å 孔径 (小分子)仪器选择仪器选择泵 等度或梯度 泵材质要求 流速范围 (分析或制备) 连接管 金属或特殊材料 低扩散 柱箱和切换阀 检测器 灵敏度 选择性 回收注意：样品的 UV特征可能随流动相pH的变化而变化样品准备样品准备基质数据固体样品液体样品复杂基质 未知基质液-液萃取* 固相萃取 (SPE)* 沉淀-离心* 过滤稀释 过滤 冷冻干燥*溶解和过滤?样品预处理样品预处理样品预处理的目的是为了纯化样品。 完成纯化的方法有: 稀释- 用一种互溶的且比流动相弱的溶剂或流动相本身稀释样品 过滤- 有不同孔径的过滤材料. 提示: 有的化合物可能吸附在过滤器上，从而影响定量. 离心- 可除去样品中的颗粒物质. 萃取-液液萃取，固相萃取 挥发- 采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂样品处理 - 固相萃取(SPE)样品处理 - 固相萃取(SPE)SPE 步骤: 1. 预处理小柱/活化 2. 加样/溶解样品 3. 淋洗 4. 洗脱 5. 收集 6. 浓缩 7. 过滤固相萃取的目的是将被分析物与基质化合物分离开。 液体通过固相 (LC 原理) ，选择性地洗脱被分析物或即基质化合物， 基质化合物和被分析物均可用不同的溶剂洗脱，而另一个则保留。样品处理 - 液液萃取样品处理 - 液液萃取采用两种互不相溶的溶剂分离样品化合物， 基于溶解性不同实现分离。准备第一次运行准备第一次运行 准备标准样品 过滤样品 安装色谱柱 冲洗柱，平衡 平衡检测器 进样 分析结果选择流动相 在反相色谱中常用水/乙腈/甲醇 选择逐步方法开发步骤 用强洗脱液开始等梯度洗脱， 此后每次运行降低洗脱液强度 梯度尝试运行最初的结果最初的结果 无峰/响应 分离度差的峰第一次运行得到的结果可能: 浓度太稀 检测方法不正确 提高进样浓度，或者在无色 谱柱的条件下注射少量样品改变流动相 优化系统得到了色谱峰 - 是 - 否检查 HPLC系统优化概览优化概览优化应当是系统进行的，也就是说每个参数应当逐步变化. !!每次运行只改变一个参数!!目标是在最短的分析时间内获得最好的分离结果. 优化溶剂强度 流速 温度 柱长 固定相*等度还是梯度分离?等度还是梯度分离?38281.952.613.864.404.705.315.706.047.117.437.898.2325303540SOLVENT COMPOSITION (%B)如果从第一个峰到最后一个峰，%B 的变化小于 15%， 则采用等度洗脱将会节省时间.第一个峰 = 28% 最后一个峰 = 38% 变化 = 10%可以使用水/乙腈 进行等度洗脱优化流动相 - 困难的分离优化流动相 - 困难的分离1. 从甲醇/水开始，优化溶剂组成以使 所有色谱峰在合理的 k’ 范围流出. 2. 选择洗脱强度相等的乙腈/水混合流 动相进行下一次分析. 3. 用四氢呋喃/水流动相重复分析. 4. 按比例混合等强度流动相再进行四次 进样分析流动相的选择流动相的选择流动相的选择原则是： ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境。 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇分离度与 k’, N, 和  的关系分离度与 k’, N, 和  的关系梯度范围, 斜率流速, 填料粒度, 柱长温度、流动相、pH系统方法开发系统方法开发) 选择初始色谱柱 (直径, 长度, 填料粒度 ）- 4.6 x 250 mm, 5 m 使用适当的孔径 初始运行采用与流动相组成条件一致的pH ) 优化 k* (保留) 梯度范围, 时间, 斜率 流动相 - 很小变化 ) 优化回收率 样品的溶解性 温度的作用 键合相的作用 有机改性剂 ) 优化 * (选择性) 温度 键合相 pH (最后的手段) ) 优化 N (色谱柱条件) 流速 长度 填料粒度液相操作小结液相操作小结 准备流动相 Prime HPLC 系统 安装色谱柱 打开检测器 平衡色谱柱 准备样品 查看检测器基线 采用建立的方法尝试运行样品 将所得结果与预期比较 记录如何错误操作和结果，分析原因 得到满意结果Q / A Q / A null