从毛发中提取胱氨酸

从毛发中提取胱氨酸 胱氨酸是由两个β-巯基-a-氨基丙酸组织的含硫氨基酸，学名为双巯丙氨酸，白色六角形板状晶体或结晶粉末，不溶于乙醇、乙醚，难溶于水。易溶于酸、碱溶液，但在热碱溶液中可被分解。胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马毛、羽毛及动物角等的蛋白质中，其中人发含量最高，达17.6%。胱氨酸是氨基酸中最难溶于水的一种，因此可利用这种特性，通过酸性水解，从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中，分离提取胱氨酸。 原理：利用L—胱氨酸的等电点不同（ph=5）及在水和乙醇中的溶解度远小于其他氨基酸等原因分离提纯L—胱氨酸。 （一）原料及试剂 1.毛发 原料要干净，零散的毛发比较容易水解。 2.盐酸 用作水解液， 25%~30%（6mol/lHCL）、13%～14% (1~1.5mol/lHCL)。 3.氢氧化钠 用作调节PH值，可选用浓度30%～40%氢氧化钠溶液。 4.醋酸钠 作调节PH值用，选用化学纯试剂。 5.氨水（10%） 用于调节PH值，选用化学纯试剂。 6.活性炭(占结晶质量的5%~10%) 这里用作脱色剂，选用糖用和医用两种。 7.骨炭粉 主要成分是磷酸三钙、骨胶和脂肪。不溶于水。这里作脱水剂， 8.二乙胺四乙酸（EDTA 0.1%） 用于脱铁，选用化学纯试剂。 9.硫酸铜 用于判定反应终点，选用化学纯试剂。 10、无水乙醇 清洗氯离子  （二）设备 三口瓶、球星冷凝器、加热套、滴液漏斗、玻璃漏斗、加热漏斗、搪瓷盘、玻璃布、涤纶布、白纱布、温度计（0～150℃）、酸度计 （或精密PH试纸）、抽滤仪器（布氏漏斗）、试管（1*10厘米）、20支、滴管、烧杯（1000毫升）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、量筒（1000毫升、500毫升、100毫升）、恒温水浴、容量瓶（100毫升、50毫升）、搅拌器 （玻璃钢水解罐、耐酸锅、搪瓷缸、搪瓷缸、搪瓷桶、离心机、3号重熔漏斗、2号砂芯漏斗）   （三）实验操作 1.流程 废杂毛（人发）→（60~80℃左右的热水清洗）→80~90℃烘干，干净废杂毛→（102~110℃水解）→水解液→（40~60℃中和，至ph=4.8~5，搅拌30min）→胱氨酸粗品→（提纯）→沉淀物（粗品）→（精制）→结晶→（干燥）→精品 2.操作步骤 （1）清洗：除去废杂毛内混杂的泥沙、石块、草木、铁杂物等，用60~80℃左右的热水，加少量洗涤剂（纯碱），搅拌洗涤4～6分钟，洗取吸附在杂毛上的油脂，然后捞出，再用清水冲洗干净，滤干，放在通风处晒干或烘干备用。 （2）水解：a、在1000ml三口瓶中放入人发，按废杂人发量，取2倍30%盐酸，放入1000ml的三口瓶中，放入一端封口的毛细管（加热时一定要离开加热套）。装好料后的三口瓶放入加热套中装好冷凝器，温度计，每半个小时计一次温度由沸腾起6h后出料（整个水解过程必须与大气相通）。反应趁热过滤，滤液在三口瓶中。 b、（加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中，通蒸气加热到70～80℃，立即投入已清洗晒干的废杂毛适量，继续加热，间隙搅拌，使温度均匀。） 升温到100℃时开始记温，每隔半小时记温1次，在1～1.5小时内升温至110℃左右（即灌温），以后继续维持灌压14.7千帕（气压490千帕），水解13小时左右（用玻璃钢盘管加热，水解时间可缩短为6～7小时），水解期间要有回流装置，保证水解酸度，使水解更完全。水解时间可从水解罐内溶液温度达100℃时计算起。 水解完全后，停止回流（回收的盐酸可重用），立即趁热过滤。这时过滤很困难，应先用玻璃布抽滤除去大的黑腐质，然后再用双层纱布抽滤，将滤液移到中和锅或缸中，滤液用1：1(体积比)的盐酸冲洗2～3次，冲洗液一并倒入中和锅或缸内，准备中和。 （3）中和：三口瓶中滤液在40C以下装上搅拌器、滴液漏斗（内30%NaOH）、温度计在搅拌下加NaOH溶液（将过滤好的滤液趁热在搅拌下加入浓度30%～40%氢氧化钠溶液（工业烧碱），当ph=3时要缓慢滴加，直到PH值达4.0时，停止加碱液，然后改用醋酸钠饱和溶液中和到PH值为4.8左右，停止搅拌，静置10～12小时，用涤纶布过滤沉淀物，甩干或吊干（抽滤液可供回收谷氨酸或制备化学酱油），即得粗品。中和时温度应保持在40~60℃左右，而且要在半小时内完成。 （4）提纯：称取适量的胱氨酸粗品，加入粗品量用浓度为30%盐酸，搅拌30分钟左右，等粗品全部溶解后，再加入粗量质量4%~5%活性炭粉（分两次加）和二乙胺四乙酸（EDTA 0.1%），煮沸0.5h。然后过滤脱色液（回收活性炭粉，再生后可重用），滤液加热到80～85℃，在搅拌下加入浓度30%氢氧化钠溶液，调节PH值至4.8时，停止加碱液，静置，使结晶沉淀完全。虹吸上清液（可供回收胱氨酸和酪氨酸），底部沉淀滤干后可离心甩干或直接用吊包吊干，即得灰白色的提纯胱氨酸粗品。 （5）精制、干燥：称取适量胱氨酸提纯后的粗品，加入5倍量的1：12（体积比）13%～14%的盐酸(1~1.5mol/l)，加热到40℃时，加入5%~10%的活性炭骨炭粉（按粗品量加），升温到60℃，保温搅拌1小时。然后用布氏漏斗多次过滤，滤液应无色透明，如仍带色，再进行脱色处理。 将冷的滤液移入搪瓷缸中，搅拌下加入10%氨水调节溶液PH值至4.8，静置一夜，即有胱氨酸精品析出，过滤出结晶，先用少量蒸馏水清洗再用无水乙醇清洗直至无氯离子，用吊布吊干后放入搪瓷盘中在烘箱内烘干（保持温度在60℃左右），即得产品。  （四）工艺条件说明 1.水解终点的判定 毛发角蛋白是由胱氨酸、精氨酸等十几种氨基酸构成的。经酸水解后利用等电点沉淀法提取光氨酸，收率基本稳定在3%～4%，最高平均收率7%～8%。要提高从毛发中提取光氨酸的产量，主要取决于毛发的水解程度。如果酸浓度高，试剂速度液加快，反之则试剂速度慢。另一方面，水解时间也很关键，时间短，水解不彻底，时间长，则氨基酸被破坏，因此正确判断水解终点，控制水解时间很重要。 水解终点的判断：取水解进行10小时以上的水解液2毫升放在一支试管中，然后加入10%氢氧化钠溶液2毫升，再滴加2%硫酸铜溶液3～4滴，摇匀后，如仍有明显蓝色即明水解已完全，如颜色变化则表明水解不完全，应继续水解。 2.酸度的控制 在操作过程中，调节PH值时最好用酸度计检查，特别是调节PH值至4.8左右时（胱氨酸等电点为5.05），一定要调节好，不然会产生结晶不易析出的现象。 3.温度的控制 温度对于水解很重要，温度低，反应时间长；温度高，虽可加快水解，但对胱氨酸有破坏作用。生产中，水解温度多控制在102~ 110℃左右，中和和脱色温度控制在70～80℃，以防止其它氨基酸析出。 4.如何提取产率 目前从废杂毛中提取胱氨酸，提取率多在4%～8%之间，一般人发的提取率较其它毛发高。最关键的步骤是水解、中和及过滤，应细心操作，掌握规律。另外水解时，水解罐应装有回流装置。 （五）产品规格和杂质测定 1、外观：产品为白色有光泽的六角形片状结晶粉末，在水中微溶，不溶于酸和有机溶剂，能溶于无机酸中。 2、澄明度：精确称取0.5克样品，加1：3盐酸溶液10毫升，振荡溶解，溶液应无色透明或几乎透明。 3、氯化物测定：精确称取0.25克样品，加1摩尔/升硝酸10毫升，使之溶解，再加水稀释至50毫升。用10毫升移液管吸取10毫升该溶液于一烧杯中，再加蒸馏水40毫升，1摩尔/升硝酸1毫升，1摩尔/升硝酸银溶液1毫升，摇匀。另外取氯化物标准液（1毫升含0.01毫克氯离子）7.5毫升，按上法同样处理，前者的浑浊度不应大于后者，即含氯量≤0.05%。 4、铁盐检验：取上述2克样品 烧遗留的残渣于烧杯中，加2摩尔/升盐酸12毫升、1摩尔/升硝酸0.5毫升，在水浴中蒸干，再加1：2盐酸5毫升、蒸馏水10毫升，然后移入50毫升纳氏比色管中，加10%硫氰酸铵溶液2毫升，如显色，即与同样处理后的6毫升标准液比较，不得更深（≤0.001）。  试验提示： a、中和放热，要控制滴加速度，特别是ph=3.8后要缓慢滴加，在控制ph时要注意温度。 b、脱色时要控制酸度及温度，活性炭不要太多，多次脱色直至无色透明。 c、水解时要完全回流，设有冷凝回流装置（冷凝管），实验过程中要处理掉会发出来的氯化氢气体。 d、不用ph试纸，用ph计（酸度计或精密ph试纸），否则L—胱氨酸不易结晶吸出。 e、用薄膜透析法回收盐酸，减少水解中酸的用量，同时用电透析法从脱去结晶后的氨基酸溶液中回收氨基酸。