单克隆抗体

第二章 单克隆抗体的制备 单克隆抗体: 理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易。McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。 第一节 杂交瘤技术的基本原理： 在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一. 细胞的选择与融合 建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。 脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。 融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。 目前常用的B细胞瘤株有： P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein，1975)；P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein，1976)；X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)；Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等， 这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。 聚乙二醇（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40％（W/V）。 二 选择培养基的应用 在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 细胞DNA合成两条途径 主途径：是由糖和核苷合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。 辅助途径：是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。 细胞融合的选择培养基中有三种关键成分： 次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨甲蝶呤（aminopterin，A） 胸腺嘧啶核苷（thymidine，T） 氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT－细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖（图1）。 三、有限稀释与抗原特异性选择 　　筛选过程：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。 克隆化:将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30％的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。 第二节 制备单克隆抗体的基本技术 ​ 抗原制备 ​ 动物免疫 ​ 免疫脾细胞和骨髓瘤制备 ​ 细胞融合 ​ 杂交瘤细胞选择培养 ​ 杂交瘤细胞筛选 ​ 杂交瘤细胞克隆化 ​ 单克隆抗体的鉴定 ​ 分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 ​ 单克隆抗体的制备 一、抗原制备 二、动物选择与动物免疫 选择与所用骨髓瘤细胞同源的balb/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。 免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。 三、饲养细胞的制备 种类有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾细胞、小鼠或大鼠胸腺细胞等。 机理：饲养细胞在培养液中能分泌一种或多种非种属特异性生长刺激因子；满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。 制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。 四、骨髓瘤细胞的准备 P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein，1975)， P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein，1976)，X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)，Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等， 五、免疫脾细胞悬液的制备 1、取免疫的BALB/C小鼠，摘除眼球放血致死小鼠。 2、75%酒精浸泡消毒 3、无菌取脾脏，剪碎，研磨取处脾细胞 4、加RPMI-1640培养液洗涤2次 5、用RPMI-1640培养液重悬细胞，计数。 六、细胞融合 1、细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。 2、反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。 3、培养液的成分：其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 七、杂交瘤抗体的检测 融合后第10-15天进行。 方法：酶标记技术、荧光技术、放免、间接血凝等。 方法应该特异性高、灵敏性高和简洁快速。 八、克隆化 融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用elisa检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的elisa测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 九、单克隆抗体的制备和冻存 一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。一是小鼠腹腔接种法。选用balb/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。 选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻存过程中需格外小心。二甲亚砜（dmso）是普遍应用的冻存保护剂。冻存细胞复苏后的活性多在50％～95％之间。如果低于50％，则说明冻存复苏过程有问题。 十、单克隆抗体的纯化 腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。盐析、凝胶过滤和离子交换层析等。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌a蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。