结核分枝杆菌抗酸染色法

结核分枝杆菌的加热抗酸染色法 杨昆霖1 郑涛1 张雷1 张哲1 李杰2 1.北京大学医学部临床医学08级一班学生 2.北京大学医学部微生物学系副教授 【摘要】 目的：了解抗酸染色法德原理及适用对象，并掌握抗酸染色的操作技术。方法：用卡介苗稀释溶液，通过干燥和固定的方法制作结核分枝杆菌涂片，经过抗酸染色法的初染、脱色、复染制成染色片，并用油镜观察结核分枝杆菌的形态特点。结果：油镜观察时，结核分枝杆菌成团聚集且为细长微弯曲的红色分枝状菌体；复染后杂菌及组织细胞被染成蓝色作为背景，与结核分枝杆菌形成对比。 【关键词】 结核分枝杆菌；抗酸染色法；初染；复染；红色 结核病主要由结核分枝杆菌感染人体引起，结核分枝杆菌的检测对于结核病的诊断具有重要意义。由于结核分枝杆菌细胞壁内含有大量的类脂，使用革兰氏染色时，菌体不易着色。抗酸染色是特异性的针对分支杆菌的鉴别染色法，运用这种方法能很好的把结核分枝杆菌和其他细菌区别开。 1 材料与方法 1.1 材料 样品：卡介苗稀释液。 试剂：石炭酸复红染液；盐酸乙醇脱色液；美蓝染液。 器材：载玻片；染色架；普通光学显微镜；镜头纸；石炭酸消毒缸；酒精灯；打火机。 1.2方法 1.2.1 图片的干燥和固定 与革兰氏染色法类似，取一块载玻片，用记号笔标记涂片位置，为大约0.5-1.0cm左右的圆圈。用接种环蘸取一环卡介苗稀释液，涂布在载玻片标记的圆圈内，这样重复3-4次，将蘸取的稀释液均匀摊开在圆圈内，并将载玻片在酒精灯附近加热烘烤至稀释液干燥形成一个白色固定的圆圈为止。注意在蘸取卡介苗时不要污染稀释液，每次蘸取完都要烧灼接种环。 1.2.2 抗酸染色 1.2.2.1 初染 将石炭酸复红染液滴加在涂片上，在涂片下用酒精灯火焰加热，注意载玻片不要与火焰靠的太近太久，至染液有蒸汽冒出便使涂片远离火焰但继续加热5min，期间若染液干涸，要继续添加适量的染液，直至染色时间在5min左右。 1.2.2.2 脱色 待载玻片冷却后，用水从载玻片的一端冲洗染液，注意不要直接猛烈地用水冲击涂片圆圈的位置。然后，用盐酸乙醇脱色，直至载玻片上无颜色脱下为止。注意控制脱色时间在0.5min左右。 1.2.2.3 复染 脱色后，用水冲洗载玻片，在酒精灯附近将残留的水分烘干，用美蓝染液染色1min，又用水冲洗，风干。 1.2.3 油镜观察 2 结果 被染成红色的，成团聚集，菌体成细长微弯曲分枝杆状的即为结核分枝杆菌。而占据视野中较多的还有一些染成蓝色的球状的杂菌及组织细胞，与红色的结核分枝杆菌形成对比。 3 讨论 结核病是一种感染性疾病，病因明确，实验室诊断是确诊的主要依据。 抗酸染色法曾经作为检测结核分枝杆菌、诊断活动性肺结核的金而被广泛运用于实验研究及临床检测。 加热抗酸染色的原理主要是由于结核分枝杆菌的细胞壁含有大量的类脂，类脂的重量占到了细胞壁干重的60%。用革兰氏染色的话，不易着色。但是，在加热和石炭酸存在的情况下，复红染料易于穿过细胞壁进入胞体；再用盐酸脱色时，分支杆菌中所含的大量分枝菌酸能抵抗盐酸乙醇的脱色而保留原来的红色，但是其他杂菌及组织细胞的颜色却被脱去；当用美蓝复染时，结核分枝杆菌依旧为红色，而其他杂菌和组织细胞便被染成蓝色，这样就将结核分枝杆菌区分出来。 有文献报道，抗酸染色时常温初染20min和加热初染5min的效果一致，结核杆菌阳性检出率也不受影响，且还可防止加热时温度控制不当而将染液烧焦或是炸裂载玻片，以及避免由于烘烤不当而形成带结核菌的气溶胶对人产生危害。 但是，随着技术的不断进步，以及临床上对于检出率及检出速度要求的不断提到，传统的抗酸染色在临床上镜检阳性率较低。也有很多在原来基础上改良的抗酸染色法应运而生，比如：传统上脱色用的是3%的盐酸乙醇，但改用5%的盐酸乙醇脱色后显色更为明显；用水浴或是恒温箱控制加热时的温度；还有的将原来的三步染色法改进为两步染色等等。这些方法中的很多都提高了显色的效果，提高了结核杆菌的检出率。 除此以外，还有一些检测结核分枝杆菌的新方法出现，比如：结核抗体检测法、荧光定量PCR等。这些方法有操作简便、结果可靠、阳性检出率高和特异性高，重复性好，灵敏度高等特点而被运用于临床对于结核病的检测和诊断中。但作为对结核分枝杆菌最基本最经典的检测方法的抗酸染色法依旧在基层的许多卫生检疫工作站中发挥着不可替代的作用，也是每一个医学生应熟知并掌握的基本实验方法。 【参考文献】 [1] 朱万孚，庄辉. 医学微生物学，2007，8. [2] 王月丹 等. 医学免疫学与病原生物学实验教程，2008，5. [3] 邬小薇. 3种方法检测结核分枝杆菌的比较，重庆医学，2005，10，34（10）. [4] 李水仙，武延隽，车德才. 一种改良的抗酸染色法，山西医科大学学报，1998 ，29 (2).　 [5] 尚慧锋，陈国光，王艳，王玉珀. 3种方法检测痰结核分枝杆菌的比较，临床医药实践，2009，12，18（12）.