白细胞介素—2的结构与功能

／ ，『7 (生物 工程进 晨 '1994．w ．14．No, 1 鲡 白细胞介素一2的结构与功能 77 ) ． 型塑望 釜篓 蒋春雷’王志勇郑仲承 f 7 -————一．_ 一， I、，，， ／ (中国科学院上海生物化学研究所) 白细胞介素一2(IL一2)由激活的T细胞产 生，是作用于淋巴细胞和免疫效应细胞的重要 免疫因子，能提高免疫系统中多种免疫细胞的 功能，如提高它们杀伤癌细胞、病毒或细菌感染 细胞的能力。IL一2分泌水平的高低与多种疾病 有密切关系。随着人基因工程 IL一2(rlL一2)的问 世，IL一2的生物学与应用研究得到了更快的发 展。 目前对 IL一2的分子结构、结构与功能的关 系以及 tL一2的生物功能都有了比较全面和深 人的了解 ，关于 IL一2结构功能的研究多数采用 蛋白质工程的，即用定点突变其基因，导致 蛋白质 氨基酸的改变．然后研究突变蛋 白质的 生物功能，国外有关 IL一2结构和功能研究的状 况列于表 1，在这方面我们做了大量工作，取得 许多新进展。 一 、关于IL-2的分子结构及其a螺旋组成 的新观点 人 IL-2由 133个氨基酿组成，分子量为 15~20道尔顿，分子 中有三 个半 胱氨酸残基 (Cys)，分 别位于 IL-2中的第 58、lO5和 125 位。IL一2的二级结构主要由a螺旋组成。1989 年Brandhuber等用X-ray衍射方法，证明IL一2 由A、B、C、D、E、F等六个 a螺旋所组成，无p 折叠[1]。1992年，Mort等用核磁共振(NMR) 方法研究 了IL一2的二级结构[2]，发现 IL一2分 子中只有 4个a螺旋区，另外还有一对 p反平 行折叠(图 la，Ib)IL一2分子中各螺旋相互折 叠，形成球状蛋白分子[2]。1991—1992年我们 用蛋白质工程方法也证明X—ray衍射所得六 · 蒋春冒为上海第二军医大学博士生 圈 l| x一衍射结果 6十 t 旋无 月折叠 圈 1b 棱磁共振(NMR)结果 4个 a螺旋 1十 折叠 个a螺旋的结论是错误的E33，而得出与 Mott 相似的观点 过去根据IL-2晶体结构x线衍射图谱的 分析结果，IL一2的六个 口螺旋区段如下：AI 11 一 l9，B}33—56(中间被 ~~rpro折断，分成B(33 l3 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 一 46)及 B’(48—56)两个 q螺旋)，C；66—78， D；83—101，E；107—113．F；117—1 33，而核磁 共振(NMR)确定 IL一2的四个a螺旋，分别为 甲、1l一29．乙 、53—73，丙 、81—97，丁 、11 6— 131。(注：NMR原文的四个 q螺旋也叫 A、B、 C、 但在此文中为了区别 x一衍射的A、B、C、 D，故叫甲、乙、丙、丁)。两者比较后，主要差别 之一是 x衍射所得的 n螺旋 B(氨基酸 3l一 46)实际上不存在。我们在研究 IL一2的二级结 构时，将39Met、43Lys分别突变为Pro，破坏此 区域的 n螺旋，但所得突变体的总a螺旋度并 无明显变化，其生物活性也无明显改变E33。我 们过去研究 IL一2的 a螺旋结构 的结果，说明 n 螺旋的破坏对其生物活性必定有影响(见后)， 因此上述实验结果说明 x—ray衍射所测定的 a螺旋(B)本来就是不存在 的E33。此结果与 NMR所得结论一致。 ． 二、IL 2中n螺旋对生物活性的重要性 IL一2结构中含有 49—65 的 n螺旋，为了 解 n螺旋对其活性的影响，我们分别在n螺旋 (甲)(11—29)，a螺旋(乙)(53—73)中引人 Pro 以破坏其螺旋结构 ，然后观察相应的功能变化。 如将 a螺旋 B中的 15Glu突变为 Pro后 ，由于 a螺旋的稳定性遭破坏，故 IL：2的洁性降到天 然的20 ，而如果将 15Glu突变为Lys，虽然氨 基酸由酸性变为碱性，但未破坏a螺旋，故突变 体的活性与天然一致，这表明a螺旋(甲)的稳 定性对其生物活性有一定的影响[7]。将n螺旋 (乙)中的53位 Leu突变为Pro，对其生物活性 的影响也比突变为 Asn的影响更为明显，这表 明 n螺旋乙的完整性对 IL一2的生物活性也是 很重要的[7]。 IL一2分子的 n螺旋(丁)，对 IL一2生物学活 性的发挥尤为重要，这可从下列两方面进行说 明。将 125Cys突变为 Set或 Ala(不破 坏 n螺 旋)，IL一2的活性有所升高，稳定性也更高。但 将其突变为 Pro(破坏其 a螺旋)，活性财急骤 下降，由此可见 n螺旋(丁)区域的螺旋结构对 IL 2活性非常重要，下面分别加以详述。 以 往 的 研 究 证 明 IL一2分 子 中 58和 一 14 — 105Cys之间形成二硫键，它对维持 IL一2的生 物功能非常重要，将任何一个 Cys突变，都造 成 IL一2活性的严重下降[4]，而第 125位 Cys 是游离的，它有可能引起一s—s键的错配而导 致活性下降，为此我们将此 125Cys分别突变 为 s 或 Ala，发现突变 IL一2的活性以及热稳 定性均有提高[5，63，~25Ala--IL 2尤其如此， 我们推测，可能的原因有：1、125Cys突变后使 IL一2分子复性过程中不会发生二硫键的错配， 同时也不易形成多聚体，2、Ala极性小，故疏水 性大于 s，而 125Cys位于 IL一2分子的a螺 旋 (丁)的疏水 面，125Ala的 引人，使 q螺旋 (丁)与其它螺旋 间的相互作用更加稳 固，因此 使分子的稳定性增强。 将 125Cys改为 Set或 Ala后，IL：2的活性 及稳定性均有增加，与此相反，如果将 125Cys 改为Pro以破坏其螺旋，则活性太大下降(相当 于天然 IL一2活性的 7 )如果将 127Set改为 Pro以破坏此a螺旋，活性也要大大下降(为天 然IL一2的4．5 )，若将 125Cys和 127Set同时 突变为 Pro，进一步破坏a螺旋，结果突变体的 活性还要进一步下降，只有天然活性的 1-2 对这些突变体的二级结构分析发现，它们的二 级结构均有显著变化。因此a螺旋破坏越大，活 性下降越明显。对照 t25Cys变成 Set或 Ala与 Pro的巨大活性差异，突出地说明n螺旋对其 活性的重要性，这说明 螺旋(丁)的稳定性对 IL一2的活性确有重大影响，此外 螺旋的破坏 可能还会影响IL 2的三维结构，IL一；中只有一 个 Trp，它在分子内韵微环境可用荧光进行检 测。对这些突变体 的荧光检测结 果显示， 121Trp的微环境均因上述 Pro突变后而 由疏 水性向亲水性转变，说明三维结构发生了明显 的变化，其变化程度与 t螺旋的破坏程度以及 突变残基与 121Trp的距离均成正比例关系。 这说明a螺旋破坏后，周围残基的微环境以及 空间位置也发生 了变化，可能打乱了a螺旋 (3-)中残基的两亲性分布。根据以上两点我们 认为a螺旋(丁)尤其是其疏水面的完整性，是 维持IL一2活性的重要因素E83。 维普资讯 http://www.cqvip.com 三、2o位残基等在IL一2结梅功能中的重要性 IL一2分子 Ct螺旋(甲)中20Asp对其生物 活性的发挥起很重要作用。将此残基突变后， IL一2与IL一2受体 p亚基(1I 一2R[3)的亲合力显 著下降，突变体因不同残基变化而使生物活性 下降的程度不同[9]。我们将 20Asp突变为 Asn、活性下降 10倍 ，说明 Asp的酸性基团对 其生物活性是重要的。将 Asp改为 Lys活性还 要继续下降 1O倍(即总共下降了100倍) 说明 2o位氨基酸的酸性基团对活性很重要，而碱性 基 团则起相反作用。但如果将 20Asp改变为 Arg时，括性还要继续下降 3000倍，即活性几 乎全部丧失 ，Arg虽 比Lys碱性略大，但造成活 性 3000倍的差异，是不能单纯用碱性不同来解 释的，可能还与侧链基团有关。事实上如果将 20Asp改为 20Leu，所得产物 的活性与 2OArg 相似，Leu并非碱性氨基酸，因此只能用侧链基 团较长，疏水性较大来解释。上述结果说明IL- 2与其受体结合需要酸性基团(Asp)，而较长的 疏水侧链基圃则妨碍这种结合，使其括性降低， 甚至完全丧失[10]。 1 7Leu也是对 IL一2活性有重要贡献的残 基 ，如将它突变为 Asp，虽然 IL一2的空间结构 无变化，但活性下降至天然 IL一2的 0．1 ，这 说明1 7Leu可能也与IL-2受体的结合以及活 性的发挥有关[11]。由于 1 7Leu与 20Asp均为 与活性有密切联系的残基，而且二者空间位置 很 近，我 们将 二 者 位 置 对 调，即将 17Leu， 20Asp突变为 1 7Asp，20Leu，结果突变体的活 性几乎完全丧失[11]。这表明20Asp与p亚基 结合时，其空间位置不能有任何改变，稍有偏差 就不能结合 ，除 20Asp外，1 7Leu也 必须位于 其特定位置才能发挥生物学作用。 我们还对不同种属来 源 IL一2分子 中的保 守部份与活性的关系进行 了研究，将 21Leu、 62G1u、1 26Gln这三个保守残基进行突变，如 21Leu÷ Thr、G2Glu— Leu、62Glu÷ Arg、 12GGln--~Asp，结果所得突变体的活性分别降 为 0、5 、0．3 ，说明这些保守残基对维持 IL一 2的活性也是至关重要的[12] 四、IL一2的镇痛作用与结构关系 IL一2是重要的免疫调节因子，近来徐获、 蒋春雷与周禧和、赵志奇发现IL一2还有镇痛作 用，我们向大鼠侧脑室注射 II 一2，然后测定不 同时间大鼠痛阈的变化 ，发现 IL一2能显著提高 大鼠的痛阈(即具有镇痛作用)，这种作用能被 抗 IL一2抗体所阻断，说明为I'L-2特异性作用 所致。IL一2的镇痛作用也能被纳洛酮所拮抗， 这表明IL一2的镇痛作用途径可能与阿片受体 有关[13]。而纳洛酮对 IL一2的免疫功能无影 响，说明 IL一2发挥镇痛与免疫功能的途径可能 是不同的[14]。 为了研究 IL一2发挥镇痛作用的结构域与 发挥免疫活性的结构域是否一致，我们用无免 疫活性的IL-2突变体 20Leu—IL-2注射大 鼠 侧脑室 ，发现它对 痛阈的作用与天然 IL一2一 致，这也说明 IL一2免疫的功能与镇痛作用功能 存在于 IL一2分子 中两个不同的功能 区域(Do— main)[14]，上述结果均未见诸文献报导，这是 我们对 IL一2结构功能研究的一个重要结果 五、IL一2的功能与应用前景 1．IL-2的抗结核杆菌等作用 IL一2已广泛应用于多种肿瘤的治疗，同时 对免疫功能低下的疾病如肿瘤、肝炎等均有显 著疗效。近来庄玉辉与我们发现IL一2还有抗结 核杆菌的作用，抑制率可达 9o 以上[15]。Ka— plan等用低剂量的IL-2皮下注射8—10天，能 使病人以及实验动物体内的麻风杆菌大大减 少，甚至转阴[16]。上述事实说 明IL一2将有很 大的临床应用前景。 2．IL一2基因治疗 多种肿瘤以及细菌、病毒感染等疾病都伴 有 IL-2水平低下，补充 IL一2，纠正体内免疫水 平，对治疗这些疾病均有重要作用。我们用逆转 录病毒载体插入IL一2基因，再转化肝癌细胞株 HAC，从面使之能持续分泌 IL一2。 将此IL一2基因转化了的HAc去接种大鼠 腹腔或皮下，结果使动物生存期延长，瘤体积缩 小，这些实验结果，说明IL一2的基因治疗在动 物模型实验中取得了明显的效果[1 7]。 一 】5 ～ 维普资讯 http://www.cqvip.com 3．rIL一2的修饰 rIL一2半衰期短，临床需大剂量使用，故毒 副反应大 ，同时基 因工程方法生产 的rIL一2不 含糖，水溶性小，抗原性大(即容易产生抗体)， 用PEG修饰rIL一2后，则可大大延长rIL一2的 半衰期，降低其抗原性[18]。我们实验室用 PEG修饰 IL一2所得产物也是如此，它对实验 动物肿瘤的疗效大大高于天然rIL-2[19]，可使 肿瘤缩小，转移率低，荷瘤动物生存期延长，可 能具有很高的应用价值。 4．rIL一2毒素融合蛋白 由于许多疾病的IL一2受体表达超出正常 范围，因此 rIL-2毒素能选择性地杀灭 IL一2受 体高表达的细胞，而不影响其它淋巴细胞，是治 疗这些疾病的 良好手段。用基 因工程方法将 rIL-2基因与细菌毒素基因的功能区融合，表 达出rIL-2毒素，如rIL-2与白喉毒素或绿脓杆 菌外毒素融合的免疫毒素，它们在体外实验中 能抑制细胞的蛋白质合成，对表达 IL一2R的 细胞有强烈杀伤作用，而对 IL一2R阴性细胞则 无影响[2O一23]，动物实验表明它能防止迟发 型过敏反应的发生[24]，延长心脏移植鼠的存 活时间[z5，26]。对AIDS病毒感染的细胞有特 异性的杀伤作用[27] 我们实验室将绿脓杆菌 外毒素基因与 IL-2基因连接起来 ，在大肠杆菌 中表达，产物能杀伤 IL一2R阳性细胞，而且其 杀伤作用能被抗IL一2抗体等所阻断，说明其杀 伤作用，由IL一2的导向所致[28]。 六、IL一2受体的研究 IL一2通过与专一的IL一2受体结合而发挥 生物学作用。IL一2受体IL-2R含三个亚基即 、 p和 29，303，编码这三个亚基的基因巳被克 隆鉴定。p、 亚基为信号传递所必须，而n亚基 则参与高亲台受体的形成。 除了在激活的淋 巴细胞表 面上 IL一2R各 种亚基的表达有提高外，某些淋巴瘤，自身免疫 病以及器官移植等病人或动物模型中，IL-2受 体的表达均大大超出正常范围，而且血清中可 溶性 a受体的含量也显著提高[31--33]。因此 检测和控制IL-2R的水平，对临床一系列疾病 — — ’6 —— 的诊断和治疗有重要 的意义。，我们已有 IL一2R 的a，口和 亚基的基因，并表达了其可溶性成 份，将有潜在的应用价值。 总之 IL一2是一种结构复杂，功能广泛，有 较好临床应用前景的细胞因子，对 IL一2分子结 构与功能关系的了解有助于阐明其作用的分子 ，有 目的地改造 IL一2分子结构，有可能研 制出多种用途或高效的新型IL一2。 IL一2的镇痛功能的发现，IL一2分子镇痛作 用以及其结构与功能的阐明提示 IL-2在机体 的神经、免疫系统的调节作用中有不可低估的 地位，也为免疫学和神经生物学者开辟了一个 新的研究领域。 重组 IL一2类似馏的生物活性 与受体结合事( ) 部位 突变 活性( )— — P55，P75 P55 P75 3EArr Ah 50— 10O 5--17 < O．o5 5O一 1。0 * u· P∞ 5．6 维普资讯 http://www.cqvip.com B—helix * u Pro 30 6aLeu Asn 0．4— 1 2 6．唐建伟，中国 学 已投蔷 7．壬志勇等．待发表工作 8．镣获等，生暂工程学报，1993，9(4) 298 9．Zurawsk1．S M ．and Zursw出 ，G．EMBO J．1989．8(9) 2583 第四届泛太平洋生物技术学术会议将于1995年2月9--9 H在澳太利亚墨尔率召开 。本次会议与第十二届奥戈种亚生物 技术学术舍议联音举办，将与在维多利亚的洛恩举行的蛋 白质 结构和分子生物学专业舍议先后进行。 泛盘平洋生物技术学术舍议已分捌在新加坡．芙国和台湾 举办三届。会议的宗旨是建立区硫音作罔络．促进更有救的音 作．提供展示有关生暂技术的技术与商业机舍的论坛·为本地 区和其他地区的^们造福． 第四届泛太平洋生物技术学木舍议为企业，研究机构、政 府和学术界提供了一十展示生物技木进晨、产品．服务与机强 的良机，分享在促进令^激动的新技术应用中克服困难的经 验。 本次会议的顾问羹员舍汇集了国际著名的生物学塞，尤其 是处于各 自研究领域前沿的科学家。在他们的帮助下精心制定 了夸人 奋的会议技术程序．舍议学术活动还将包括举办相 当 规模的商品晨诮会，提供展示、宣传和咨诲各种产品、服务的良 好机会，进将有利于正在成为经济巨^的本地区的发晨．会议 还将组 筝l杜舍话动 ，包括 在国立芙木馆太厅举行 的正餐招 待 舍，为促进长久的学术联系提供较轻梧的环境． 会议将探讨和晨望来自泛太平洋各国的生暂技术各领域 的研究、前商品化开发和商业发展的最新进展和重大突破．台 议包括主和墙报，具体分组如下 · 泛太平洋地区生物技术的发展和创始 · 自热赍嚣利用 · 农业和食品生物技术 · j辱洋生物技术,TX产养殖 · 植物生物技术，生暂杀虫荆 · 保健，生暂药品和疫苗 · 细胞生物学，微生物生理学，生物多样性 · 遗传工程，基因转移，蛋白表选 · 基匿组结构 ，DNA顺序 · 环境生物技术和生物再生 ·工艺进晨和量优化 · 发酵和细胞培养，后处理 ·分析生物技术 ，新仪器 · 商品化经验和机遇 · 珐规事务和理性问题 · 经济，市场和国家政策 - 风险评竹．安垒性 ，牡舍意识 - 教育，技术转让 会议征集任何有关 生物技术锈域尤其是上述各 方面的论 文摘要．希望参加的人应填写舍议顶通知上的联系表，寄往大 会秘书组索取详细赍料和注册表．中国生暂工程学舍巳将舍设 顶通知寄国内有关研究^员和研究单位，希参加的同志请尽快 向各 自单位查诲，如来收到可与中匿生物工程学舍办公室联 系．会议接收捷蔓的截止期为 1994年 8月 31 H，注册截 止期为 1994年 l0月 31 H． 舍议接收的论文将集册出版。接收论文曲簪件是至少有一 名作者注册并爿会．舍议以英文为正式用语． 中国生物工程学会办公富联系地址为 100080 北京中关村 中国科学院文献情报中心 中国生物工程学会办公室 电话：255．~167 中国科学晓应用研究与发展局 中国生暂工程学舍 一 九九四年一月 维普资讯 http://www.cqvip.com