侧脑室注射P物质联合电针治疗大鼠局灶性脑缺血的作用

 侧脑室注射 P物质联合电针治疗大鼠局灶性脑缺血的作用* 万毅 沈德凯 杜鹏程 吴婷婷 余炜 万毅，男，硕士，副教授，硕士生导师 * 安徽省自然科学基金资助项目( No． 50431003) ( 安徽中医学院 安徽 230038) 摘要:目的 探讨侧脑室注射 P物质( SP) 在电针治疗局灶性脑缺血过程中的作用。方法 将 50 只造模成功 Wistar大鼠随机分为模型组、生理盐水组、SP组、电针组和 SP +电针组，另设健康对照 组，每组各 10 只。采用大脑中动脉阻塞( MCAO) 复制大鼠局灶性脑缺血模型。生理盐水组和 SP 组大鼠分别在 MCAO造模成功后侧脑室注射生理盐水和 SP; 电针组在 MCAO 手术同时进行电针 治疗; SP +电针组在电针治疗基础上于 MCAO 造模成功后侧脑室注射 SP。以 Zea Longa 6 级评分 法进行行为学评分，氯化三苯基四氮唑( TTC)染色法测定脑缺血面积，免疫组织化学法检测脑组织 SP表达。结果 与模型组和生理盐水组比较，电针组在 MCAO 后 24 h 神经行为学评分显著降低 ( P ＜ 0. 05) ; SP +电针组神经行为学评分显著低于其他组( P ＜ 0. 01)。24 h 后与模型组和生理盐 水组比较，电针组和 SP +电针组脑梗死面积显著缩小( P ＜ 0. 01)。SP +电针组大鼠大脑皮质和海 马中 SP含量显著高于模型组( P ＜ 0. 01 和 P ＜ 0. 05)。结论 侧脑室注射 SP可增强电针治疗局灶 性脑缺血的疗效。 关键词:局灶性脑缺血; P物质;侧脑室注射;电针;大鼠 中图分类号: R246. 1 Role of lateral intracerebroventricular injection of substance P combining with electroacupuncture in treatment of focal cerebral ischemia in rats* WAN Yi，SHEN De-kai，DU Peng-cheng，WU Ting-ting，YU Wei ( Anhui College of Traditional Chinese Medicine，Anhui 230038) Abstract: Objective To discuss the role of lateral intracerebroventricular injection of substance P ( SP) in the treatment of focal cerebral ischemia with electroacupuncture． Methods All 50 modeled Wister rats were randomly divided into the model group，normal saline solution group ( NS group) ，SP group， electroacupuncture group ( EA group) and SP and EA group ( SP + EA group) and a control group was set additionally ( each n = 10) ． The rat model of focal cerebral ischemia was established by using middle cerebral artery occlusion ( MCAO) ． The NS group and SP group were given lateral intracerebroventricular injection of NS or SP respectively after MCAO． The EA group was given electroacupuncture at the same time of MCAO． The SP + EA group was given intracerebroventricular injection of SP on the base of electroacupuncture after MCAO． The Zea Longa graded approach of 6 grades was used for neuroethology scoring． The cerebral ischemia area was detected by applying staining of triphenyl tetrazolium chloride ( TTC) and immunohistochemistry was used to detect SP expression in brain tissue． Results Compared with the model group and NS group，the neuroethology scores decreased significantly in the EA group 24 hours after MCAO ( P ＜ 0. 05 ) ，and were significantly lower in the SP + EA group than those in other groups ( P ＜ 0. 01 ) ． Compared with the model group and NS group，the cerebral ischemia area was reduced significantly in the EA group and SP + EA group 24 hours after MCAO ( P ＜ 0. 01) ． The content ·581· 第 34 卷第 3 期 2011 年 3 月 Vol． 34 No． 3 Mar． 2011 北京中医药大学学报 Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine of SP in cerebral cortex and hippocampus were significantly higher in the SP + EA group than those in the model group ( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05) ． Conclusion The lateral intracerebroventricular injection of SP can improve the curative effect of electroacupuncture in the treatment of focal cerebral ischemia． Key words: focal cerebral ischemia; substance P; lateral intracerebroventricular injection; electroacu- puncture; rats 我们曾选择凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺 血模型，从光镜和电镜水平观察电针对脑缺血后神 经细胞损伤的治疗作用，结果表明电针能够保护脑 缺血后继发神经细胞的损伤［1］; 蛛网膜下腔注射 P 物质( substance P，SP) 可增强电针治疗局灶性脑缺 血的疗效［2］。本研究旨在观察运用侧脑室注射 SP 联合电针治疗大脑中动脉阻塞 ( middle cerebral artery occlusion，MCAO) 模型大鼠过程中，SP 在中枢 组织的表达。 1 材料 1. 1 动物 健康 Wistar大鼠 50 只，雌雄各半，体质量( 220 ± 20) g，由安徽省长临科技有限公司提供。动物生 产许可证: SCXK ( 苏 ) 2002-0002; 合格证书: 劳动 ( 饲) 字 95001。实验前适应性饲养观察 1 周。 1. 2 主要试剂与仪器 SP、氯化三苯基四氮唑( TTC) 、DAB，均购自美 国 Sigma。其他试剂购自武汉博士德生物工程有限 公司。Olympus BX-50 型显微照相设备，日本奥林 巴斯光学工业株式会社。图像分析系统，江苏南京 捷达 DP 801 图像分析系统。 2 方法 2. 1 动物模型复制及分组 参考 Koizumi 法［3］复制急性局灶性脑缺血模 型，术后对不符合要求的大鼠剔除不用，补充所缺。 将模型复制成功的大鼠随机分为 5 组，每组 10 只。 模型组:常规饲养不做治疗; 生理盐水组: 模型复制 成功后即行侧脑室注射生理盐水 5 μL; SP 组: 模型 复制成功后即行侧脑室注射 2 g /L的 SP 5 μL;电针 组:于模型复制时就开始电针，电针足三里( 双侧) 、 人中穴［4］，采用中频( 15 Hz) 脉冲电刺激，强度以引 起肌肉颤动为度，模型复制结束后持续电针 30 min， 以后每 8 h 电针 1 次，每次持续 30 min; SP +电针 组:模型复制时就开始电针，针刺方法同电针组，模 型复制后即行侧脑室注射 2 g /L的 SP 5 μL;另设健 康对照组:健康大鼠 10 只，常规饲养不做任何处理。 2. 2 侧脑室注射步骤 将制成急性局灶性脑缺血模型大鼠立即俯卧位 固定于脑立体定位仪上，矢状切开头皮至颅骨，用干 棉球擦去骨膜，依照 Paxinos-Watson 图谱［5］，以前囟 为基点，后移 1. 5 mm，右移 1. 5 mm 处钻开颅骨，以 颅骨表面为准垂直进针 3. 5 mm。各组分别用微量 注射器缓慢注入侧脑室生理盐水、SP 5 μL，注射结 束后留针 5 min 再撤出微量注射器，骨蜡封闭小孔， 常规局部消毒、缝合切口。 2. 3 观察指标 2. 3. 1 神经行为学观察 按照 Zea Longa 等［6］提出的 6 级评分法进 行评分。0 分为正常无任何神经功能缺失; 1 分为栓 塞动脉对侧上肢不能完全伸展，而同侧上肢正常; 2 分为栓塞动脉对侧上肢屈曲，向对侧推时抵抗力下 降，没有旋转; 3 分为栓塞动脉对侧上肢屈曲，向对 侧推时抵抗力下降，行走时向对侧有轻度旋转; 4 分 表现为意识障碍，无自主行走; 5 分为大鼠身体倒向 梗死对侧。 2. 3. 2 脑组织梗死面积百分比测定 氯化三苯基四氮唑( triphongl tertrazolium chlor- ride，TTC) 染色参照沈氏等［1］方法，将脑片按切片顺 序排列，用数码相机拍照后输入计算机，通过江苏南 京捷达 DP 801 病理图像分析系统测定 10 个平面的 总梗死面积占 10 个平面总面积百分比。 2. 3. 3 SP免疫组织化学检测 取大脑、脑干、颈髓，4%多聚甲醛固定。采用链 亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法显示 SP 阳性 细胞，DAB 显色。对照切片以正常兔血清代替 SP 一抗孵育，结果为阴性。经过 DP 801 图像分析系统 处理，计算其灰度值。 2. 4 统计方法 使用 SPSS 16. 0 软件系统，所测数据以平均值 ±标准差 ( 珋x ± s) 表示，多组间均数比较采用 One- Way ANOVA 方差分析，两两比较采用 LSD 检验，P ＜ 0. 05 为有显著性差异。方差不齐时采用 Kruskal- Wallis检验。 3 结果 3. 1 各组大鼠行为学评分比较 与健康对照组比较，模型组出现评分增高，提示 ·681· 北京中医药大学学报 第 34 卷 模型复制成功，动物出现神经功能缺失。与生理盐 水组和模型组比较，SP 组未见统计学差异，电针组 和 SP +电针组评分均下降( P ＜ 0. 05) ，其中 SP +电 针组下降大于电针组( P ＜ 0. 05) 。见表 1。 3. 2 各组大鼠脑组织梗死面积百分比比较 与健康对照组比较，模型组出现梗死面积增高， 提示模型复制成功，动物出现组织病理形态学改变。 与生理盐水组和模型组比较，SP 组未见统计学差 异，电针组和 SP +电针组面积均下降 ( P ＜ 0. 05 ) ， 其中 SP +电针组、SP组和电针组 3 组之间两两比较 无统计学差异( P ＞ 0. 05) 。见表 1。 表 1 各组神经行为学评分及大鼠脑梗死面积百分比比较( 珋x ± s; n = 10) Table 1 Comparison of neuroethology scores and percentage of ischemic areas in rats among all groups( 珋x ± s; n = 10) 组别 Groups 神经行为学评分 Neuroethology scores 脑梗死面积 Ischemic areas( % ) 健康对照组 Control group 0 0 模型组 Model group 2. 75 ± 0. 56▲▲ 29. 37 ± 2. 64▲▲ NS组 NS group 2. 87 ± 0. 69▲▲ 30. 41 ± 0. 77▲▲ SP组 SP group 2. 81 ± 0. 51▲▲ 28. 76 ± 0. 64▲▲ 电针组 EA group 2. 32 ± 0. 18▲▲#＊＊△△ 23. 76 ± 0. 64▲▲#＊＊ SP +电针组 SP + EA group 2. 23 ± 0. 44▲▲#＊＊△△◆ 24. 53 ± 1. 82▲▲#＊＊ F 30. 528 32. 413 P 0. 000 0. 000 注:与健康对照组比较▲▲P ＜ 0. 01; 与模型组比较#P ＜ 0. 05 ##P ＜ 0. 01; 与生理盐水组比较＊＊P ＜ 0. 01; 与 SP组比较△△P ＜ 0. 01。 Note: ▲▲P ＜ 0. 01 compared with control group; #P ＜ 0. 05##P ＜ 0. 01 compared with model control group; ＊＊P ＜ 0. 01 compared with NS group; △△P ＜ 0. 01 compared with SP group． 3. 3 各组脑部 SP阳性细胞的表达 光镜下表达 SP的阳性细胞胞浆呈棕黄色，细胞 核区不染色，以直径 10 ～ 20 μm 的中小神经细胞为 多。在海马部位 SP表达模型组比健康对照组增高; 与模型组比较，SP组、电针组和 SP +电针组表达均 增高( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ，其中 SP +电针组高于 SP组和电针组 ( P ＜ 0. 05 ) ; 与生理盐水组比较，电 针组和 SP +电针组表达增高 ( P ＜ 0. 01 ) 。在皮质 部位模型组与健康对照组比较无统计学差异; 与模 型组比较，SP组、电针组和 SP +电针组表达均增高 ( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01 ) ，其中 SP +电针组高于 SP 组和电针组( P ＜ 0. 05) ; 与生理盐水组比较，电针组 和 SP +电针组表达增高( P ＜ 0. 05) ，但 2 组之间无 统计学差异。在脑干和颈髓部位，各组之间均无差 异( P ＞ 0. 05) 。结果见表 2。 表 2 侧脑室注射 SP +电针对脑部 SP阳性细胞的影响( 珋x ± s; n = 10) Table 2 Influences of intracerebroventricular injection of SP combined with electroacupuncture on SP positive cells( 珋x ± s; n = 10) 组别 Groups SP阳性细胞灰度值 Gray value of SP positive cells 海马 Hippocampus 皮质 Cortex 脑干 Brain stem 颈髓 Cervical cord 健康对照组 Control group 161. 54 ± 6. 87 99. 09 ± 7. 87 212. 65 ± 5. 45 131. 11 ± 9. 55 模型组 Model group 171. 45 ± 5. 07▲ 113. 20 ± 2. 98 209. 44 ± 6. 08 128. 69 ± 3. 05 NS组 NS group 167. 49 ± 10. 23 121. 91 ± 7. 12 235. 87 ± 10. 24 135. 76 ± 12. 65 SP组 SP group 199. 21 ± 7. 40▲## 143. 76 ± 9. 77▲# 199. 39 ± 16. 24 119. 87 ± 13. 41 电针组 EA group 221. 76 ± 10. 34▲##＊＊ 152. 11 ± 8. 10▲#* 225. 87 ± 12. 76 135. 76 ± 8. 55 SP +电针组 SP + EA group 244. 15 ± 5. 22▲▲##＊＊ 157. 65 ± 6. 15▲#＊△ 227. 64 ± 4. 65 135. 50 ± 5. 81 F 49. 311 18. 690 1. 812 0. 886 P 0. 000 0. 000 0. 265 0. 543 注:与健康对照组比较▲▲P ＜ 0. 01; 与模型组比较#P ＜ 0. 05 ##P ＜ 0. 01; 与生理盐水组比较＊＊P ＜ 0. 01; 与 SP组比较△△P ＜ 0. 01。 Note: ▲▲P ＜ 0. 01 compared with control group; #P ＜ 0. 05##P ＜ 0. 01 compared with model control group; ＊＊P ＜ 0. 01 compared with NS group; △△P ＜ 0. 01 compared with SP group． 4 讨论 SP是最早发现的神经肽，能扩张脑血管，增加 脑血流量，有助于低氧组织的恢复。临床研究［7 － 8］ 发现急性脑梗死患者脑脊液与血浆中 SP 含量明显 升高且恢复期高于急性期。脑出血患者脑脊液和血 浆中 SP含量在急性期持续降低。我们最初的研究 ·781·第 3 期 万毅等 侧脑室注射 P物质联合电针治疗大鼠局灶性脑缺血的作用 表明［9］，SP浓度在脑缺血过程中是增加的，并且电 针治疗可以提高脑组织中 SP的含量，为了进一步研 究 SP在电针治疗脑缺血损害过程中参与病理生理 级联反应中的意义，我们复制大鼠 MACO 模型，使 用 SP侧脑室注射联合电针治疗，观测脑组织中 SP 的表达并进行神经行为学评分和脑缺血面积百分比 比较。 本实验发现 MCAO 模型大鼠神经症状在相同 的时间段( 24 h) 时，SP +电针组的行为学评分较模 型组和生理盐水组显著降低( P ＜ 0. 01 ) ，且低于 SP 组和电针组( P ＜ 0. 05 ) 。提示 SP 侧脑室注射联合 电针对 MCAO大鼠行为学有明显的改善作用，其效 果优于单一因素。结合本实验 SP含量变化的部位， 及以往对 SP的研究，认为与侧脑室注射 SP后，通过 脑脊液循环入血，引起梗死灶及周围组织 SP含量增 高有关，而电针可以引起脑组织中 SP含量的进一步 增高，从而影响缺血损伤级联反应而造成行为学评 分的显著降低。比较模型组和健康对照组的脑梗死 面积，模型组出现梗死面积增高，提示模型复制成 功，动物出现组织病理形态学改变。 在以往的研究中［10］，大鼠脑缺血后，所观测的 多个区域 SP含量的变化规律虽不尽相同，但大部分 呈现下降趋势。实验通过侧脑室注射 SP 的直接作 用和电针的作用使 MCAO 大鼠海马和皮质部位 SP 含量增高，通过 SP 的作用而发挥其特有的调节功 能，表明电针作用部位在缺血灶及周围的组织，也就 是在端脑水平。本实验未见到颈髓部位 SP 含量明 显变化，而是在缺血侧大脑皮质部位及其邻近的海 马 SP含量发生显著变化，提示电针对 SP 的影响在 生理和病理状态下有一定的差别，说明 SP在 MCAO 模型大鼠脑组织中含量变化的敏感性与特异性。 参考文献: ［1］沈德凯，侯思伟，许能贵．电针对局灶性脑缺血大鼠神经 元损伤保护作用的病理组织学研究［J］．中国中医药科 技，1998，5( 5) : 269 － 270． ［2］沈德凯，吴婷婷，杨帆．蛛网膜下腔注射 P物质在电针治 疗大鼠局灶性脑缺血过程中的作用［J］．安徽中医学院 学报，2009，28( 5) : 37 － 40． ［3］KOIZUMI J，YOSHIDA Y，NAKAZAWA T，et al． Experi- mental studies of ischemic brain edema: A new experimen- tal model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic Area［J］． Stroke，1986， 8( 1) : 65． ［4］李忠仁． 实验针灸学［M］． 北京: 中国中医药出版社， 2003: 327． ［5］PAXINO S，WATSO N． The rat brain in sterrotaxic coordi- nated． 3nd［M］． 诸葛启钏，译． 北京: 人民卫生出版社， 2005: 86 － 109． ［6］ZEA LONGA E，EINSTEIN P R，CARLSON S，et al． Re- versible middle cerebral artery occlusion without craniecto- my in rats［J］． Stroke ，1989，20( 1) : 84． ［7］杨士军，冯真贵，左红霞． 急性脑梗死患者血浆生长抑 素、P物质含量变化及临床意义［J］．标记免疫分析与临 床，2002，7( 4) : 186 － 188． ［8］吴克俭，花放，孙景玲． 3 种大鼠全脑缺血模型定量脑电 图的实验研究［J］． 徐州医学院学报，2001，21 ( 4 ) : 326 － 329． ［9］万毅，沈德凯，郑景辉．电针对大鼠局灶性脑缺血过程中 SP影响的研究［J］． 中国中医基础医学杂志，2009，15 ( 7) : 530 － 533． ［10］方玲，慕容慎行，许国英，等．实验性脑缺血大鼠脑内 P 物质( SP) 的动态变化［J］．中国临床神经科学，1999: 7 ( 2) : 87 － 89． ( 收稿日期: 2010-09-02 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 ) ( 上接第 176 页) 蛋白表达明显增加，IL-4 蛋白表达明显降低;揭示脾 虚可导致 IFN-γ、IL-4 蛋白表达变化和 Th1 /Th2 平 衡失调。IFN-γ、IL-4 蛋白表达的变化是脾虚对免疫 功能影响的之一。 四君子汤和玉屏风散均是补气扶正的方剂，对 模型动物的免疫指标的影响作用相似。实验提示四 君子汤、玉屏风散可能通过影响免疫器官、调控细胞 因子 IFN-γ和 IL-4 活性表达而调节机体免疫功能。 参考文献: ［1］杨舒，钱会南．中医脾虚证的免疫机制研究进展［J］．辽 宁中医杂志，2008，35( 9) : 1433 － 1435． ［2］陈小野．脾气虚证动物模型初步化的造模方法和思 路［J］．中国中医基础医学杂志，2003，9( 1) : 3 － 5． ［3］陈小野，邹世洁，张智． 大鼠长期脾虚造模的实验研究 ［J］．中国中医基础医学杂志，1995，1( 1) : 37 － 41． ［4］孙曼妮，曹庆隽，张硕． γ-干扰素的分子生物学研究进展 ［J］．基层医学论坛，2007，11( 6) : 562 － 564． ［5］刘倩娴，万幸，梁旻若，等．补中益气汤及其拆方的免疫 调节作用［J］． 广州中医药大学学报，1997，14 ( 2 ) : 108 － 111． ( 收稿日期: 2010-03-02) ·881· 北京中医药大学学报 第 34 卷