白血病干细胞的生物学特性

●新进展 《生命的化学》2007年27卷1期 CHEMISTRYOFLIFE2007,27(1) 域的小分子 BH3模拟剂改变两类 Bcl-2家族蛋白 的含量和功能状态平衡,从而促使肿瘤细胞凋 亡。但由于细胞内 Bcl-2家族蛋白调控机制的复 杂性和 BH3模拟剂在活性上与自然蛋白质间的巨 大差异,使得 BH3模拟剂在治疗肿瘤效果上不尽 人意。同时,Bcl-2家族蛋白和线粒体膜间的作 用也为我们提供了一条调控细胞凋亡的途径。 总之,Bcl-2家族蛋白活性的改变是相互影 响相互制约的,在不同的组织细胞,不同的凋亡 信号下 Bcl-2家族蛋白活性改变机制具有巨大的 差异,形成了一个复杂的调控网络。确切了解它 的作用机制和功能可以为许多疾病的预防、诊 断、治疗提供新的理论依据。 参 考 文 献 [1] PetrosAMetal.BiochimBiophysActa,2004,1644:83-94 [2] ChandraDetal.JBiolChem,2005,280(19):19051-19061 [3] DeChiaraGetal.JBiolChem,2006,281: 21353-21361 [4] GaoYetal.JCerebBloodFlowMetab,2005,25(6):694-712 [5] TsurutaFetal.EMBOJ,2004,23(8):1889-1899 [6] MastersSCetal.MolPharmacol,2001,60(6):1325-1331 [7] YuFetal.NeurobiolDis,2005,20(2):491-499 [8] MacdonaldAetal.BMCCellBiol,2006,7:1-14 [9] SunayamaJetal.JCellBiol,2005,170(2):295-304 [10] DayCLetal.BiochemJ,2004,377(Pt3):597-605 [11] MellerRetal.JBiolChem,2006,281(11):7429-7436 [12] GoonesingheAetal.BiochemJ,2005,387(Pt1):109-118 [13] LetaiAetal.CancerCell,2002,2(3):183-192 [14] WaterhouseNJetal.JBiolChem,2005,280(6):4476-4482 [15] BonzonCetal.MolBiolCell,2006,17(5):2150-2157 [16] MikhailovVetal.JBiolChem,2003,278(7):5367-5376 [17] AdachiM etal. Am JPhysiolGastrointestLiverPhysiol, 2004,287(3):G695-G705 [18] PrechtTAetal.CellDeathDiffer,2005,12(3):255-265 [19] SugiyamaTetal.Oncogene,2002,21(32):4944-4956 文章编号:1000-1336(2007)01-0025-03 白血病干细胞的生物学特性 何 鹏 张 伶 (重庆医科大学医学检验系临床血液教研室、 临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室, 重庆 400016) 摘要: 白血病干细胞是第一个被确认的肿瘤干细胞,在白血病的形成和病情的发展中具有重要作用。深入研究 其生物学特性将为白血病的发病机制以及干细胞靶向治疗奠定理论基础。该文介绍白血病干细胞的免疫型、 自我更新机制、生存优势及多重耐药等。 关键词: 肿瘤干细胞; 白血病; 免疫表型; 自我更新; 多重耐药 中图分类号: Q25 ——————————— 收稿日期: 2006-09-20 重庆市教委科学技术研究基金资助项目(No.KJ050309) 作者简介: 何 鹏 (1978—),男,硕士生,E-mail:hep- eng000@sina.com; 张 伶 (1970—),女,博士,副教授,联系作 者,E-mail:cqumszhl@sina.com 肿瘤干细胞假说认为肿瘤组织是由处于不同 分化等级差别的细胞组成的,而维持这一体系的 是其中极少数具有自我更新和增殖能力的肿瘤干 细胞。1997年,Bonnet等[1]首先在恶性造血系统 肿瘤中证实了肿瘤干细胞,即白血病干细胞 (leukemiastemcell,LSC)的存在,提出 LSC是形 成白血病的“罪魁祸首”。那么,LSC有哪些独特 的生物学特性?与正常的造血干细胞相比有哪些 异同之处,从而导致 LSC不仅是白血病发生、发 展的根源,而且还是影响疾病预后的重要因素。 1.LSC的免疫表型 免疫表型是细胞功能和身份的标志。LSC具 有干细胞的特性,也具有与正常造血干细胞 (hematopoieticstemcell,HSC)相似的免疫表型。 研究发现急性髓系白血病(AML)骨髓细胞中存在 LSC亚群,它们能够使非肥胖糖尿病/重症联合免 疫缺陷(NOD/SCID)小鼠致瘤。除 M3型外,AML 各个型别(M0～M5型)来源的 LSC均表达相同的免 疫表型 CD34+CD38-,这与正常骨髓 HSC的表面 特征相似。CD34+CD38-是人们首次认识到的 LSC 表型,也是目前确认 LSC的公认标准。此外, LSC还可表达与 HSC共同的表型 CD71-HLA- DR-。与 HSC表型特征不同的是,LSC特异性表 """""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""" 25· · ●RecentProgresses 《生命的化学》2007年27卷1期 CHEMISTRYOFLIFE2007,27(1) 达 CD90-CD117-CD123+[2]。在明确了 LSC表达 CD34+CD38-核心表面标志的基础上,最近 Florian 等[3]利用多色流式细胞术进一步分析 LSC的免疫 表型,结果发现 AML、慢性粒细胞白血病、骨髓 增生异常综合征(MDS)和系统性肥大细胞增多症 等髓系来源的血液肿瘤细胞中,LSC亚群除表达 已知的 CD123外,还不同程度地表达 CD13、 CD33和 CD44抗原。而 CD44是一种分布广泛的 黏附分子,CD13和 CD33均为髓系造血细胞特异 的表面标志物。因此,该发现与以往认为 LSC并 不表达髓系、红系等系特异性抗原的观点相冲 突。Florian等认为这些表达髓系特异性抗原的 LSC,可能是由于髓系祖细胞基因发生突变并重 新获得了自我更新能力;这恰好也验证了 LSC除 了直接来源于 HSC,也可能由造血祖细胞去分化 而形成的观点。随着对 LSC免疫表型认识的不断 深入,联合运用免疫标志分离纯化数量稀少的 LSC已逐渐成为可能。目前分选 LSC的主要方 法———流式细胞术和免疫吸附分选法,均是利用 LSC表面抗原而进行的。此外,在临床上还可利 用 LSC的免疫表型特征来设计靶向干细胞的治疗 方案,但同时需考虑可能存在与 HSC之间的免疫 交叉反应。如根据 LSC特异性表达 CD123(IL-3 受体 α链)的特点,利用 CD123单克隆抗体偶联 化疗药物进行 LSC的靶向性治疗,这种靶向性治 疗能很大程度上降低化疗药物对正常造血细胞的 损害。所以,CD123已成为目前靶向 LSC治疗的 最佳候选标志。但有人尝试利用抗-CD33抗体介 导靶向杀伤白血病干/祖细胞,由于 CD33在 HSC 也有表达,因此以 CD33为靶抗原可能会造成对 正常HSC的损伤。 2.LSC的自我更新机制 自我更新又称自我复制,是指干细胞进行不 对称有丝分裂,正常稳定状态下约半数子细胞仍 保持干细胞的全部特性,它是 LSC最显著的特征 之一。Hope等[4]将带有示踪标记的人 LSC植入 NOD/SCID小鼠,人LSC能在全部小鼠骨髓内形成 白血病细胞克隆,继续取小鼠骨髓细胞进行连续 传代移植,移植12周后在第二代、甚至第三代受 体骨髓内仍可见与原代相似的白血病克隆,说明 LSC具有自我更新能力。那么维持 LSC自我更新 能力的分子机制是怎样的呢?近年来研究证明 Bmi-1基因和 MLL基因在其中扮演着非常重要的 角色。 2.1Bmi-1基 因 Bmi-1是 B细 胞 特 性 的 Moloney小鼠白血病病毒整合位点 1基因的简称, 为 PcG(polycombgroup)转录抑制因子家族的一员, 常高表达于造血前体细胞,是维持 HSC自我更新 的必需因子。而 Bmi-1等位基因剔除(Bmi-/-)小鼠 的长期造血重建能力显著下降,说明在维持正常 造血中起着重要作用。为探讨 Bmi-1是否同样参 与调控LSC的自我更新,Lessard等[5]将致癌基因 Hoxa9和 Meis1导入 Bmi-1-/-小鼠胎肝细胞,并移 植到亚致死剂量照射的同系小鼠,结果无论受体 小鼠 Bmi-1基因的表达状态如何(Bmi-1+/+或 Bmi- 1-/-),在相同的时间内所有受体小鼠均能形成 AML,并具有相似的表型和病理特征,但Bmi-1-/- 受体小鼠外周血白血病细胞较低,其骨髓细胞不 能使下一代受体小鼠发生白血病。若诱导 Bmi-1 基因表达则能逆转 Bmi-1-/-小鼠来源 LSC的致病 能力。提示 Bmi-1基因在白血病形成早期并不是 必需因素,但 Bmi-1高表达却是维持 LSC自我更 新机制的关键。 2.2MLL基 因 MLL基 因 即 混 合 系 白 血 病 (mixedlineageleukemia)基因,其编码的 MLL蛋白 是维持正常造血所必需的转录调控因子。最近发 现,MLL相关融合基因在造血祖细胞重获自我更 新潜能、并向白血病干细胞转化的过程中起着重 要作用。Krivtsov等[6]利用鼠干细胞病毒载体将 MLL-AF9融合基因导入小鼠粒单祖细胞(GMP), 这种 GMP能够启动小鼠发生白血病,提示 MLL- AF9通过诱导GMP重获自我更新能力从而引发白 血病。进一步利用基因芯片分析 MLL-AF9易位 对 GMP细胞基因表达的影响,发现 MLL-AF9融 合基因的表达将引起与自我更新相关的基因在 GMP重新激活,如 HOXA和 Mef2c基因的快速高 表达。以上结果表明,MLL-AF9融合基因的形成 参与调控造血祖细胞向 LSC的转化,MLL-AF9 能够诱导造血祖细胞重新获得自我更新能力。 3.LSC的生存优势 LSC具有独特的生存优势。与 HSC相似, 95%以上的 LSC处于细胞周期的静止期(G0期), 因此大多数 LSC处于休眠状态,并不进行 DNA 的复制和完成细胞增殖活动。然而,与 HSC不同 的是,LSC具有更强的增殖潜能以维持 LSC的生 存优势。根据对 Hoechst33342或 PyroninY拒染 的特点分离静止期的 LSC,将其在无外来生长因 子的条件下进行无血清培养72小时,结果发现处 26· · ●新进展 《生命的化学》2007年27卷1期 CHEMISTRYOFLIFE2007,27(1) 于G0期的LSC百分比大大减少(减少到约 16.7%), 而大部分 LSC进入 G1或 S期;然而,在相同的 培养条件下仍有高达 98.3%的正常 HSC处于 G0 期,提示 LSC能够自发地进入细胞周期,通过细 胞无限增殖以保持LSC的生存优势。Guan等认为 这其中可能有两方面因素的参与,一方面 LSC可 自分泌 GM-SCF等生长因子,从而动员 G0期的 LSC进入细胞增殖周期;另一方面,LSC中某些 基因突变导致非生长因子依赖性的信号转导通路 激活,如酪氨酸激酶受体 FLT3基因突变形成串 联重复序列(ITD),持续激活的 FLT3/ITD可通过 下游信号通路(STAT5)传送增殖信号以刺激细胞生 存[7]。已知细胞的生存状况与其抗凋亡能力密切 相关。研究发现,LSC具有增强的抗凋亡能力, 其中核转录因子NF-κB和抗凋亡蛋白发挥了重要 的调控作用。LSC存在 NF-κB持续性的激活,而 在 HSC中未见其表达,活化的 NF-κB能够通过 激活多种凋亡抑制基因的转录而增强细胞的抗凋 亡能力。为进一步了解 NF-κB在 LSC凋亡调控 中的重要作用,在体外采用小白菊内脂(PTL)作用 LSC18小时,结果发现 PTL能够特异性地促进 LSC凋亡,而对 HSC的生存无影响;其机制是 PTL阻止了IKK复合体对NF-κB负调节因子I-κB 的泛素化降解,从而间接抑制 NF-κB的活性[8]。 因此,激活的NF-κB通过调节细胞凋亡水平在维 持 LSC生存中具有重要作用。此外,抗凋亡蛋白 的高表达也有利于维持细胞的生存。此外,与处 于增殖期的 CD34+白血病细胞相比,静止期 CD34+白血病细胞表达高水平的抗凋亡蛋白BCL-2 和BCL-XL,从而赋予LSC更强的抗凋亡能力。 最新研究发现,除了 NF-κB持续性的激活和 抗凋亡蛋白的高表达之外,维持 LSC的存活还离 不开细胞生存和增殖信号通路的参与。研究表 明,部分 AML来源的 LSC亚群中存在磷脂酰肌 醇-3激酶(PI3K)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信 号途径的活化,而它们异常持续活化可进一步诱 导NF-κB的激活而发挥调节LSC生存的作用[9]。 4.LSC的多重耐药特点 体外实验发现,LSC对多种化疗药物耐受或 呈低反应性,一方面与 LSC自身的细胞周期特点 有关,大多数 LSC处于静止期,因此对临床上的 细胞周期依赖性化疗药物(如5-氟尿嘧啶)不敏感, 并对 IL-3等细胞生长因子的刺激应答性也较弱。 另一方面,LSC表面表达多种膜转运蛋白,能够 将Hoechst33342等荧光染料以及多种化疗药物排 出细胞外,其中ATP结合盒(ATP-bindingcassette, ABC)膜转运蛋白发挥了重要的药物外排作用。 ABC膜转运蛋白超家族具有 ATP依赖性药物排出 功能,主要包括乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P-糖蛋 白及多重药物抵抗蛋白(MRP)。BCRP介导的耐药 谱主要包括米托蒽醌、阿霉素等抗肿瘤药物。研 究发现,无论是 BCRP的蛋白质含量和 mRNA水 平,BCRP均优先表达于 CD34+CD38-白血病干细 胞亚群,使得 LSC胞内米托蒽醌的药物浓度明显 低于CD34+CD38+细胞。然而,抑制 BCRP并不能 完全逆转 LSC对米托蒽醌的耐药,利用 BCRP抑 制剂 KO143逆转 BCRP介导的 LSC外排作用,能 使胞内米托蒽醌浓度有所增加,但胞内药物浓度 却远远低于仅表达 BCRP的对照组乳腺癌 MCF-7 细胞株。这些研究结果提示,LSC的耐药性与胞 膜上 BCRP高表达有关,但同时也不排除其他耐 药蛋白质的存在[10]。最近在多种血液肿瘤 CD34+ 细胞中发现有 P-糖蛋白、MRP和肺耐药蛋白 (LRP)等耐药相关蛋白质不同程度的表达。与正常 骨髓CD34+细胞相似,AML和高危性 MDS来源的 CD34+细胞表达一定水平的 MRP和 LRP,而 P-糖 蛋白则在 AML的表达高于高危性 MDS。因此, LSC多重耐药性是多因素共同作用的结果,既与 多数 LSC处于静止期有关,也离不开白血病细胞 表面多种耐药相关蛋白质的外排作用。 5.结语 综上所述,LSC是表型为 CD34+CD38-的白血 病细胞亚群,除了具有与自我更新能力和无限增 殖潜能等干细胞的特性外,还具有独特的生存优 势和多重耐药机制。对 LSC生物学特性的深入研 究,将为 LSC的分离纯化、靶向 LSC的治疗研究 奠定基础,同时也为白血病发病的分子机制研 究、疾病监控以及预后判断提供理论依据。 参 考 文 献 [1] BonnetDetal.NatMed,1997,3(7):730-737 [2] TaussigDCetal.Blood,2005,106(13):4086-4092 [3] FlorianSetal.LeukLymphoma,2006,47(2):207-222 [4] HopeKJetal.NatImmunol,2004,5(7):738-743 [5] LessardJetal.Nature,2003,423(6937):255-260 [6] KrivtsovAVetal.Nature,2006,442(7104):818-822 [7] GuanYetal.Blood,2003,101(8):3142-3149 [8] GuzmanMLetal.Blood,2005,105(11):4163-4169 [9] BardetVetal.Haematologica,2006,91(6):757-764 [10] RaaijmakersMHetal.ClinCancerRes,2005,11:2436-2444 27· ·