干细胞_糖尿病细胞治疗的新资源

综述 作者单位: 100850 北京,军事医学科学院输血研究所干细胞生物学 研究室 干细胞 � � � 糖尿病细胞治疗的新资源 李艳华 � 裴雪涛 � � 提要! � 本文复习了干细胞的生物学特性和讨论了利用不同来源的干细胞治疗糖尿病的可能性。 � � 关键词! � 干细胞; 糖尿病; 治疗 Stem cells: the new resourse for diabetes therapy � � L I Yan�hua, PEI X ue�tao. L aboratory of S tem Cell Biology , Beij ing Institute of Transf usion Medicine, Military Medical Academy of Science, Beij ing 100850 Summary! � The article reviews the biological characteristics of stem cells and discusses the possibility of utilizing stem cells from var ious origins for diabetes therapy. Key words! � Stem cell; Diabetes mellitus; Therapy ( Chin J Endocrinol Metab, 2003, 19: 70�72) � � 近几年,各国糖尿病发病率不断上升。据 2000 年第 17 届 国际糖尿病大会调查的结果显示,全世界的糖尿病患者数已超 过 1. 51 亿。临床上通常采用皮下注射胰岛素来治疗 1 型及部 分 2型糖尿病,其治疗效果并不理想, 且很难阻止糖尿病并发 症的发生及发展。对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者 来说,植入胰岛�细胞或其替代物是一个很吸引人的。但 供者细胞来源不足及免疫排斥反应等限制了这种方法的应用。 干细胞作为一类具有多向分化潜能的细胞, 已经逐渐成为人们 寻找胰岛�细胞替代物的新资源∀1#。本文就干细胞在糖尿病 细胞治疗方面的优势、研究现状及发展趋势作一综述。 一、干细胞独特的生物学特性 干细胞是一群较原始的细胞,他们具有极强的自我更新能 力及多向分化潜能。在特定条件下,干细胞既可对称分裂为二 个新的子代干细胞或二个功能细胞,也可不对称分裂为一个子 代干细胞和一个功能细胞,从而使组织和器官保持生长和衰退 的动态平衡。目前,研究人员已经从许多组织或器官中成功地 分离出干细胞,如从发育早期的囊胚期内细胞团或生殖嵴中分 离出了胚胎干细胞( embryonic stem cell, ESC) , 从骨髓、外周血 或脐血中分离出了造血干细胞( hematopioet ic stem cell, HSC) , 从骨髓中分离出了间充质干细胞( mesenchymal stem cell, MSC) 等。此外, 人们对肝脏干细胞、肌肉干细胞、胰腺干细胞等的认 识也在逐渐增多。 根据干细胞发育阶段的不同,可将其分为胚胎干细胞和组 织或成体干细胞。传统观点认为, 胚胎干细胞具有全能性, 能 分化为体内所有的组织和器官,人们已经由胚胎干细胞诱导分 化出了血液细胞、神经细胞、心肌细胞等∀2#。而成体干细胞的 分化潜能较弱,人们通常认为新生的干细胞一旦被确定为某种 细胞类型, 就会受到某些特定编码序列的调控, 只能分化成特 定的组织细胞。近年来,研究人员发现成体干细胞仍保持着向 多种组织分化的潜能。如间充质干细胞可分化为骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞、神经元等∀3#; 骨髓中的干细胞可分化成肝卵圆 形细胞∀4#;肌肉来源的干细胞移植于受放射线照射后的小鼠, 能重建受者的造血功能等∀5#。干细胞横向分化潜能的发现对 组织器官替代治疗、创伤修复、细胞治疗等具有革命性意义。 干细胞独特的生物学特性使得它成为各类疾病细胞治疗 和基因治疗的首选靶细胞。应用干细胞治疗疾病具有很多优 点:来源充足;低毒性(或无毒性) ;一次给药, 长期有效; 自身干 细胞移植还可避免产生免疫排斥反应和相关的伦理学争论等。 二、干细胞用于糖尿病治疗 1. 干细胞在糖尿病细胞治疗方面的优势:临床上, 1 型糖尿 病及部分 2型糖尿病患者常需要终身胰岛素注射治疗。但胰 岛素注射疗法对血糖的控制并不理想, 它无法阻止糖尿病肾 病、冠心病、糖尿病眼病等并发症的发生和发展。近几年,经肝 内门静脉注入胰岛细胞治疗糖尿病取得了一些疗效, 一些病人 在接受成人胰岛细胞移植后, 能脱离胰岛素治疗, 血糖控制的 时间可长达 1 年以上∀6#。遗憾的是, 胰岛细胞移植仍面临着两 大难题:供者来源不足、严重的免疫排斥反应等。 干细胞独特的生物学特性、极强的自我更新能力及多向分 化潜能无疑是获得大量胰岛�细胞的最佳种子细胞。据统计, 美国每年仅有 3 000 个尸体可提供胰腺, 但一年内仅 1 型糖尿 病患者就新增 30 000 人, 而每个糖尿病患者至少需要移植两 具尸体的胰岛才能达到治疗效果。尸体来源的胰岛细胞难以 反复应用。干细胞是具有增殖及分化潜能的细胞, 将其诱导分 化为胰岛�细胞, 则可极大地解决胰岛细胞来源不足的问题。 干细胞是基因治疗的最理想靶细胞。对于糖尿病患者来 说,仅输入足够数量的胰岛细胞并不能达到治疗效果。来源于 自体干细胞的胰岛细胞在植入 1 型糖尿病患者体内后 ,仍会受 到免疫攻击,而如果采用同种异体的细胞进行移植也同样会遭 受免疫排斥反应。对干细胞进行基因修饰, 可避免免疫排斥反 应的攻击。可以通过以下手段改造胚胎干细胞∀7#: 建立包含多 种 MHC 基因型的胚胎干细胞库以供随意选用; 建立经遗传改 构的通用型 MHC 基因型胚胎干细胞系, 这种细胞已在小鼠中 ∃70∃ 中华内分泌代谢杂志 2003年 2月第 19卷第 1期 � Chin J Endocrinol Metab, February 2003, Vol 19, No. 1 获得初步的成功; 借助基因打靶技术, 度身定做一个与受者 MHC 同型的 ESC 系; 借助核移植技术,将受者细胞的全部基因 组转移给 ESC,建立特定受体相同基因组型的干细胞系等。 干细胞的另一优势在于其分化的胰岛细胞可以发挥对血 糖的生理性调节作用。通过对非�细胞(如肝细胞、垂体细胞、 成纤维细胞等)进行基因修饰, 虽然可以使它们分泌胰岛素, 但 这些细胞并不能精确的模拟 �细胞发挥生理性的调节作用。 理想的 �细胞替代物必需具有以下特点: 达葡萄糖激酶 ( GK)和葡萄糖转运子( Glut ) 2; 低表达高亲和力的己糖激酶 ( HK ) ;表达激素原转换酶 PC2、PC3, 能将胰岛素原有效地加工 成胰岛素;能将胰岛素释放入细胞外的分泌系统。虽然肝细胞 是体内除了胰岛细胞外唯一含有葡萄糖感受器的细胞∀8#,但它 缺乏激素原转换酶 PC2、PC3,不具有葡萄糖控制胞吐作用的分 泌颗粒, 无储存分泌蛋白的隔离区,所以它不具有精确调节血 糖水平的能力。有实验室对肝细胞进行转基因处理∀9#,但不幸 的是,这些经过基因修饰的肝细胞并不能像正常的�细胞那样 分泌胰岛素。综上所述,由干细胞诱导分化的 �细胞是糖尿病 细胞治疗的最佳种子细胞。 2.种子细胞: ( 1)胚胎干细胞: 胚胎干细胞是来源于哺乳动 物早期胚胎内细胞团中的一种二倍体细胞, 一般可从植入子宫 内膜前的囊胚等早期胚胎中获得。这种细胞具有长期的未分 化增殖能力 ,在体外长期培养后, 仍具有稳定发育成各胚层的 潜能。通过添加特异的诱导因子或去除饲养细胞层及抑制分 化的因子, 可将胚胎干细胞诱导分化成各种不同的细胞类 型∀10#。已经有学者将胚胎干细胞诱导分化成神经细胞、造血 细胞、肌肉细胞等∀2#。胚胎干细胞的全能性为研究糖尿病的细 胞治疗开辟了新途径。研究人员相继用不同的方法获得了分 泌胰岛素的细胞。Soria 等∀11#将含有人 Ins/�geo 基因及 pGK� hyg ro基因的 DNA转入小鼠胚胎干细胞中,用潮霉素及新霉素 筛选并在低糖浓度下将这种细胞诱导分化成能分泌胰岛素的 细胞。体外检测证实这些细胞分泌胰岛素的量可随着糖浓度 的增加而增加;当植入糖尿病小鼠的体内后, 可逆转小鼠的高 血糖症状。Lumelsky 等∀12#则是用复杂的五步法将小鼠的胚胎 干细胞诱导分化成能分泌胰岛素的类似于胰岛的结构。他们 先将小鼠的胚胎干细胞培养成类胚体,用 ITSFn 培养基培养使 其产生 Nestin 阳性的细胞, 并在此基础上诱导出了含有神经细 胞及�、�等多种胰岛细胞的细胞群。或许是因为移植数量不 足、移植部位不理想, 这些细胞在植入糖尿病小鼠的皮下后未 能纠正高血糖水平,但细胞在植入 12 天后发生血管化, 其形态 类似于胰腺的胰岛,并保持着分泌胰岛素的能力。最近的研究 结果表明人胚胎干细胞也能分化成分泌胰岛素的细胞。有实 验室∀13#培养了人胚胎干细胞, 并让它们自发形成类胚体;然后 用多种生长因子诱导类胚体分化。结果未添加生长因子的类 胚体与添加了生长因子的类胚体都表达 PDX�1( PDX�1 与胰岛 �细胞的形成有关)。他们的试验结果提示了类胚体可以自发 分化成胰岛�细胞。Assady 等∀14#通过实验进一步证实了人胚 胎干细胞可自发分化为 �细胞的现象。他们估计类胚体中有 1% ~ 3%的细胞是胰岛�细胞。在葡萄糖存在的情况下,这些 细胞可以向培养基中分泌胰岛素。由胚胎干细胞向胰岛细胞 分化的研究刚刚起步,如何完善诱导方案以获得大量纯化的功 能性�细胞替代物是今后急需解决的问题。( 2)胰腺干细胞: 近几年来,由于糖尿病细胞治疗面临着胰岛细胞来源不足等问 题,人们开始把目光投向胰腺干细胞。但人们对胰腺干细胞的 了解并不多。最近, Habener 等报道了人及大鼠的胰管及胰岛 组织存在胰腺干细胞,这些干细胞表达 Nestin�神经干细胞的特 征性标志,但不表达胰管上皮或胰岛细胞的标志∀15#。事实上, 胰腺干细胞的% 身份&并不明确,人们没有发现胰腺干细胞的表 面标志,更无法像分离造血干细胞那样轻而易举地分离出胰腺 干细胞。有人认为胰腺干细胞存在于成熟的胰管细胞之间, 也 有人认为胰腺干细胞是由胰管细胞分化而来的。国外已有将 小鼠胰腺干细胞成功地诱导分化为胰岛细胞的报道∀16#。他们 并没有分离胰腺干细胞,而是将消化的胰腺组织制成单细胞悬 液,用添加正常小鼠血清的低糖 EHAA 培养基对其进行培养, 直到生长出单层上皮样的细胞,即胰腺干细胞。这些干细胞具 有很强的自我更新能力及分化潜能。Ramiya∀16#等长期培养了 胰管中的干细胞(超过 3 年 ) , 在整个培养过程中, 它们均保持 着分化为胰岛细胞的潜能。体内移植实验证实这些分化而来 的胰岛细胞能够逆转 NOD 小鼠的糖尿病症状。最近, Weir 等∀17#对分离于人胰腺组织的胰管细胞进行培养 , 成功诱导了 胰腺干细胞分化为既含胰管细胞又含胰岛细胞的细胞群。这 些细胞群能分泌胰岛素, 其分泌量随着糖浓度的增高而增多, 他们用免疫组化等方法证明了这些细胞群含有胰岛的所有细 胞类型。很显然,扩增及诱导胰腺干细胞分化是获得�细胞替 代物的更直接的途径。但若将胰腺干细胞应用于临床, 还需要 做很多工作 ,如寻找最佳的扩增及诱导方案、最佳的移植部位 等。( 3)其它干细胞:有学者∀18#将含有 PDX�1 的腺病毒经静脉 注入链脲霉素诱导的糖尿病小鼠体内后, 发现这些小鼠体内的 60%的肝细胞能合成 PDX�1。PDX�1 的表达使肝内免疫活性 的胰岛素浓度持续增加(经过加工的胰岛素占 59%、胰岛素原 占 41% ) , 血清中免疫活性胰岛素的浓度增加为对照组 (含 �� gal的腺病毒)的 3 倍。小鼠的高血糖水平在注入 PDX�1 两天 后开始逐渐下降。免疫组化染色证实肝内含胰岛素或胰岛素 原的细胞占 0. 1% ~ 1%。研究人员并不知道异位表达的 PDX� 1 究竟使肝脏中的哪一类亚细胞群发生了表型转变。根据 Brill 等做的体外实验, 即将 PDX�1 转入体外原代培养的肝细胞中 (成熟肝细胞占 98% ) , 没有检测到内源性的胰岛素基因的表 达,他们推测,异位表达的 PDX�1 很可能诱导了肝祖细胞发生 了横向分化。肝细胞具有较强的再生能力并含有较高比例的 祖细胞。重组腺病毒感染可能作为一种% 细胞攻击&被肝识别, 从而导致了肝祖细胞的增加及表型的转变。其它组织干细胞 是否具有分化为胰岛�细胞的能力, 尚没有报道。 3.存在的问题:干细胞用于糖尿病细胞治疗还需要走很长 的路。目前,人们对干细胞向胰岛�细胞的诱导分化机制尚不 明确,要获得大量纯化的胰岛�细胞还需待以时日。不论是以 胚胎干细胞还是以胰腺干细胞作为种子细胞都存在一定的限 制。如胚胎干细胞受到社会伦理学的限制, 而胰腺干细胞又受 到取材的限制。事实上,人们对植入患者体内的细胞的种类也 存在不同的看法。有人认为植入纯化的 �细胞效果好, 也有认 ∃71∃中华内分泌代谢杂志 2003年 2月第 19卷第 1期� Chin J Endocrinol Metab, February 2003, Vol 19, No. 1 认为植入含有�、�等多种细胞的胰岛效果好, 因为胰岛的多种 细胞将在同一微环境中协同发挥调节血糖的作用。要弄清这 个问题,就需要做大量的体内外实验来观察。 干细胞用于糖尿病治疗的研究才刚刚开始, 要将纯化的胰 岛细胞或单纯的�细胞用于临床还需解决很多问题, 如植入细 胞数是多少,能否根据糖尿病患者的病情轻重而酌情输入所需 的细胞数? 如何解决免疫排斥的问题? 对干细胞进行适当的 基因修饰还需要进一步的探索。将细胞包入微囊中∀19#, 不失 为一个好办法。用做微囊的材料具有生物相容性, 它是一种半 透膜, 免疫效应细胞及免疫球蛋白、补体等大分子不能进入微 囊内,营养物质及胰岛素则可自由出入半透膜。但这种微囊包 被技术仍存在很多不足,如由免疫效应细胞分泌的细胞因子及 自由基可以进入微囊内诱导�细胞凋亡等∀20#。此外, 代谢能 力旺盛的胰岛细胞需要得到充足的氧气、需要很容易地得到促 胰岛素分泌素的调节,这两点却限制了微囊包被的细胞数。 4.展望 :干细胞是近年来生物学上最有趣、最复杂、也最有 吸引力的领域之一。随着人们对干细胞潜能的挖掘及其增殖、 分化机理的研究,相信干细胞最终可以用于疾病的组织器官替 代治疗、细胞治疗和基因治疗等。 最近, 胚胎干细胞及胰腺干细胞可定向诱导分化为胰岛 � 细胞的研究 ,为糖尿病患者点然了新的希望, 也为研究人员及 医生提供了治疗糖尿病的新突破口。干细胞无疑是治疗糖尿 病的最佳种子细胞。深入了解胰腺的个体发生机制及干细胞 定向分化为�细胞的分子调控机制,将会加快糖尿病细胞治疗 的研究进展。进一步探索成体干细胞的可塑性, 如骨髓干细 胞、肌肉干细胞、皮肤干细胞等是否具有向胰岛细胞分化的潜 能,可回避胚胎干细胞的伦理学争论及克服选用自体的胰腺干 细胞需要做较大的手术等困难。 糖尿病是遗传因素和环境因素共同作用的结果, 虽然其病 因复杂, 但随着基因工程及细胞工程技术的蓬勃发展, 相信人 类最终会攻克糖尿病。 参 � 考 � 文 � 献 1 Serup P, Madsen OD, Mandrup�Poulsen T . 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