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二硫键的氧化还原状态对Trx融合赤霉酸诱导富含半胱氨酸蛋白内源荧光及变性过程影响

2011-10-02 6页 pdf 379KB 47阅读

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二硫键的氧化还原状态对Trx融合赤霉酸诱导富含半胱氨酸蛋白内源荧光及变性过程影响 第30卷,第2期 2010年2月 光谱学与光谱分析 SpectroscopyandSpectralAnalysis W01.30,No.2。pp395—400 February,2010 二硫键的氧化还原状态对Trx融合赤霉酸诱导 富含半胱氨酸蛋白内源荧光及变性过程影响 张 腾1,冯 娟H,李 阳1,陈 锐1,汤丽霞1,庞小峰1,任正隆·,z 1.电子科技大学生命科学与技术学院,四川成都610054 2.四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室,四川雅安625014 摘要在采用亲和层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳...
二硫键的氧化还原状态对Trx融合赤霉酸诱导富含半胱氨酸蛋白内源荧光及变性过程影响
第30卷,第2期 2010年2月 光谱学与光谱分析 SpectroscopyandSpectralAnalysis W01.30,No.2。pp395—400 February,2010 二硫键的氧化还原状态对Trx融合赤霉酸诱导 富含半胱氨酸蛋白内源荧光及变性过程影响 张 腾1,冯 娟H,李 阳1,陈 锐1,汤丽霞1,庞小峰1,任正隆·,z 1.电子科技大学生命科学与技术学院,四川成都610054 2.四川农业大学植物遗传育种省级重点实验室,四川雅安625014 摘要在采用亲和层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对原核达的赤霉酸诱导的富含半胱氨 酸蛋白(Trx-GcGASA)进行纯化、鉴定的基础卜,运用稳态荧光光谱手段研究了二硫苏糖醇(DTT)、氧化型 谷胱甘肽(GSSG)、过氧化氖、盐酸胍(GdnHCI)对Trx-GcGASA内源荧光及变性过程的影响,发现(1)在中 性缓冲体系中融合蛋白的内源荧光以305m的酪氨酸的荧光发射为主;(2)伴随着二硫键还原,融合蛋白中 色氨酸和酪氨酸的相对荧光强度比值从0.7变化至1.8倍左右;(3)经过0.5mmol·L_1GsSG、5mmol· L_1过氧化氢处理后,酪氨酸和色氨酸的荧光强度下降约12~21%;(4)无论是否采用1mmol·L-1UrT处 理,6mol·L-1盐酸胍均不能诱导融合蛋白彻底变性;(5)--硫键的存在与否影响了盐酸胍诱导的变性过程。 通过两态模型拟合获得Trx-GeGASA变性过程Gibbs自由能变化AG约为3.7kJ·mol~。相关二I:作不仅为 深入研究融合伴侣Trx对GcGASA变性热力学、动力学及复性过程影响奠定了基础;同时,也为通过光谱 手段获取GcGASA的结构信息提供-r基础的数据。 关键词赤雷酸诱导的富含半胱氨酸蛋白;内源荧光;二硫键;变性 中图分类号:Q657.3文献标识码:A DOI:10.3964/j.issn.1000-0593{2010)02-0395-06 引 言 赤霉酸诱导的富含半胱氨酸蛋白(Gibberellin-induced cysteine-richprotein)是一类在植物生长发育[1_6]、抗菌[7-93、 抗氧化[1阳等过程中发挥重要作用的蛋白,它由N-端信号肽, 中问不同长度的亲水区域,及含有12个保守半胱氨酸的C. 端区域组成[I¨。在本文的前期工作中曾从藏医学和蒙医学 的蕈要药材手掌参(Gymnadniaconopsea)幼芽cDNA文库中 筛选到了该类基因gcgasa。通过与携带硫氧还蛋白(Thlore- doxin,Trx)基因的原核表达载体pET-32(a)构建重组质粒, 目标基因在大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中实现了水溶性、高 效表达,表达获得的融合蛋白称为TrX-GcGASA[12’13|。通过 分析融合蛋白的氨基酸序列(图1),发现Trx-C,_cGASA融合 蛋白由234个氨基酸组成,其中包括2个Trp(分别位于第 28和第31位)、7个Tyr(其中5个残基位于GcGASA区域) 和6个Phe残基(仅有1个位于GcGASA区域)。除上述芳香 类氨基酸残基外,融合蛋白中还含有14个半胱氨酸,其中2 个分布于融合伴侣中,其余12个位于GcGASA区域。在这 些半胱氨酸中存在CysXXCys和CysXCys序列分布(X为其 氨基酸残基),它们通常在体内具有氧化还原活性,那么在 体外原核表达获得的Trx-GcGASA融合蛋白中,这些半胱 氨酸残基的氧化或还原形式(即二硫键或巯基)对于蛋白内源 荧光究竟有什么影响呢?它们是否影响蛋白的变性过程呢? 围绕上述问题,在采用亲和层析、SDS-PAGE对融合蛋白进 行纯化、鉴定的基础上,运用稳态荧光光谱手段研究r融合 蛋白在U盯、氧化剂、盐酸胍存在下的内源荧光,并初步比 较了D,丌对于盐酸胍诱导的变性过程的影响,为深入研究 Trx-GcGASA的变性、复性动力学及结构等奠定了基础。 1实验部分 1.1仪器及试剂 蛋白质分离纯化采用AmershamBioseiences公司FPLC 快速蛋白纯化系统(AKTAExplorerl00),荧光光谱检测在 日立F-7000荧光光谱仪上进行。实验中DTT和GSSG分别 收稿日期:2009—08—10,修订日期:2009—11—16 基金项目:国家自然科学基金项目(30730065,20973034)和(973计划)项目(2007CB936103)资助 作者简介:张腾,1985年生,电子科技大学生命科学与技术学院硕士研究生e-mail:284708797@qq.colIl *通讯联系人 e-mail:fengjuan@uestc.edu.ca 万方数据 396 光谱学与光谱分析 第30卷 购自Generay有限公司(上海)和Ameresco公司(美国),纯分析纯。 度超过99.5%GdnHCI购自美国Sigma公司,其余试剂均为 厂一一勿掣聊眦?嬲删一TrxI‘l僦,E4iz^‘E石幢^cPB7翻栅刀掘刀’7z己正芦焉嬲{删4删厶5:脚 L6&z=三。{亿AGsGsGHMHHHH删ssGLvPRGsGMKETAAAl品RQHM DSPDLGTDDDDl(AMSYSQMASSQSAFCGEKCKVRCSKASDHDRCLRY-1 CGVCCNLCGCVPSGTYGNKDECPCYRD姗’GVGQRRRPKCP。Gc+ + · GAsA Fig.1DeducedsuninoacidsequenceofthefusionproteinTrx-GcGASA.ThioredoxinandGcGASAareindicatedbyitalicletters andboldletters,respectively.Trp,TyrandPhearelabelledbytriangle,asteriskandsquares,respectively 1.2融合蛋白的纯化、SDS-PAGE鉴定及处理 融合蛋白的诱导表达见参考文献Ll“。对于细胞破碎后 的I:清,首先通过Bradford法检测蛋白浓度,然后采用 FPLC快速蛋白纯化系统对目标融合蛋白进行纯化,分离柱 为HisTrap亲和层析柱,检测波长为280nm。操作时平衡缓 冲液为20mmol·L‘1Tris(pH7.4,含有300mmol·L“ NaCl和10mmol·L_1咪唑),淋洗缓冲液为20mmol·L_ Tris(pH7.4,含有300mmol·L-1NaCl和20mmol·L“ 咪唑),洗脱缓冲液为20mmol·L~Tris(pH7.4,含有300 mmol·L.1NaCI和500mmol·L-1咪唑)。手工收集流H{组 分,进一步采用SuperdexG25脱盐柱脱盐,流动相为20 mmol·I。叫磷酸缓冲液(PB,pH7.O),然后采用15%SDS- PAGE检测。 在获得足够纯度的样品后,通过Bradford方法检测蛋白 浓度约为2mg·mL1;然后采用20mmol·L_1PB缓冲液 稀释至浓度约10岫∞1.L_1左右。在氧化还原实验中,通过 将样晶与lmmol·L~DTT、0.5mmol·L_1GSSG和5 mmol·L~Hz02在室温下孵育50min分别获得还原型、氧 化型样品。在蛋白变性实验中,采用不同浓度盐酸胍与融合 蛋白在4℃下处理过夜的方法获得变性蛋白;对于变性还原 3000 2000 1000 O 的蛋白在处理过程中加入1mmol·L1D1丌共同孵育。 1.3吸收及荧光光谱检测 吸收光谱检测范围为190~400nnl,测量融合蛋白时卒 自对照为20mmol·L叫PB(pH7.o)。测馈荧光时蛋白样品 浓度控制在~10}tmol·L叫左右,入射和出射狭缝分别固定 为2.5和5am,扫描速度为240nlTl·rain~;此外,所有试 剂和样品均经过0.22肛m滤器过滤处理。 2实验结果与讨论 2.1 Trx-GeGASA融合蛋白的纯化 如图2(a)所示,当原核表达细胞破碎后的上清经过 Niz+.NTA亲和层析柱后,通过梯度洗脱在280lira对应的 流}{{曲线上除了穿透峰外(不能跟Ni2+结合的组分),还检测 到3个主要的流⋯组分A,B和C,它们的SD警PAGE结果 见图2(b)。从图巾町知,流分B和C中的蛋白经过SDS变 性及p巯基乙醇还原处理后,在分子量约27kD附近出现类 似的蛋白条带(图中箭头所JR)。此位置比预期融合蛋白分子 量(~25.5kD)偏高,这丰要是由于融合蛋白中His-Tag的 存在导致外源蛋白在SDS—PAGE电泳上分子量发生偏 20 疆) 4{}506‘l ElufionvohmnffmL Fig.2ElutionprofileofthesupernatantofTrx-GcGASAthroughNiz+-NTAaffinitycolumnand15%SDS-PAGEanalysisofthe collectedfractions.(a):11幢monitoringwavelengthWItSsetat280am.11他proteinwaselutedfromthecolumnwithaline- argradientfrom20mmol·L一1imidazoleto200mmol·L一1imidazolein20mmol·L一1Tris-HCIand500mmoI·L一1 N犯L(b):耵皓differentlanesare:1.Flowingthrough,2.ElutionA,3.EiutionB,4.EiutionC,M.stan"dardprotein marker.TI忙targetproteinWaSshownbyarrow f】《三刁。曩口-o∞qv 万方数据 第2期 光谱学与光谱分析 397 差[14]。鉴于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到样品C可能 是B的聚集体,}lj此本文中仪手.I:收集了样品B,并采用脱 盐柱进行了纯化(图未湿示)。 2.2不同激发波长下Trx-GcGASA融合蛋白的内源荧光 图3显示了Trx-GeGASA融合蛋白在pH7.0的磷酸缓 冲液中不同激发波长下的荧光发射谱。如图所尔,专激发波 长为260nIn时,体系中Phe,Tyr和Trp同时被激发,融合 蛋闩的最大荧光发射峰出现在305nrn左右,它与中性缓冲 体系中酪氨酸的荧光发射接近。同时,Trxq3cGASA在330 ~340nlTl范围内还有一个小显著的肩峰,它归属于色氨酸 的荧光发射。至于400~500nrn范嗣内出现的弱的宽峰主要 来源于酪氨酸磷光发射的贡献。在此激发波长下,虽然Phe 同时被激发,但由于存在Phe—Tyr的荧光共振能茸传递, 因此未检测到Phe的荧光发射。当激发波长红移至280和 285nrn时,体系中色氨酸和酪氨酸同时被激发,色氨酸的相 对荧光强度屁著增强。当激发波长进一步红移至290nln时, 体系中仪有色氨酸被激发,色氨酸的最大荧光发射峰_}{j现在 338.5nrn附近,这反映出色氨酸处于部分疏水的微环境中。 随着激发波长在290~300nrn范围变化,A一发生了微弱变 化(见图3插图),这与体系巾不同Trp残基处在不同的微环 境有关。 400 Wavelength/nm rag.3FIuoresceno[!emissionspectraofTrx-GcGASAin20 nnnol·L_1phosphatebuffer(pH7.0)uponexcita- tionat260ilia(Iine1)。270哪(Iine2),280nln (1ine3),285nln(Iine4),290mn(1ine5),292lml (Iine6),295nni(1ine7),298nnl(Iine8)and300 mn(Iine9),respectively 上述酪氨酸荧光发射占主导地位的现象在Trp和Tyr 共存的体系中鲜见报道。推测~方面是由于在原核表达获得 的融合蛋白Trx-GcGASA中,发射荧光的Tyr与Trp之间 的空间距离较远,不利于发生Tyr—Trp的荧光共振能最传 递;另一方面,融合蛋白中色氨酸的荧光可能受到诸多因素 影响『刚正蓐猝火。 2.3 IYIT对Trx-GcGASA融合蛋白内源荧光的影响 为了探讨I:述现象是否与该体系富含二硫键有关,可采 用1mmol·L-1明_r对蛋白样品进行了处理,发现当激发 波长为260或280nlTl时,伴随着二硫键的还原,酪氨酸在 305nln附近的荧光强度变化不大,但色氨基酸在~337咖 附近的荧光强度却湿著增加,最终导致两者的相对荧光强度 比值Rs7/F305约为1.8~1.9左右[见图4(a),4(b)和表1]。 究竟如何解释七述现象呢,经分析认为主要是由于色氨酸的 吲哚环与二硫键在空问}:靠近,因此其荧光容易被二硫键强 烈猝灭,这导致在氧化条件下色氨酸的荧光强度低于酪氨 酸;而伴随着二硫键被还原成巯基,色氨酸的荧光显著增强 变成优势地位。至于酪氨酸荧光强度变化不大的现象町能是 由于发射荧光的酪氨酸残基与二硫键距离较远所致。 当激发波长同定在295咖时,町观察到色氨酸的最大 荧光发射峰出现在342nlTI左右,它的位置几乎不随DTT处 理而改变,这表明融合蛋白中色氨酸所处的微环境在还原前 后变化不大。至于图4(c)中色氨酸荧光强度增加了约3.4倍 的现象主要是由于二硫键被还原所致。 2.4不同氧化剂对Trx-GcGASA融合蛋白内源荧光的影响 如图5(a)和5(b)所示,当融合蛋白经过0.5mmol·L.1 GSSG处理后,酪氨酸和色氨酸的荧光强度分别降低了约 19%和12%左右。与此类似,伴随着5mmol·L_过氧化氧 处理,融合蛋白中酪氨酸和色氨酸的荧光强度均有所降低, fn.降低程度儿乎一致(19%~2l%,见图5(c)和图5(d)。鉴 于氧化型谷胱甘肽G暇;和过氧化氧是常用的氧化剂,它们 在适当条件下均能氧化游离巯基形成二硫键,因此分析在融 合蛋白中可能存在部分游离筑基,它们在J:述氧化剂作用下 能被氧化成二硫键,进而导致酪氨酸和色氨酸的部分荧光被 猝火。 2.5盐酸胍对Trx-GeGASA融合蛋白内源荧光的影响 图6(a)显示了290nlTl激发下融合蛋白的内源荧光随盐 酸胍浓度的变化。从图巾可知,当盐酸胍浓度<2mol·L1 时,.=I。。位于338nlTl附近;当盐酸胍浓度从2tool·L1变化 至3mol·L_1时,A。。从338nna.突变至346nIn左右;随着 盐酸胍浓度进一步增加至6mol·L一,色氨酸的最大荧光发 射峰位置无显著变化。这表明盐酸胍能够诱导融合蛋白变 性,导致色氨酸从部分疏水的微环境暴露于更加亲水的表 面,但由于A一<350mn,因此蛋白质并未彻底变性。为了 验证此现象是否与体系富含二硫键有关,则将样品采用 聊阿和GdnHCI同时处理,获得-r类似结果[见图6(b)],这 说明二硫键的还原对于融合蛋白的稳定性没有显著影响,由 此初步推断融合蛋白的结构紧密,不易受变性剂进攻。 在此基础I:,可选择了346.2nlTl作为检测波长,研究 了其荧光强度随盐酸胍浓度的变化,获得图6(c)所爪的去折 叠平衡曲线。对于融合蛋白Trx-GcGASA,当盐酸胍浓度低 于2tool·L。时,色氨酸在346.2啪处的荧光强度几乎不 变;当盐酸胍浓度增加至2"--3tool·I。_1之问时,荧光强度 发生突变,这主要足由于各种荧光猝灭因素被削弱或远离所 致;当盐酸胍浓度进一步增加时,荧光强度变化不最著。上 述变化规律与“两态模型”基本相符,由此可初略计算f{{该蛋 白变性的AG=3.7kJ·tool。对于还原型蛋白,其变化趋 势与氧化型截然不同。当盐酸胍浓度低于ltool·L叫时,随 着盐酸胍浓度增加,色氨酸荧光强度屁著增加;当盐酸胍浓 度继续增加至3tool·L_1时,荧光强度出现降低的趋势;此 Ⅺ Ⅺ 砌 砷 0 8 6 4 2净Is二o—曩。兰o%是onl叵 万方数据 398 光谱学与光谱分析 第30卷 0 300 O 500 300 0 400 500 3,50 400 4,50 5∞ Wavelength/rim Fig.4FluorescenceemissionspectraofTrx-GcGASAin20mmoi·L~phosphatebuffer(pH7.O)intheal翻珊∞ofDTr(solid line)andinthepresenceofflit(dottedline)withtheexcitationwavelengthof260nln(a),280mn(b)and295nnl(b), respectively O loo 0 3()o 400 500 400 ) 0 100 O 500 300 400 500 400 f.煳 Wavelength/nm №5 Effectsof0.5mmol·L-1GSSGand5mmol·L。1peroxideontheintrinsicfluorescenceoffusionprotein Trx-GcGASAwiththeexcitationwavelengthof260mn((a)and(c))and295mn((b)and(d)) 3of)0 2000 0 2 4 6 0 2 4 6 Wavelength/rim 【GdnHC!l 【GdnHCI】 Fig.6VariousconcentraionGdnHCI-inducedchangesofAⅢ(a)andchangesoffluorescenceintensityat 346.2砌(b)uponexcitationat290hill.Inpanel(c),theexcitationwavlengthwas260nm 咖 啪 j毒窘昌3葛∞uuau∞岂oIIL!I 咖 枷 渤 鼻若N.兽_8葛富占眉∞u—霉。嚼a|oj臣 蛳 枷 童晷晷al∞l鲁暑∞嚣旨o。譬zu2鲁掌口、Il暑lI!u品= TI—I,扫一毋葛口量∞u岳。墅0nT■ 万方数据 第2期 光谱学与光谱分析 399 后变化规律与氧化璎类似。 在上述变性过程中,还观察到当激发波长为260和280 nlTl时,伴随着6tool·L.1盐酸胍处理融合蛋白,色氨酸和 酪氨酸的相对荧光强度发生了变化(见图7和表1),其中色 l5∞ O O 氨酸荧光增强的原因同E。至于酪氨酸荧光的增强主要是由 于蛋白变性后,肽链伸展,芳香类氨基酸残基之间的距离增 加,Tyr---Trp的荧光共振能鼍传递效率下降所致Ⅲ]。 0 300 400 500 300 400 500 350 400 4,50 500 Wavelength/nm Fig.7FluorescenceemissionspectrllofTrx-GcGASAin20mmol·L-1phosphatebuffer(pH7.0)intheabsenceof6mol·r1 GdnHCIandlmmoi·L_1DTY(solidIine),inthepresenceof6mol·L一1GdnHClwithoutlmmoi·L_1fliT(dotted Iine)andinthepresenceofboth6moi·L_1GdnltCland1mmoi·L一1DTr(dashedline)withtheexcitationwavelength of260nnl(a),280nm(b)and295nnl(c),respectively Table1 Rehtj:veratiooffluorescenceintensityatkforTrpand305RillforTyr,i.e.‰/F粥.Inthe 嘲eofaandb,Trphadthemsxinlumfluorescenceemissionwavelengthat337.2or342.2nnl 3结论 本文运用稳态荧光光谱学方法研究了富含半胱氨酸的 Trx-GcGASA融合蛋白的内源荧光及其影响因素,发现在经 过宿主菌EcoliBL21(DE3)原核表达、纯化的Trx-GcGASA 中蛋白质的内源荧光以305nin对应的酪氨酸的荧光发射为 主f伴随着二硫键的还原、蛋白质的变性、还原,色氨酸和 酪氨酸的相对荧光强度发生了改变;此外,通过检测氧化剂 对融合蛋白内源荧光的影响,推测融合蛋白中存在游离巯 基,这与宿主菌EcoliBL21(DE3)的胞质窄间含有大量硫氧 还蛋白还原酶有关。同时,Hz02与Trx-GcGASA在体外的 反应也为解释该类蛋白的抗氧化机理提供了一些初步的数 据。此外,通过研究盐酸胍诱导的变性过程,获得了一些初 步结果,为后续深入研究去折叠、重折叠热力学、动力学等 奠定了基础。 参 考 文 献 HerzogM,DomeAM,GrelletF.PlantM01.Bi01.,1995,27:743. 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KeyworflsGibberellin-indueedcysteine—richprotein;Intrinsicfluorescence;Disulphidebonds;Denaturation *Correspondingauthor (ReceivedAug.10,2009;acceptedNov.16,2009) 万方数据
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