傅里叶显微红外研究C末端酸性蛋白对α硫素原核表达过程的影响

第29卷，第12期 2009年12月 光谱学与光谱分析 SpectroscopyandSpectralAnalysis V01．29，No．12。pp3267—3270 December，2009 傅里叶显微红外研究C一末端酸性蛋白对口一硫素原核达过程的影响 刘 艳1，冯 娟h，陶栋梁3，翁诗甫3，任正隆1’2。 1．电子科技大学生命科学与技术学院，四川成都610054 2．四川农业大学植物遗传育种省级蓖点实验室，四川雅安，625014 3．北京大学化学与分子工程学院，北京 100871 摘要采用傅里叶变换显微红外手段研究了在信号肽缺失的情况下，c．末端酸性蛋白的存在对小麦口-硫 素原核表达过程中蛋白质二级结构的影响。SDS-PAGE表明带有酸性蛋白(Sc样品)的重组质粒在大肠杆菌 BL21(DES)中以包涵体形式高效表达；而酸性蛋白缺失(S样品)可以极大提高外源蛋白的可溶性。通过对含 有s及Sc的全细胞在诱导前及诱导后2h的酰胺I带区域图谱求筹谱及二阶导数谱，发现诱导前在1630 ClTI1处吸收较弱，而在诱导2h左右，在1630cInl处检测到明显的吸收峰，该位置的吸收主要来自于聚集 体的贡献。进一步对酰胺I带厌域进行傅里叶去卷积处理，结合高斯曲线拟合，发现在sc样品中随着诱导 时间的增加，聚集体含龋逐渐增加，这与SD§PAGE结果一致。此外，伴随着聚集体的形成，口-螺旋的含量 逐渐增加；而伊折叠和无规卷曲的含量却逐渐减少。在S样品中观察到兄规卷曲的含最随诱导时I’日j的增加 逐渐提高，而p_转角及(1629±1)crfl_1处对应的p折叠的含量却逐渐减少。上述现象表明：c．末端酸性蛋白 的引入导致表达过程中p折叠和无规卷曲逐渐向聚集体和旷螺旋转化。 关键词显微红外；C-末端酸性蛋白；口-硫素；原核表达；二级结构 中图分类号：Q657．3文献码：A DOI：i0．3964／j．issn．1000-0593(2009)12—3267—04 引 言 口-硫素足一类富含半胱氨酸的碱性多肽，具有抗细菌、 抗真菌、抑制哺乳动物细胞牛长等功能[1。4]。大量研究表明： 编码口-硫素的基因的mRNA序列由N-末端信号肽，中间成 熟肽及(、_末端的酸性蛋白组成，其中N_末端信号肽会在翻 译过程被切割掉，而C_末端酸性蛋白会在翻译之后被切割 掉『5j。为什么天然的体系会存在这样一个过程?而D末端酸 性蛋白的存在究竟会对其结构及功能产生什么影响呢?鉴于 原核表达体系中不存在切割相关的酶，因此首先选择了原核 体系，在信号肽缺失的情况下，分别对携带及不携带C-末端 酸性蛋白的外源基网进行r表达(相应的蛋白分别命名为sc 及s)，结果发现前者主要以包涵体形式存在；而后者主要以 可溶的形式表达。 近年来对原核表达过程中包涌体的研究常采用红外、拉 曼光谱等手段，通过相关研究发现包涵体巾保留r部分天然 蛋白的二级结构旧⋯。鉴于红外光谱技术可以结合傅里叶去 卷积、二阶导数等数据处理手段，对蛋白质二级结构进行定 量分析，因此在本文中运用了傅里叶一显微红外手段对表达 过程中蛋白的结构进行检测，并获得了一些初步结果。 1实验部分 1．1仪器 NieoletiNl0MX傅里叶变换红外光谱仪。 1．2驴硫素蛋白的原核表达 采用pET-32(a)作为原核表达载体，EcoliBL2l(DE3) 为宿主菌，携带(’-末端及【>末端缺失的重组质粒在180 rpm，37℃条件下振荡培养。当OIA。。达到0．6～o．8时，加 人终浓度为1mmol·L_1的IPTG进行诱导表达，获得的融 合蛋白分别称为Sc及S。在诱导前及诱导后1，2，4和6h 取1“。菌液，室温离心(13000gX2min)收集伞细胞，4℃ 保存待用。诱导6h后离心收集大量诱导表达菌液(4℃，4 860g，30min)，PBS洗涤3次(4℃，4860g，20rain)，重悬 于裂解缓冲液(10mmol·L～Tris，300mmol-L～NaCI， 10mmol·L_1咪唑)，冰水浴超声破碎(功率300W，工作5 收稿日期：2008—11—30。修订日期：2009—03—02 基金项目：国家自然科学基金重点项日(30730065)和电子科技大学青年基金重点项目(L08010901JX0677)资助 作者简介：刘艳，女-1984年生。电子科技大学生命科学与技术学院硕士研究生e-mail：liuyan841107(园yahoo．COIThCn *通讯联系人 e-mail：fengjuan@uestmedu．cn；renzl@nestmedu．cn 万方数据 3268 光谱学与光谱分析 第29卷 S，间歇5S，90个循环)，在4℃，13000rpm条件下离心20 min，得到卜清液和沉淀。分别取全细胞、上清和沉淀进行 SD§PAGE检测。 I．3样品的制备 取微量样品置于干净的载玻片上，放人恒温干燥箱中烘 干，干燥后压片至适当厚度，置于傅里叶变换红外光谱仪上 进行检测。 1．4红外光谱检测及数据分析 红外光谱在NicoletiNl0MX傅里叶变换红外光谱仪上 测定，红外榆测光栏为100pm×100“m，使用液氮冷却的 MCT检测器。波谱范围650～4000cTn一，分辨率为4 cm，经过128次扫描获得原始红外光谱。以相同条件下测 得的背景红外光谱作为差谱，差减保证在2000l700咖_1 范围内无特征吸收峰。 采用仪器自备软件Omnic5．0软件对差谱在酰胺I带 (1600～1700cm叫)区域进行5点平滑，获得二阶导数谱， 并控制去卷积参数：半峰宽(Bandwidth：25)和增强因子 (Enhancementfactor：3．0)，获得傅里叶去卷积谱。对傅里 叶去卷积谱进行基线校正后，根据各子峰的峰位，采用Ori— gin6．0软件对图谱进行高斯曲线拟合，各种二级结构的相对 含量由最终拟合得到的酰胺I带的各子峰面积计算得出。 2实验结果与讨论 2．1原核表达结果 图l娘示了含有霞组质粒S和sc的工程菌在诱导前、 不同诱导时间下的全细胞、及破碎后的上清、沉淀的SDS- PAGE结果。从图中可知，伴随着G末端的缺失，外源蛋白 主要以可溶形式表达[图1(a)]；而携带C-未端的蛋白主要 以包涵体形式存在[图l(b)]。 (a) (b) tie．．1 SDS-PAGEresultsoftheintactcellsandsupernatantof SandScobtainedwiththeinductionof1mmol·L一1 IIVFG．Samplesweretakenat0h(1ane1)，1h(1ane 2)，2h(1ane3)，4h(1ane4)，6h(1ane5)afterinduc- tion．Thesupernatantandpelletwereshowninlane6 andIane7．M：Proteinmarker 2．2全细胞的FFIR谱 图2分别给l叶{了含有S及Sc的全细胞在诱导2h的FT— IR原始谱图。各峰的门属见表1。通过比较，发现两者在 1000～i300cm_1范围内光谱差异较显著，其中Sc样品中 1073和l244cml处两峰的强度比值明湿高于s样品。该区 域的变化可能与核酸骨架巾磷酸二酯键的反对称伸缩振动有 关㈨。 2 0 4000 30(1f) 2000 1000 Waventmtber／cm—I 脚2FrlRSpectmofintactcellcontainingSand Scdetectedat2hafterinduction Table1 Peakpositionsandtheirassignments fortheintactceiIs 红外吸收峰 频率／cm 1 归属 3283 v卜H 2960，2925 vc_H l657 酰胺I带 1536 酰胺Ⅱ带 1404 酰胺Ⅱ带 1244 酰胺Ⅲ带，细胞膜磷脂、核酸中磷酸_二酯基团 】073 ¨rm ≯0．6 l 04 墨。．z 。 l 。 ￡ ‰ ∽．f 小 小 ∽|| ∥ ≮ I680 l640 l惴m l㈣ 1640 1600 Wavpn¨n1I×·r^·nl Fig．3originalspectra[(a)and(d)]，differencespectra [(b)and(e)]obtainedbysubtractionbetweenScand S，aswelIassecondderivativespectraL(c)and(f)] ofdifferencespectrainthecaseof0hr[(a)，(b)and (c)]and2hafterinduction[(d)，(e)and(f)]．In panel(a)and(d)，thespectrumofSandScisrep— rensentativeofboldIineandbrokenIine。respectively 【 oo磊q10sqv 岛 4 卫 O蚺 H 陀 O 8§鲁osq《 e__薹￡‘I《 是=-参￡oc l'￡oo是。苦零C童_cCCoon 万方数据 第12期 光谱学与光谱分析 3269 2．3 AmideI区域聚集体的吸收位置 图3显示了诱导的及诱导后2h的差谱以及由差谱得到 的二阶导数谱。从图卜可知，诱导前在～1630era-1处吸收 较弱，而在诱导2h左右，在～1630elTI-1处检测到明显的 吸收峰。参考相关文献町知，该位置的吸收主要来自于聚集 体的贡献L6’7]。 2．4在诱导表达过程中蛋白二级结构的变化 酰胺I带的宽峰是由口_螺旋、p折霍及兄规卷曲等振动 吸收峰重叠而成。为J，解析fl{各子峰的位置并确定它们的相 对含量，首先对原始谱图进行了傅里叶去卷积处理，并进一 步对各子峰进行了高斯拟合，结果见图4和表2。 Wavenumber／era一1 Fig．4GaussianfittingonthedeconvolvedspectraofSc(upper)andS (below)inAmideI regionat1，2，4and6hafterinduction Table2 Chan孵ofrelativecontenbofsecondarystructurecomponentsin intactcellcontainingSandScundervariousinductiontinle 根据文献报道Ll⋯，AmideI区域各子峰的归属如下： 1603，1611，1619，1663，l671elTI。1峰为伊折卺结构； 1638，1681，1687，1695锄。1峰为伊转角结构；l648 咖。1峰为正规卷曲结构；(1656士1)ClTI_1峰为旷螺旋结构。 至于(1629士1)cm‘1蜂的归属，通常它属于p折卺，彳日根据 sD孓PAGE和图3结果，将Sc在该位置ffj现的吸收峰主要 归属为聚集体和伊折叠的共同贡献。通过高斯拟合发现：(1) 随着诱导时间延长，sc中口_螺旋的相对含量逐渐增加，同 时，(1629士1)ClTI_1处对应结构的相对含量也逐渐增加；而 伊折叠、无规卷曲的含量却呈现下降的趋势；(2)在含有S的 全细胞中，无规卷曲的含量随诱导时间的增加逐渐提高，而 p转角及(1629土1)era-1处对应的p折叠的含量却逐渐减 少。至于旷螺旋、p折叠的变化则较复杂。 3讨论 根据X射线晶体学、核磁结果可知：旷硫素的结构是由 2个口一螺旋、1个反平行的伊折叠和几个转角组成f11’”]，因 此C_末端酸性蛋白引入导致聚集体形成的Ⅲ时，各种二级结 构足否受到影响呢?首先，如前所述，在酰胺I带区域 (1629土1)cm叫处『司时存在聚集体和p折裢的贡献。在含有 S的全细胞表达过程中，该处对应的伊折叠含量随诱导时间 增加而减少，但在sc样品中观察到相反的现象。由此呵推断 在sc中虽然有p折叠的干扰，但聚集体含繁肇现逐渐增加 的趋势，这与SDS-PAGE检测结果基本一致。其次，通过比 较表2中的数据，发现在sc中旷螺旋、p折叠、p转角及无 8l_≈^=t)so《 Sl_葛￡C∞口《 万方数据 3270 光谱学与光谱分析 第29卷 规卷曲的变化趋势均与S样品中相反，因此这蝗变化应该都 与聚集体形成有关。此外，在Sc样晶中根据不同组分相对含 量随诱导时间的变化叮初步推测无规卷曲会向扩螺旋转化； [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] E10] [11] 112] 而聚集体主要来自予伊折叠。详细机理尚待深入研究。相关 工作为深入研究G末端对旷硫索的结构及功能研究奠定r 初步基础。 参 考 文 献 CastroMS，FontesW．ProteinandPeptideLetters，2005，12(1)：11． FlorackDE，StiekemaWJ．PlantM01．Bi01．，1994，26：25． I。lanosP，HenriquezM，MinicJ，etaLFEBSJ．，2006，273(8)：1710． AlejandraOZ，HeberI，A，EduardoSC，eta1．VeterinaryMicrobiology，2008，127(3—4)：425． RomeroA。AIamilloJM，Garda-OlmedoF．EuropeanJournalofBiochemistry，1997，243(1-2)：202． AmiD，NatalelloA，TaylorG，eta1．BiochirmBiophys．Acta，2006，1764(4)：793． AmiD，NatalelloA，Gatti—LafraneoniP，eta1．FEBSLett．，2005，579(16)：3433． DogliaSM，AmiD，NatalelloA，eta1．Bioteehn01．J．，2008，3(2)：193． PrzybycienTM，DunnJP，ValaxP，eta1．ProteinEng．，1994，7(1)：131． 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PAGEanalysisrevealedthatthepresenceofacidicproteingaverisetotheformationofinclusionbody，however，theabsenceof acidicproteingreatlyenhancedthesolubilityoftheheterogenousproteinexpressedinE．coliBL21(DE3)withtheinductionof1 ITlIno卜L_1Imat37℃．Differeneespectrainamide1regionwereobtainedbysubtractionbetweenthespectraofintactcells containingSandSc，whichcorrespondstotheabsenceandpresenceofC-terminalacidicproteins，respectively．Thesecondde— rivativeofthedifferencespectrameasured2hafterinductionshowedoneprincipalcomponentat～1630cIn～，whilenosignifi— cantpeakappearedatthesamepeakpositionwhenthespectrabeforeinductionwerecompared．CombinedwithSD导PAGEof recombinantprotein，theauthorspresumedthatthepeakabsorptionat～l630咖一1ismostlikeytobeassignedtoproteinag— gregatewithininclusionbody．Gaussiancurve-fittingwasdoneontheFourierself-deeonvolutionspectrawithinamidelregionof intactcellscontainingSandSc．Theexperimentaldatarevealedthattherelativecontentofaggregateabsorptionat(1629士1) cm～graduallyincreasedwithinductiontime，whichisconsistentwiththeresultsofSD§PAGESimutaneously，theformation ofaggregategaverisetotheincreaseof旷helix，aswellasthedecreaseof争turnandrandomcoilinthecaseofSC．Itwasnotthe caseforS，however，whererandomcoilexperiencedtheincreaseintherelativeaveragefractions，while伊turnand伊sheetat (1629士1)cTn叫behavedindifferentways．Theabovementionedphenomenonindicatedthat伊sheetandrandomcoilaremost likelytotransforrnintoaggregateanda-helixwiththeintroductionofC-terminalacidicprotein． KeywordsFTIRmicrospectmscopy；C-terminalacidicprotein；a-thionin；Prokaryoticexpression；Secondarystructure *Correspondingauthor (ReceivedNov．30，2008；acceptedMar．2，2009) 万方数据