不同酸碱条件下光合细菌的生长产氢特性

应用与环境生物学报 2011，17 ( 2 ): 251~255 Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X 2011-04-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2011.00251 进入 21世纪以来，开发利用清洁的可再 生能源成为当 今科学研究的热点. 在多种可再 生能源中氢能因燃烧 值高 且燃烧产物为水，被认为是“最有前景的清洁能源”[1~2]；而 在多种制氢方法中，光合细菌产氢具 有底物转化效率高、 能广泛使用生物质作为生长和产氢的底物、吸收光谱范围广 （400~950 nm）、光能转化效率高、无污染、能耗低、操作简 单等优点[3~4]，因此其产氢特性受到许多学者的关注. 在光合细菌的产氢过程中，pH值是影响细菌生长和繁 殖的一个重要因素. 不同酸碱条件下碳源底物在光合细菌细 胞内的代谢途径会发生改变，而且还会造成碳源底物代谢 生成的有机酸以不同形态（分子态或离子态）存在，从而形 成不同程度的产物抑制效应 [5~6]. 此外，光合细菌代谢产氢时 机体内发生的生物化学反应均是酶 促反应，而酶 促反应都 有一个最合适的pH值范围. pH值的改变将直接改变底物分 子和酶分子的带电状态，从而影响酶与底物的结合能力，影 响碳源底物的跨膜传输[7]；而且pH值过高或过低对光合膜上 色素–蛋白复合物的结构稳定性及功能的发挥都有重要影 响 [8]，进而影响光合磷酸化合成ATP，限制光合细菌产氢过 程的进行 [9]. 可见，光合细菌的生长繁殖及产氢都要有合适 的pH值范围. 目前，Samir等通过研究反应器的产氢量、pH值 和代谢产物浓度等了pH值和中间代谢产物对微生 物制氢的影响 [10]，同时魏丽芳等以实验与理论相结合的方法 研究了pH值对光合细菌利用乙酸钠产氢的影响 [11]，由此可知 对酸碱条件下光合细菌制氢的研究主要集中于光合细菌产 氢工艺和产氢动力学等方面[7~8, 10~11]，酸碱条件对光合细菌产 不同酸碱条件下光合细菌的生长产氢特性* 谢学旺 朱 恂** 王永忠 廖 强 田 鑫 贾 诚 （重庆大学热物理研究所 重庆 400030） Effect of Substrate pH Value on Hydrogen Production by Photosynthetic Bacteria* XIE Xuewang, ZHU Xun**, WANG Yongzhong, LIAO Qiang, TIAN Xin & JIA Cheng (Institute of Engineering Thermophysics, Chongqing University, Chongqing 400030, China) Abstract For exploring the hydrogen production mechanism of photosynthetic bacteria, hydrogen production by the purple non-sulfur phototrophic bacterium Rhodoseudomonas palustris CQK-01 illuminated by light-emitting diodes with light wavelength of 470 nm was experimentally investigated in batch culture mode under anaerobic conditions, and the effect of initial substrate pH value on hydrogen production performance and energy conversion effi ciencies were discussed. Glucose with concentration of 75 mmol/L was used as carbon source in medium, and the initial substrate pH values were set at 5.5, 6.0, 7.0, 8.0 and 9.0. The light intensity was set at 1 000 lx and operation temperature was 30 ℃. The experimental results showed that the weak alkaline condition was favorable for the growth of photosynthetic bacteria, and after 96 hours’ operation for hydrogen production, the total hydrogen production and the maximum hydrogen production rate was 8.0 mmol and 3.39 mmol g-1(cell dry weight) h-1 at the optimal pH 7.0, respectively. The produced hydrogen purity was 70%, and the substrate energy conversion effi ciency and light energy conversion effi ciency were 1.98% and 7.7%, respectively. It was also found that the substrate energy conversion effi ciency, light energy conversion effi ciency, hydrogen production and hydrogen production rate were higher in acidic substrate than in alkaline substrate, while the hydrogen purity increased with the increase of initial substrate pH value. Fig 6, Ref 18 Keywords photosynthetic bacteria; Rhodoseudomonas palustris; pH value; hydrogen production; substrate energy conversion effi ciency; light energy conversion effi ciency CLC Q936 : TK91 摘 要 为了解光合细菌的产氢机理，对沼泽红假单胞光合产氢菌CQK-01在光生物平板反应器中进行序批次培养， 以470 nm LED灯提供连续光照，葡萄糖为碳源底物，研究不同初始酸碱条件下产氢光合细菌的生长特性、产氢特性 以及能量转化效率. 结果明，在弱碱性条件下最适宜产氢光合细菌的生长；在反应液为酸性条件下，光合细菌具有 较高的产氢量、产氢速率和能量转化效率，然而产氢纯度随着初始pH值的增大而升高；在温度30 ℃、光照强度1 000 lx、底物浓度75 mmol/L的实验条件下，光合细菌的最佳产氢pH值为7.0，实验中最大累积产氢量为8.0 mmol，最大产 氢速率为3.39 mmol g-1(cell dry weight) h-1，产氢纯度高达70%，底物能量转化效率最大为1.98%，光能转化效率最大为 7.7%. 图6 参18 关键词 光合细菌；Rhodoseudomonas palustris；pH值；产氢；底物能量转化效率；光能转化效率 CLC Q936 : TK91 收稿日期：2010-04-24 接受日期：2010-06-12 *国家杰出青 年基 金项目（No. 50825602）和国家自然 科 学基 金项目 （Nos. 90510020，20876183）资助 Supported by the National Outstanding Youth Foundation of China (No. 50825602), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 90510020, 20876183) **通讯作者 Corresponding author (E-mail: zhuxun@cqu.edu.cn) 252 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 氢机理的影响也主要集中于微观尺度上捕光色素蛋白和产 氢酶的作用机制 [9, 12]，而从光合细菌产氢机理出发，分析序 批次培养不同初始酸碱条件下光合细菌的生长产氢特性以 及能量转化效率却报道较少. 因此，本实验以沼泽红假单胞菌CQK-01为菌种，以葡萄 糖作为碳源底物，采用平板式光生物反应器和序批次培养方 式，研究不同酸碱条件下光合细菌的生长和产氢特性，计算 分析光合细菌的产氢纯度以及对底物能量和光能量的转化 效率，以期为探究光合细菌的产氢机理和提高光生物产氢性 能提供依据. 1 材料与方法 1.1 实验装置 光生物制氢反应器系统如图1所示，其中反应器是由8 mm厚透明有机玻璃板加工而成（长×宽×高= 100 mm × 50 mm × 100 mm），总容积500 mL，其中反应液体积300 mL，上 部200 mL为气体充盈空间. 在反应器顶部左右各开有充、排 气孔及气体取样孔，在反应器左下部设有一个取样孔和排液 孔 . 在反应器侧面及上下面均贴有锡箔以减少光散射影响. 实验前对系统进行气密性检查，并对反应器系统进行彻底消 毒. 1.2 菌种和培养基 实验菌 种是从污水沟淤泥中筛选、纯化、鉴定的沼泽 红假单胞菌CQK-01（Rhodopseudomonas palustris）. 培养基 采用葡萄糖作为碳源底物，其他营养成分含量（ρ/g L-1）为： K2HPO4·3H2O，1.006 0；ZnSO4·7H2O，0.001 0；CaCl2，0.010 0；FeSO4·7H2O，0.041 7；KH2PO4，0.554 0；NaCl，0.200 0； MgSO4·7H2O，0.200 0；谷氨酸钠，0.500 0；尿素，1.677 0；酵 母膏，1.000 0；生长因子溶液1 mL/L. 所使用试剂均为分析 纯，用水为去离子水. 1.3 操作方式 按反应液体积30%的接种量离心90 mL培养至对数生长 期的菌悬液，与300 mL灭菌冷却后的培养基混合，然后加入 到已消毒的反应器中，充入氩气驱替反应器中空气达到厌氧 条件. 反应器排气孔与倒置锥形瓶相连，采用倒置排水法收 集气体. 将反应系统置于恒温恒湿培养箱中，光源为外置式 LED单色光源单侧照射，实验中葡萄糖浓度为75 mmol/L，光 源为470 nm LED灯，光照强度1 000 lx，环境温度30 ℃，通过 0.1 mol/L HCl和NaOH溶液调节pH值并用酸度计（Ecoscan- pH6型pH酸度计，新加坡）测量，反应液初始pH值分别调至 5.5、6.0、7.0、8.0和9.0. 接种10 h后开始取样检测，每次检测后 需要重新充入氩气. 操作方式为序批式，每批次操作培养时 间为96 h. 1.4 检测方法 葡萄糖浓度采用气相色谱法检测（SC-3000，重庆川仪 九厂），其技术参数为：采用FID检测器检测，色谱柱为PEG- 20M交联石英毛细管拄，规格为20 m × 0.25 mm；载气为氮 气，流速7.0 mL/min；柱箱温度为210 ℃，检测器和气化室温 度均为270 ℃. H2和CO2浓度的测量采用装有TCD检测器的气相色谱 仪（SC-2000，重庆川仪九厂），其技术参数为：色谱柱填料 为苯乙烯高分子多孔小球，柱长2 m，载气为氩气，流量为25 mL/min，电流80 mA，柱箱温度55 ℃，气化室和检测室温度 各为100 ℃，通过H2和CO2的标准曲线换算光合细菌在一定 时间内的产气量. 细 菌干重 的 测 量 采用 分 光 光 度 法 . 通 过 分 光 光 度 计 （756MC紫外可见分光光度计，上海精科）直接测量菌悬液 D600 nm值，根据测量的D600 nm值，对照D600 nm值对应菌体干重的 标准曲线计算而得. 1.5 测量误差分析 pH值测量的最大相对偏差为±3.4%，葡萄糖浓度测量的 最大相对偏差为±5.2%，生物量干重测量的最大相对偏差为 ±7.1%，氢气含量检测的最大相对偏差为±3.6%，CO2含量检 测的最大相对偏差为±5.8%. 2 结果与分析 2.1 酸碱条件对光合细菌生长特性的影响 厌氧光发酵系统的酸碱性受光合细菌代谢和产氢过程 所控制，反应液中pH值是气、液相间的CO2平衡、液相内的酸 碱平衡共同作用的结果. 在光合细菌产氢过程中，葡萄糖代 谢生成的有机酸会使反应液pH值下降；而在产氢酶作用下 光合细菌消耗反应液中的氢离子，又会引起反应液pH值的升 高. 产氢光合细菌生长过程中反应液pH值的变化如图2所示. 由图可知，在反应液初始pH值为5.5、6.0、7.0时，光合细菌接 种10 h之内pH值都有小幅上升，且初始pH值越低上升幅度越 大；在反应液初始pH值为8.0和9.0时，反应液pH值却呈下降 的趋势. 可见光合细菌细胞液pH值呈弱碱性，在反应液初始 图1 光生物制氢反应系统示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the photo-biological hydrogen production reaction system 图2 反应液pH值随时间的变化 Fig. 2 Time course of pH value of suspension 2532 期 谢学旺等：不同酸碱条件下光合细菌的生长产氢特性 pH值不利于菌体生长时，光合细菌通过自身的代谢机制调节 反应液中的H+浓度升高或降低，从而使反应液pH值达到适 宜的生长条件. 随着光合细菌产氢过程的进行，光合细菌代 谢有机底物生成的大量有机酸在反应液中累积，导致反应液 pH值随着反应的进行而不断降低，从而增大细胞膜内外的 质子动力势，促进光合磷酸化合成ATP，提高光合细菌的产 氢速率，然而强酸性条件又会抑制光合细菌胞内酶的活性， 进而影响光合细菌的生长代谢[13]. 不同酸碱条件下光合细菌的生物量变化曲线如图3所示. 在反应液初始pH值为8.0和9.0的碱性条件下，光合细菌长期 处于适应期且生长不断波动，在接种60 h左右后光合细菌才 有缓慢的生长，生物量很低. 在反应液初始pH值为5.5、6.0和 7.0时，光合细菌生长较好，在接种36 h时进入对数生长期，生 物量最高达到0.4 g/L左右. 但是光合细菌产氢量并不与生物 量成正比，产氢高峰期一般发生在光合细菌的对数生长期. 主要因为在对数生长期，光合细菌的代谢旺盛，胞内酶的活 性最高，既有充足的底物促进光合细菌的生长，又利于提高 光合细菌的产氢速率. 当光合细菌进入生长稳定期时，反应 液中的底物被逐渐消耗，低浓度的底物已不能维持光合细菌 的生长繁殖，而且碳源代谢生成的大量有机酸对光合细菌的 生长代谢产生抑制作用[7, 11]. 2.2 酸碱条件对光合细菌产氢性能的影响 2.2.1 酸碱条件对产氢特性的影响 实验中分别累计了不同酸 碱条件下各时段产氢量，得到相应pH值参数条件下光合细 菌在96 h内的总产氢量（图4-a），结合各时段的生物量可计 算得到实验时间内的最大产氢速率（图4-b）. 不同初始pH值 对光合细菌的累积产氢量和最大产氢速率影响显著. 在初始 pH值为5.5~9.0的实验中，光合细菌的总累积产氢量和最大产 氢速率的变化趋势一致，随着初始pH值 从酸性向碱性的变 化过程中，光合细菌总累积产氢量及最大产氢速率呈先缓 慢增加，然后又急剧下降的趋势. 因为初始pH值在8.0~9.0范 围内不适合反应体系中产氢光合细菌的生长繁殖，在实验时 间内光合细菌产氢时间短暂，产氢速率较小，累积产氢量较 低，因此由图4-a和图4-b可知，反应液最佳初始pH值为7.0， 此时光合细菌累积产氢量最大为8.0 mmol，最大产氢速率为 3.39 mmol g-1(cell dry weight) h-1，明显高于文献[14]中光合细 菌Rhodobacter sphaeroides O.U.001在相同时间内的最大累计 产氢量6.25 mmol. 结合图3和图4-b分析可知，虽然光合细菌在酸性条件 下也能够较好生长，但是最大产氢速率低于初始pH值为7.0 时；而强碱性条件既不利于光合细菌生长也不利于产氢，最 大产氢速率仅为初始pH=7.0时的1/3. 主要因为在中酸性条件 下，光合细菌细胞内外质子动力势较大，从而有利于促进碳 源底物的跨膜传输和光合磷酸化过程，促进光合细菌的生长 代谢和产氢. 同时在中性条件下光合细菌细胞内产氢酶的活 性最大，因此初始pH值为7.0时光合细菌能够达到最大产氢 速率和最大产氢量. 2.2.2 酸碱条件对产氢纯度的影响 光合细菌降解有机物产 氢的同时也生成CO2，收集到的H2、CO2混合气体可以通过氢 氧化钠溶液吸收，从而得到清洁纯净的H2. 光合细菌的产氢 纯度如图4-c所示. 随着反应液初始pH值的增大，产氢纯度会 迅速升高，在反应液pH=7.0时光合细菌的产氢纯度为70%， 而菌株Clostridium sp.在相同碳源底物、相同浓度下的最大产 氢纯度仅为60% [15]. 继续增大初始pH值，光合细菌的产氢纯 度增长趋于平缓. 由此可见酸性条件下光合细菌产氢过程中 代谢生成大量有机酸和CO2气体，因此酸性条件对提高光合 细菌的产氢纯度是不利的. 虽然在碱性条件下光合细菌的产 氢量较低，但是可以抑制光合细菌厌氧发酵生成CO2，有助 于提高光合细菌的产氢纯度. 2.3 酸碱条件对能量转化效率的影响 2.3.1 酸碱条件对底物能量转化效率的影响 底物能量转化 效率是指在一定时间内光合细菌产生氢气的燃烧热占所消 图3 生物量随时间的变化 Fig. 3 Time course of bacterial concentration 图4 不同初始pH值下光合细菌的产氢特性 Fig. 4 Effect of initial pH value on the hydrogen production characteristics of photosynthetic bacteria 254 17 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol 耗底物燃烧热的百分率，反映光合细菌产氢时对有机物能 量的有效转化率，其中每摩尔氢气和葡萄糖的燃烧热分别为 242 kJ/mol和2 888 kJ/mol [16]. 不同反应液初始pH值下底物能量转化效率如图5所示. 不同酸碱条件下，光合细菌利用底物能量代谢产氢的最高底 物能量转化效率对应的pH值为7.0，实验条件下光合细菌所 得到的最大底物能量转化效率为1.98%. 在一定光波长照射 下，初始pH值较低时，细胞内酶的活性较低，导致光合细菌 利用光能代谢的能力不大，主要进行葡萄糖发酵类型代谢， 补充生命活动所需能量，随着初始pH值增加，细胞产氢酶的 活性相应增加，细胞生理活动需消耗大量底物，所以光合细 菌的底物能量转化效率呈增加趋势. 在碱性条件下光合细菌 的细胞内外质子动力势较小，不利于底物的跨膜传输，而且 细胞内酶的活性受到抑制，因此光合细菌的底物能量转化 效率开始下降，初始pH值越高，光合细菌受到的抑制作用越 强[8, 10]. 光合细菌除了进行产氢代谢和生物量生长外，其余大 部分能量被细胞呼吸作用消耗或转变到中间代谢产物中. 因 此提高光合细菌底物能量转化效率，减少中间环节能耗，特 别是提高底物能量和光能转化效率是影响光合细菌制氢前 景的关键因素. 2.3.2 酸碱条件对光能转化效率的影响 对光合细菌产氢而 言，光能转化效率是指一定时间内光合细菌产生氢气的燃烧 热占入射至反应器反应液中光辐射能的百分数 [17]，它反映光 合细菌产氢代谢中对光能的有效利用率 . 不同反应液初始 pH值下的光能转化效率如图6所示. 由图可知，实验条件下光 能转化效率在4.1%~7.7%之间，在初始pH=7.0时光能转化效 率最大为7.7%，远高于文献[14]和[17]中Ela E和Basar实验获 得的最大光能转化率（0.70%和0.81%）. 在碱性条件下光合细 菌的光能转换效率远低于酸性条件下的光能转化效率，说明 碱性条件下细胞内外质子浓差较小，不利于驱动ATP合酶合 成产氢所需的能量ATP，因此细胞内光能供应能量不足，不 利于光合细菌转化光能产生氢气. 值得指出的是，实验中光 能转化效率与理论值 [18]相比还较低，表明除pH值外，其他影 响光合细菌光能转化效率的因素有待进一步研究. 3 结 论 1）初始pH值对光合细菌的生长特性影响显著. 当反应 液初始pH值为中酸性时，光合细菌在反应初期会自行进行 调节反应液pH值升高以适应菌体的生长，而当反应液初始 pH值为强碱性时光合细菌又会调节反应液pH值下降. 因此 弱碱性条件最适宜产氢光合细菌的生长，反应液pH值偏离 时，光合细菌会自身进行调节. 2）对不同初始pH值下光合细菌产氢特性的研究表明， 在反应液为酸性条件下，光合细菌能够充分吸收和利用光能 进行光合磷酸化过程合成ATP，因此光合细菌具有较高的光 能转化效率、产氢量和产氢速率，然而产氢纯度却随着反应 液初始pH值的增大而升高. 3）初始pH值为7.0的中性条件最有利于光合细菌生长 代谢及产氢. 此时总产氢量、产氢速率、底物能量转化效率 及光能转化效率均达到最大，分别为8.0 mmol、3.39 mmol g-1(cell dry weight) h-1、1.98%和7.7%，且产氢纯度也较高，为 70%. 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Walker教授由于阐明了ATP合成酶的结构与机理而荣获1997年诺贝尔化学奖）。主要总结评 介了蛋白质工程研究领域近年来发展得较为成熟的新方法、技术和研究成效。 联系人：科学出版社科学销售中心 周文宇 电话：010-64031535 E-mail：zhouwenyu@mail.sciencep.com 网上订购：http://shop.sciencepress.cn 科学出版中心生物分社 电话：010-64012501 网址：www.lifescience.com.cn E-mail：l ifescience@mail. sciencep.com