基因组提取

一、实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。 二、仪器及试剂 1. 仪器： 恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）。 2. 试剂： （1）细胞裂解缓冲液 Tris （pH8.0）100 mmol/L EDTA （pH 8.0）500 mmol/L NaCL 20 mmol/L SDS 10% 胰RNA酶 20μg/ml （2） 蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，-20℃备用。 （3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。 （4）酚，氯仿，异戊醇（25:24:1）。 （5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。 三、操作步骤 1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500μg/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12-24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。 2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μl 吸头挑出，凉干，用200μlTE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行。） 3.加等量的酚，氯仿，异戊醇（25:24:1）、振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿，异戊醇（24：1），振荡混匀，离心12000 rpm，5min。 5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。 6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm，5min。 8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。 9.加200μl TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。 10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。