网织红细胞检测进展及其临床应用

国际检验医学杂志2010年 2月第 31卷第 2期 Im J Lab Med，Febma~ 2010，Vo1．31，No．2 还应特别 注重学 生创新 能力的培养 ，使学生不仅成 为获取知识 的载体 ，更成为创新知识的主体 。所 以实验诊断学教学应 以应 用为目的，以临床思维能力的培养为核心。以灵活多样 的形 式，走一条更接近临床教学的路子，为培养合格的检验医师打 下扎实的基础。特别是实验课，要打破以实验方法、原理、参考 值、操作为主体的教学模式，采用灵活多样 的形式将实验的结 果运用融会于教学 中。强化对基本知识 、基本理论和基本技 能 的培养 ，进行典 型的病 案讨 论。此外 ，随着新 理论 、新知识和新 技能的涌现 ，应首 先以基本 知识 、基本理论 和基 本技能 为 出发 点 ，使学生打下扎 实的基础 。同时根 据教学 大纲 ，以示 教的 形 式有选择性地将新仪器、新试剂 、新技术介绍给学生，以此来拓 宽学生的视野和知识面 。 5．加强实施 ，提高学生综合能力 医学检验专 业是一门知识面广、实践性强、综合能力要求高的专业。因此 在教学中，除了要求学生有扎实的理论基础、熟练的操作技能 之外 ，还必需培养学生有一定 的理论联 系实际 、独立思考 、勇 于 创新的科学精神。在医学检验专业实习期间，安排一段时间的 专题实验并撰写 毕业论 文 ，引导 学生学 与用 、知与行 的密切 结 合 ，立足于培养学生的综合能力 。毕业论文实施可全 面考核学 生对理论知识 的掌握 和适 用能力 ，为学生今后 走向工作 岗位起 到一个 良好 的指 导作 用 ]。 在现代 医学 中，l临床检验结果 已被视 为一 种可以影响患者 · 191 · 最终治疗结果 的重要 指标 ，并对 临床治疗决 策起着 重要作用 ， 这不仅表明实验诊断对疾病的诊治具有更重要的意义，同时也 对医学检验教学提 出了更 高的要求 。一名合格 的检验 医师 ，不 仅应该掌握医学检验专业的各种操作和基本技术，还应能分析 化验结果，给临床医师的正确诊断提供咨询意见。医学检验专 业 教育要采取 以能力发展为主题 的新理念 ，为社会 培养基础扎 实、适应性强、有竞争实力的创造型和复合型人才。为了实现 以上 目标 ，就必需对现 有的检验 医学 教学模式进 行 的改革 ，更 新 教学 内容 、方法 和手 段 ，创 建有利 于培养 学生实 际能力 的新 的教学模式，为培养高素质的检验医学高层次人才而不断摸索 前进 。 参 考 文 献 [1] 周新，李霞，郑芳．论新世纪检验医学教育[J]．检验医学教育， 2005，12(4)：7-8． [2] 黎明新，朱明艳，张惠敏．对实验诊断教学的认识与思考EJ]．沈阳 医学院学报 ，2006，8(4)：285 286． [3] 吴丽娟，陈伟，邓光贵．检验医学本科生科研素质的培养EJ]．检验 医学与临床，2006，3(7)：337—338． (收稿 日期 ：2008 09 08) · 医 学 检 验 教 育 · 网织红细胞检测进展及其I临床应用 祝 丙华，张金树 ，李安全 (解放军 305医院检验科 ，北京 100017) 【关键 词】 实验室技术和方法 ； 诊断 ； 网织红细胞 中图分类号 ：R446．111 文献标 识码 ：B 文章编号 ：1673 4130(2010)02 O191—03 红细胞在骨髓 中生成 ，至发育 为成熟 红细胞 ，经 历 了不 同 阶段 ：干细胞 、原始红细胞 、早幼红细胞 、中幼红细胞 、晚幼红 细 胞 、网织红 细胞 ，最后发育为成熟红 细胞 。随着细胞的成熟 ，其 颜色变化会逐渐从蓝色转 变为含有 更多 血红蛋 白成分 的粉 红 色细胞 ，而 其所含 的核 糖 核酸 (ribonucleic acid，RNA)成 分 也 会相应减少 。网织 红细胞 (reticulocyte，Ret)是 有核 红 细胞 刚 刚失去核的阶段 ，仍 属未完全 成熟 的红细 胞 ，浆 内尚残 留有 嗜 碱性 RNA，经煌焦油蓝活体染色后，在包体内可见蓝色点状或 网状结构 。Ret是红细胞成 熟过程 中的一个重要 阶段 ，是判 断 骨髓红系造血情况和疗效 观察 的重要 指标 。其 检测 方法既有 传统的显微镜目测法，又有现代化的仪器计数法(如流式细胞 仪 、网织红 细胞计数仪及 血细胞 分析 仪)。现对 Ret的检测进 展 ，各检测方法 的优 缺点及其在临床上的应用作一综述 。 网织红细胞检测进展 1．手工法 手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容 易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低 ；试 管法容易掌握 ，重复性较 好 ，必要 时还可 以从混 合血液 中再取 标本重新涂片复查 。试管 法被列 为手工 法 Ret计数 的参 考方 法l1]。按卫生部《全 国临床检验操作规 程》第 2版l2]，采用试管 法用煌焦油蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片，选 择细胞 分布较均匀 、厚 薄适 中的体尾交 界处 ，每 份标本 油镜下 参照陈宝梁的 ]，即 Ret>6 ，计数红细胞 1 000个；3 ～ 5 计数 红细胞 2 000个 ；1 ～2 应 计数 红细胞 4 000个 ； 小于 1 计数红细胞 10 000个 。 传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果 的因素较 多 。近年来 ，国内开始 使用 国际 血液学 标准 化委员会 (IcsH) 推荐的 Miller窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误 差，使结果准确性有所提高(卫生部临检中心建议，CV控制在 15 之内)。Miller窥盘法是将一种光学圆片状 Miller窥盘安 放在显微镜 目镜 中，窥 盘 中有 面积 比例 为 1：9的 2个 正方形 计数方格 ，只需计数 1／9小方格 内的红 细胞 即可准确 估量出整 个大方格内的红细胞数量 (图 1)。 国内很 多学 者在此 基础 上 设 计了几种改 良的 Ret计 数窥盘 。张时 民等设 计 了一种 双环 式结构 的 Ret计 数窥 盘(图 2)，该盘 的特点是小 圆环和大 圆环 面积之 比为 1：10，小圆环 为计数红 细胞数量 ，大圆环为计 数 Ret数量。其圆形结构更加适合于人们观察和计数显微镜下 细胞数量的习惯，而且此比例更加易于计算红细胞和 Ret的比 值 ]；陈高远则在这两种窥盘的基础上设计了改良式 Miller窥 盘(图 3)，采用双正方形结构 ，小 方格 和大方格之比也达到 1： 1o，只是将红细胞计数区域位移至中心部位，以方便红细胞数 量 的计 数l_]；刘 志贤设 计 了一种 新 的 Ret计数 窥 盘即 180X 4 扇形 Ret计数窥盘(图 4)：圆形直径为 19 mm，圆心角 A0B 一 COD一 EOF一 GOH一180．弧 AB—CD—EF—GH— · l92 · 国际检验医学杂志 2010年 2月第31卷第2期 Int J Imb Med，February 2010，Vo1．31，No．2 180。计算公式为：Ret ：整个计数区域内的 Ret数／(4个小 扇面 区域 内的 RBC总数 ×5)×100％。这 种新 型 Ret计 数窥 盘 4个扇形区域均匀分布在整个视野的 4个方向，4个扇形面 积之和是整个圆形面积的 1／5，因此在理论上基本解决了红细 胞分布不均匀引起的问题，降低了系统误差和随机误差 。 图 1 Miller窥盘 图 2 双环式窥盘 图 3 改 良 Miller窥盘 萋{ G E 图 4 新型 18X4扇 形计数窥盘示意图 2．血细胞分析仪法 1993年以来，可进行 Ret计数的 血细胞分析仪相继问世，因其具有重复性好 、准确度高、省时等 优点，正被越来越多的医院所采用。仪器法 Ret计数使用各种 荧光 染料和非荧光染料对 Ret进 行染色 ，采用鞘流技术和射频 技术等不同原理进行检测。血细胞计数仪不仅可以计数 Ret， 同时还能检测出网织红细胞绝对值 Ret#、网织红 细胞平均体 积(MRV)、网织红细胞成熟指数 (RMI)等许多参数 ，这些参数 是 Ret分析 、临床应用和研究的热 门领域 。目前 国内应用 的带 有 Ret分析功能的多数血细胞分析仪主要为进 口产品，有美国 贝克曼一库尔特(Beckman—Coulter)、美国拜耳(Bayer)、美国雅 培(Abbott)、日本希森美康(Sysmex)及法国 ABX公司等。统 计表明，仪器法测定 Ret精密度有明显提高：对低 Ret标本， CV值 在 10 ～21 之间 ；对 正常范 围的标本 ，C 值在 3 ～ 16 之 间；高值标本 ，C 值在 2 ～10 j。 虽然仪器法 Ret计数有诸多优点 ，而且精密度明显优于手 工法 ，但也存在一些不足 ：第一，所有仪器分析的基本原理都 是检测 Ret内RNA的存在量来决定其百分率和绝对值，当某 些患者血液 中有核 细胞 或淋巴细胞异常增加时 ，可导致 Ret计 数结果的假性增加 ；第二 ，冷凝集素存在、红细胞的聚集、某些 病理因素或药物都能使红细胞产生 自身荧光；第三，自动化分 析仪结果 的准确性 除了依赖 于仪 器本 身的 良好性能外 ，还应有 良好的质控物随时检测仪器的状态。另外，仪器成本高、价格 贵，基层医疗单位投人较为困难。 3．流式 细胞仪法 和专用网织红细胞 分析仪 流式细胞 仪(flowcytometry，FCM)是一种多用途的精密分析仪器，1980 年起 国外 一 些 学 者 开 始 将 这 种 技 术 应 用 在 Ret分 析 上 ，如 Tanke等应用派若宁 Y(Pyronin Y) ；Lee，Davis~Bigelow等 使用亚 啶橙 (Thiazole Orang)等 。这 些 特殊 的 荧光 染 料与 Ret中的 RNA结合 ，当 FCM 发 出的激光照 射于细 胞上 时，根 据细胞 能 否发 射 出特 定 颜 色 的 荧 光 ，通 过 单 参 数定 量 测 定 RNA，从 而精确测定 Ret占成熟 红细 胞 的比率 。还可 根据激 光照射后发射出的荧光强度，或光吸收量大小 、光散射量多少 等参数的比例关系对 Ret成熟程度进行分群，将其划分为低荧 光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高 荧光强度网织红细胞(HFR)。FCM测定精密度明显高于手工 法 3～ 6倍 ，可在数 秒 中检测 2O 000个以上 的 红细胞 ，如 Ret 在 1．7％～6．6 ，其 平均 CV值在 4．3 [9]。不 足之 处 ，流式 细胞仪计数 Ret受 HOWEI I 一Jolly小 体 、疟 原虫 和 血小 板等 干扰 。 日本 Sysmex公 司在 1988年推 出了世界 上首 台全 自动 网 织红细胞分析仪 R一1000，它使用氩激光和流式细胞技术，用荧 光染料碱性槐 黄 0(Auramine())对 Ret进行染色 。此后 ，经过 不断改进 已经推 出 R一2000、R一3000和小型 R一500等系列产品 ， 成为血液 网织红 细胞 自动化 分析发展史的一个里程碑 。 网织红细胞检测的 临床应用 Ret计数及其各种参数(IRF、RMI、MRV、RPI等)在贫血 的诊治、骨髓移植、肿瘤的放化疗和药物疗效检测等方面具有 重要参考价值 。 1．网织 红细胞计 数的应用 贫血 的恢复是 通过骨髓释 放红 细胞 生成 素(EPO)完成 的，Ret增加可被 看成是 骨髓造血 功能对贫血的正常反应。失血性贫血时患者 Ret各项指标会 显著增高 ，失血 5～10 d内Ret可达高峰，出血停止后 2周可 恢复正常，临床上可应用此参数和特点来判别出血是否停止； 旦 堕堕芏塑查 生 箜 鲞第2期 Int J LabMed，February 2010，Vo1．31，No．2 缺铁性贫血 、巨幼 细胞 性 贫 血 时 也 可 见患 者 Ret轻度 增 加 。 Ret降低主要和造血功能减低有关，典型病例为原发性再生障 碍性 贫血、溶血性再生 障碍性 危象 ；此外还有急性 白血病 、继 发 性再 生障碍性贫血 、化疗 和放疗 引起 的骨髓造血功能抑制 或减 退等。 2．网织红 细胞 生成 指数(RPI)的应 用 RPI在估计红 细 胞生成有效 性和 贫血 起 因的 分类 方 法 中起 到重 要作 用 。Ki— netic和 Kessler等 。应用 RPI较为准确 地表 达 出 Ret的成熟 状态，从而对贫血的类型进行划分，如健康者平均 RPI为 l，当 RPI≥3时表示红细胞生成 增加 ，如溶 血性 贫血 和治疗 后 的营 养性贫血 ；而 RPI≤2时为红 细胞生 成减 少 ，如 缺铁性 贫血 ；对 于 EP()缺乏 、无效 造血等情况时 ，RPI多在 2～3之 间 ，还 无法 确定 。 3．网织红细胞成 熟度 (IRF)的应用 IRF为 不成 熟 的 Ret与总 Ret的比值，健康者平均值为 0．22，参考范 围 0．1～ 0．38，IRF越大表示不成熟 的 Ret的数 量越 多。这种 幼稚 Ret 水平 的改变一般 比患者 HGB、血小板 、白细胞和I临床症 状 的变 化 出现更早 。IRF和 HFR的增高在很 多 白血病患者化疗 中是 与粒细胞反应一致 的指标和骨髓移植后恢复的第一信号 。 IRF与 Ret#和 RPI呈 一弱 的、显著 的正 相 关 ：IRF增 加 (≥ 0．23)，一般伴有 Ret#增 加 ，提示患 者对于 贫血有 足够 的红系 反应 ；若 IRF<0．23，且 RPI≤2，则说 明红系造 血活性 下 降，则 以慢性肾功能不全居 多 ；Ret#正常或 略低 ，RPI≤2，但 IRF≥ 0．23，见于急性感染 、镰状细胞 性贫 血危象 、妊 娠和 MDS等状 况 。IRF是评价贫 血红 系增生 活性 的一 项新 的有用 的 指标 ， IRF结合 Ret#和 RP1可以为进一步阐明贫血分类提供有价 值的信息[1 2]。 4．网织红细胞成熟指数(RMI)的应用 该参数是计算 参数 ，可 由仪器 自动计 算 ，也可将 仪器测 定 的 Ret分群 参数 经 过人工计 算得到 。计算公式 为 ：RMI一 (MFR+HFR)／LFR× 100 。文献报道 RMI的参考范围，男性 ：17 ～37 ，女性： 1 6 ～35 1 3 1。据报道L1 ，急 性 白血病 化疗 后 Ret#正常 而 RMI较高 ，化疗 中则 Ret#和 RMI都 低 ；出现溶 血危象 时 Ret #和 RMI都 高 ；ITP则 Ret#正常而 RMI较 高。 5．网织 红细胞 分群 的应用 1)LFR 和 HFR可 作为 贫 血鉴别诊 断的初筛指标 。研究表 明 ，溶 血性 贫血 (HA)患者 由 于骨髓造血功能活跃 ，大量新生的 Ret释放到外周血，导致 Ret、LFR和 HFR明显增高；。肾性贫血时 HFR上升，I FR下降 而 Ret变化不大 ；缺铁 性贫 血患 者铁 剂治 疗前 ，Ret无 明显 改 变，HFR轻 度增 高 ，铁剂治疗一 周后 ，Ret及 HFR可呈 中度增 高，因此两个参数可作 为缺铁性 患者铁剂治疗后 的疗效观察指 标 ；再生障碍性贫血 (AA)患 者外周 血 Ret中度 减低 ，而 HFR 中度增高 ，这种现象可 能反 映了 AA患者造血功能紊乱时 的红 细胞 生成 变化 ；在鉴 别诊 断 MDS方 面 ，I esesve对 比了 7O例 MDS患者 和 220例健康 者 后发 现 HFR、RMI和 IRF的 P< 0．01，说 明 MDS患者产 生 的大 量生存 期延 长的“幼稚 ”的 Ret 是导致 HFR增加的原因【 】。2)HFR和 MFR+HFR可作为 骨髓移植 、化疗 的监测指 标 ，尤其是 MFR+HFR的变 化可 以 作 为评价肿瘤 患者化疗 期间 检测骨髓 造血 功能受 抑制 和开始 恢复 的较敏感 指标 。文献报道[1 ，骨髓 移植后 血小 板 、中性粒 细胞、白细胞 、Ret及 目测法 Ret计数恢复的天数分别为 16．4、 16．8、16．2、13．7、14．8 d。 关于网织红细胞的参考值，不同医院、不同仪器对不同的 人群进行测定，所得到的参考范围不尽相同。传统的 Ret测定 · l93 · 参考值，目前仍广泛应用于临床，并且被多数教材和专著认可。 张时 民在《网织红细胞检测技术 的进展 和临床应用 》一文中 ，详 细介绍 了传 统 方 法 和几 种 主要 类 型 Ret分 析仪 测 定 得 到 的 Ret百分比和绝对值 参考范围及 国外文献报道的 Ret参考 范围 。 小 结 综上所述 ，网织 红 细胞 的检 测技 术 正朝 着快 速 、准 确 、方 便 、省时的方 向发展 ；而网织红细胞参数应用 的开发研究 ，是近 年来国际上该领域 出现的新项 目，具有非常大的临床应用价 值 。 参考 文献 ： E1] 龚永启 ，蒋玉 叶 ，刘更夫 ，等．仪 器法与手工 法网织红 细胞 计数对 比分析口]．实用医技杂志，2007，14(16)：2183— 2184． [2] 叶应妩 ，王毓三．全国临床检验操作[M]．第 2版．南 京 ：东南大学 出版社 ，1997．14． [3] 陈宝梁．国际血液学标准化委员会推荐的网织红细胞活 体染色显 微 镜 计数 法 [J]．中华 医学 检验 杂 志 ，1993，16 (2)：196． [4] 刘志贤．一种新型 180×4扇形网织红细胞计数窥盘[J]． 生物医学工程与 临床 ，2007，11(3)：215 217． 1-53 张时 民，李 晓京．网织红细胞检 测技术 的进展和 临床应 用 [J]．中国医疗器械信息 ，2007，13(6)． [6] 沈定树．网织红细胞计数的研究进展[J]．国外医学 ·临 床生物化学与检验学分册 ，1996，17(5)：207． [7] Tanke HJ，Keur M．Selection of defined cell types by flow—cytometric cell sorting[J]．Trends Biotechno1．1993 Feb；11(2)：55-62． [8] Lee LG，Chen C，Chin I A．Thiazole()range：a new dye for reticulocyte analysis．Cytometry．1986；7：508． [9] 黄宇烽 ，李 克．现代临床检验诊 断于册 [M]．上海 ：第二军 医大学 出版社 ，2006．391-400． r10]Kessler C，Campbell P，Bdufe V，eta1．Immattire reticulo— cyte fraction and reticulocyte malurily indexLJ]．Coulter Communication，2000：l一1 2． [11]钱兵．CouI TER Jens、检测网织红 胞参数临床意义分 析 [J]．实用 全科 医学 ，2007，5(10)：925—926． [12]曹杰 贤 ，沈荣华．Coulter I H750仪 网织 红细 胞检 测参数 的临床 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