琼脂糖电泳

实验十、DNA 的限制性酶切和琼脂糖电泳 一、 实验 1、 DNA 的限制性酶切 2、 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 二、 实验原理 1、 DNA 的限制性酶切 限制性内切酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列之内或其附近的特异位点上，并在 此处切割双链DNA。它可分为 3 类。I 类和 III 类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖ATP 的限制（切割）活性（双功能酶），II 类修饰-限制系统是由两种酶分子组成的双元系统：一种为限制酶，它切割某 一特异的核苷酸序列，另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。分子生物学中常用的就是 II类。 绝大多数的 II类限制酶识别长度为4~8个核苷酸且呈二重对称的特异序列。EcoRI的识别序列是G↓AATTC， BmHI的识别序列是G↓GATCC，HindIII的识别序列是A↓AGCTT。 限制性内切酶是一类非常昂贵的试剂，使用过程中要仔细利用并有严格的。每种限制性内切酶都有特定的 反应条件，如特别的pH范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。一 般温度37℃，pH7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2， 和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。 典型的反应体系中包括lμg或更少的DNA和1单位酶以及合适的反应介质。反应总体积通常控制在20和50ul 之间，反应时间在1小时，而反应的终止则由EDTA溶液的加入完成，因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。 2、 DNA 的琼脂糖电泳 DNA的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳，它们是分离、鉴定和纯化DNA片段的方法。 DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。DNA分子在电场中通过凝胶介质中而泳动，除电荷效应外， 凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。由于DNA分子或DNA片段的分子量差别，电泳后呈现迁移位 置的差异。琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。琼脂糖凝胶对DNA的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶 可以分离长度为200bp至50kb的DNA。而分离小片段DNA（5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力 极高，能分离相差1bp的片段。 电泳过程中或电泳完毕直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙啶）进行染色，EB是一种扁平分子，可以嵌入 核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。即可确定 DNA 条带在凝胶中的位置，而且灵敏度相 当高，少至1~10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。 不同浓度琼脂糖凝胶分离的范围 凝胶中琼脂糖含量（%） 线状DNA分子的有效分离范围（kb） 0．3 5~60 0．6 1~20 0．7 0.8~10 0．9 0.5~7 1．2 0.4~6 1．5 0.2~3 2．0 0.1~2 三、 试剂： （1）1 X TAE电泳缓冲液：45mmol/Ltris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0 （2）凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。 （3）λ-DNA和提取的DNA λ-DNA是λ噬菌体的基因组DNA，全长50kb。用HindIII或（和）BamHI酶切得到的片段被广泛用于DNA 电泳的分子量标准。 （4）分子量标准（λ-DNA/HinD III） （5）限制性内切酶。 四、 操作方法 1、 DNA 的限制性酶切 （1） 取1只1.5mL离心管，按下列顺序加入： DNA： 5uL 10 X buffer: 2uL 蒸馏水： 12uL 限制酶： 1uL （2）轻轻摇匀，置于37℃保温1小时。 （3）加入4uL加样缓冲液，摇匀。 （4）取10uL进行电泳 2、 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 （1）将电泳槽彻底洗净。 （2）将电泳槽置于平整的台面上并调节水平。 （3）用2%琼脂糖封固胶模边缘，任其凝固。 （4）配制1X TAE电泳缓冲液。 （5）用1X TAE 电泳缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使之溶解。 （6）待琼脂糖溶液冷至60℃时，缓缓倒入胶模，厚约0.5mm。 （7）立即插入梳子，静待琼脂糖凝固。 （8）去掉封固的有机玻璃封条，将胶模放进电泳槽。 （9）向电泳槽倒入1X 电泳缓冲液，没过凝胶5mm。 （10）小心地拔掉梳子。 （11）用20uL的枪吸取DNA溶液，缓缓注入点样孔。 （12）按marker、限制酶酶切的DNA、提取的DNA依次点样 （13）接通电源，电泳。 （14）电泳完毕，取出胶模，将胶置入EB染色液中染色0.5小时。 （15）用搓板取出胶，置于紫外灯下观察。 华中农业大学生物化学精品课程组: 华中农业大学生物化学精品课程组 Text2: yangzq@mail.hzau.edu.cn