艾滋病检测技术规范2004

全国艾滋病检测技术规范 全国艾滋病检测技术规范 National Guideline for Detection of HIV/AIDS （2004年版） 中国疾病预防控制中心 二○○四年八月 前 言 为贯彻和落实《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》和《中国遏制与防治艾滋病行动计划（2001—2005年）》，加强全国艾滋病检测工作的规范化管理和质量控制，确保检测的准确性和可靠性，保证艾滋病检测实验室安全，及时有效地发现艾滋病病毒（HIV）感染者和上报疫情，在对1997年卫生部颁发的“全国艾滋病检测工作规范”修订的基础上，经卫生部同意于2003年5月由中国疾病预防控制中心颁发了《全国艾滋病检测技术规范（试行）》（下称《规范（试行）》）。 在《规范（试行）》使用期间，卫生部和财政部共同制定了《艾滋病免费自愿咨询检测管理办法（试行）》、《艾滋病及常见机会性感染免、减费药物治疗管理办法（试行）》，卫生部与中医药管理局共同制定了《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》，另外国家还颁布了《实验室生物安全通用要求（GB 18489-2004）》和《医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则（试行）》等重要政策法规。根据我国艾滋病流行形势以及防治工作对实验室检测技术和策略的需求，一年来，在广泛听取各有关管理部门和使用单位意见的同时，中国疾病预防控制中心多次组织全国艾滋病检测实验室审评和技术指导专家组、顾问组及艾滋病专家咨询委员会检测组成员，对《规范（试行）》内容多次进行修改、补充和审定，于2004年8月完成了《全国艾滋病检测技术规范》（下称《规范》）正式版本的最终审定。 为了有效配合艾滋病自愿咨询检测（VCT）和抗病毒治疗工作，本次对《规范（试行）》进行了重要修改和增补，包括：（1）对原有章节（样品的采集和处理，HIV抗体、抗原检测,HIV核酸定性检测，艾滋病检测实验室安全防护，实验室质量管理与考评，诊断试剂临床质量评估）的修改，使其更加符合目前艾滋病防治工作的需求，更加具有可操作性；（2）新增有关内容，包括艾滋病的VCT策略，婴幼儿HIV感染诊断和 CD4+/CD8+ T淋巴细胞检测，HIV RNA定量测定（病毒载量测定），并根据新颁布的文件、法规进一步明确了实验室的生物安全和职业暴露预防。 修订后的《规范》共10章，包括：样品的采集和处理、HIV抗体检测、HIV核酸定性检测、HIV RNA定量测定（病毒载量测定）、CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测、HIV抗原检测、艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防、艾滋病实验室质量管理、艾滋病实验室质量考评办法和HIV诊断试剂临床质量评估。 本《规范》上报卫生部，经获准由中国疾病预防控制中心发至全国艾滋病实验室及有关单位。本《规范》将为国家、卫生部与财政部等部委下发的关于艾滋病防治工作的各项政策法规的有效实施提供强有力的技术支持。 感谢对《规范》修订工作做出重要贡献的全国艾滋病检测实验室审评和技术指导专家组和顾问组的专家，感谢对《规范》修订提出重要参考建议的卫生部艾滋病专家咨询委员会检测组专家，感谢全国艾滋病实验室网络的有关管理和技术人员对《规范》提出了许多具有可操作性的建议。 本《规范》自发布之日起实施，同时中止《全国艾滋病检测技术规范(试行)》。 本《规范》适用于全国所有的艾滋病检测实验室。 本《规范》解释权属中国疾病预防控制中心。 目 录 第一章 样品的采集和处理……………………………………………………………………1 1 范围………………………………………………………………………………………1 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………1 3 操作步骤…………………………………………………………………………………1 3.1 样品的采集和处理…………………………………………………………………1 3.2 样品的保存…………………………………………………………………………1 3.3 样品的运送…………………………………………………………………………2 3.4 样品的接收…………………………………………………………………………2 第二章 HIV抗体检测………………………………………………………………………………3 1 范围………………………………………………………………………………………3 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………3 3 HIV抗体检测实验室………………………………………………………………………3 4 HIV抗体检测的目的和要点…………………………………………………………3 4.1 HIV抗体检测的目的…………………………………………………………………3 4.2 HIV抗体检测的要点…………………………………………………………………3 5 常规HIV抗体检测的方法和程序…………………………………………………………4 5.1 HIV抗体检测筛查试验………………………………………………………………4 5.2 HIV抗体确认试验……………………………………………………………………6 6 HIV抗体检测的替代策略…………………………………………………………………8 6.1 替代策略Ⅰ…………………………………………………………………………9 6.2 替代策略Ⅱ…………………………………………………………………………10 6.3 替代策略Ⅲ…………………………………………………………………………11 7 HIV抗体检测情况季报的时间和程序……………………………………………………12 第三章 HIV核酸定性检测…………………………………………………………………………13 1 范围………………………………………………………………………………………13 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………13 3 实验室条件………………………………………………………………………………13 3.1 实验室功能分区……………………………………………………………………13 3.2 人员………………………………………………………………………………14 3.3 设施和设备………………………………………………………………………14 4 方法和试剂………………………………………………………………………………14 4.1 方法………………………………………………………………………………14 4.2 试剂………………………………………………………………………………14 5 扩增目的基因片段………………………………………………………………………15 5.1 样品的采集和处理…………………………………………………………………15 5.2 核酸提取……………………………………………………………………………15 5.3 逆转录………………………………………………………………………………15 5.4 PCR扩增……………………………………………………………………………15 6 扩增产物分析及结果报告………………………………………………………………15 6.1 常用的扩增产物分析………………………………………………………………15 6.2 结果判定和报告……………………………………………………………………15 7 实验室管理…………………………………………………………………………………15 7.1 生物安全……………………………………………………………………………16 7.2 严格执行分区…………………………………………………………………16 7.3 仪器和材料的专用制度……………………………………………………………16 7.4 单向流向制度……………………………………………………………………16 7.5 废弃物处理制度……………………………………………………………………16 第四章 HIV RNA定量测定（病毒载量测定）………………………………………………17 1 范围…………………………………………………………………………………………17 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………17 3 实验室条件…………………………………………………………………………………17 3.1 实验室功能分区……………………………………………………………………17 3.2 人员…………………………………………………………………………………18 3.3 设施和设备…………………………………………………………………………18 4 方法和试剂…………………………………………………………………………………18 4.1 方法…………………………………………………………………………………18 4.2 试剂…………………………………………………………………………………19 5 实验室管理…………………………………………………………………………………19 5.1 生物安全……………………………………………………………………………19 5.2 严格执行分区制度…………………………………………………………………19 5.3 仪器和材料的专用制度……………………………………………………………19 5.4 单向流向制度………………………………………………………………………19 5.5 废弃物处理制度……………………………………………………………………20 5.6 质量控制和评价……………………………………………………………………20 6 HIV核酸定量检测的意义……………………………………………………………20 6.1 辅助诊断…………………………………………………………………………20 6.2 早期诊断…………………………………………………………………………20 6.3 病程监控…………………………………………………………………………20 6.4 指导治疗方案及疗效判定………………………………………………………21 6.5 预测疾病进程……………………………………………………………………21 第五章 CD4+和CD8+T淋巴细胞检测……………………………………………………………22 1 范围………………………………………………………………………………………22 2 规范性引用文件………………………………………………………………………22 3 实验室条件……………………………………………………………………………22 3.1 人员…………………………………………………………………………………22 3.2 设施和设备…………………………………………………………………………22 3.3 功能分区………………………………………………………………………22 4 样品采集、运输和接收…………………………………………………………………22 4.1 样品的采集…………………………………………………………………………22 4.2 样品运输……………………………………………………………………………23 4.3 样品接收……………………………………………………………………………23 5 方法………………………………………………………………………………………23 6 实验资料的记录…………………………………………………………………………23 7 结果报告…………………………………………………………………………………24 8 质量控制和评价………………………………………………………………………25 9 检测CD4+、CD8+ T淋巴细胞的意义…………………………………………………25 第六章 HIV抗原检测……………………………………………………………………………26 1 范围………………………………………………………………………………………26 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………26 3 实验条件…………………………………………………………………………………26 3.1 人员…………………………………………………………………………………26 3.2 设施和设备…………………………………………………………………………26 3.3 防护用具……………………………………………………………………………26 3.4 实验材料……………………………………………………………………………26 4 抗原检测………………………………………………………………………………26 4.1 适用范围……………………………………………………………………………26 4.2 试剂…………………………………………………………………………………26 5 HIV P24抗原检测方法……………………………………………………………………27 5.1 试验准备……………………………………………………………………………27 5.2 试验操作……………………………………………………………………………27 5.3 试验结果……………………………………………………………………………27 5.4 结果报告和解释……………………………………………………………………27 第七章 艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防……………………………………………29 1 范围………………………………………………………………………………………29 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………29 3​ 实验室生物安全级别……………………………………………………………………29 3.1 艾滋病血清学检测…………………………………………………………………29 3.2 HIV分离、研究……………………………………………………………………29 4 实验室安全防护…………………………………………………………………………29 4.1 个人防护及保健……………………………………………………………………29 4.2 实验室管理要求……………………………………………………………………30 4.3 实验室的安全操作…………………………………………………………………31 4.4 避免利器的使用……………………………………………………………………32 4.5 样品的采集…………………………………………………………………………32 4.6 带入和带出实验室的物品…………………………………………………………32 5 废弃物处置和消毒………………………………………………………………………33 5.1 废弃物处置…………………………………………………………………………33 5.2 HIV常用的消毒方法………………………………………………………………33 6 实验室意外和事故处理…………………………………………………………………33 6.1 意外和事故…………………………………………………………………………33 6.2 意外和事故的紧急处理措施………………………………………………………33 6.3 意外和事故登记、报告和检测……………………………………………………34 7 艾滋病的职业暴露后预防………………………………………………………………34 7.1 职业暴露……………………………………………………………………………34 7.2 HIV/AIDS的职业暴露后预防………………………………………………………34 8 安全药品储备点的建立及管理机制……………………………………………37 第八章 艾滋病实验室质量管理……………………………………………………………………39 1 范围………………………………………………………………………………………39 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………39 3 质量保证（QA）…………………………………………………………………………39 3.1 行政支持……………………………………………………………………………39 3.2 实验室规范化建设…………………………………………………………………39 3.3 人员培训及其评价…………………………………………………………………39 3.4 标本采集、运送和处理……………………………………………………………39 3.5 检测方法和试剂的选择……………………………………………………………39 3.6 设备维护与校准……………………………………………………………………39 3.7 文件和文件管理……………………………………………………………………40 4 质量控制（QC）…………………………………………………………………………41 4.1 质控血清的制备和保存……………………………………………………………41 4.2 质控图的建立及应用………………………………………………………………42 4.3 “即刻法”质控……………………………………………………………………44 5 质量评价（EQA）…………………………………………………………………………45 5.1 评价体系……………………………………………………………………………45 5.2 实验室室间质量评价及质量考评…………………………………………………45 第九章 艾滋病实验室质量考评办法…………………………………………………………46 1 范围………………………………………………………………………………………46 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………46 3 考评目的…………………………………………………………………………………46 4 考评对象及组织单位……………………………………………………………………46 5 考评内容和方式…………………………………………………………………………46 6 考评工作程序……………………………………………………………………………47 7 考评结果的判定…………………………………………………………………………48 7.1 判分原则……………………………………………………………………………48 7.2 常规评分………………………………………………………………………48 7.3 考评结果的判定……………………………………………………………………48 8 考评结果的处理…………………………………………………………………………49 8.1 对考评合格实验室的资格认证和鼓励……………………………………………49 8.2 对考评成绩较差实验室的整顿措施…………………………………………………49 8.3 各参评实验室考评资料汇总及存档…………………………………………………49 第十章 HIV诊断试剂临床质量评估方案………………………………………………………50 1 范围………………………………………………………………………………………50 2 规范性引用文件…………………………………………………………………………50 3 评估目的…………………………………………………………………………………50 4 评估组织及参加单位……………………………………………………………………50 4.1 国家级评估…………………………………………………………………………50 4.2 省级评估……………………………………………………………………………50 5 评估程序…………………………………………………………………………………50 5.1 国家级评估…………………………………………………………………………50 5.2 省级评估……………………………………………………………………………51 6 评估结果的分析及统计处理……………………………………………………………51 7 评估结果的收集、分析、上报和反馈…………………………………………………52 附表1 HIV抗体筛查报告…………………………………………………………………53 附表2 HIV抗体复检化验单………………………………………………………………54 附表3 HIV抗体确认检测报告单…………………………………………………………55 附表4 HIV感染流行病学监测疫情报告单………………………………………………56 附表5 HIV抗体替代策略检测报告单 …………………………………………………57 附表6 HIV抗体检测数季报表…………………………………………………………58 附表7 艾滋病职业暴露个案登记表………………………………………………………59 附表8 艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表………………………………………62 第一章 样品的采集和处理 1 范围 本章规定了用于艾滋病病毒（HIV）检测的血清、血浆和全血样品的采集和处理方法，适用于HIV抗体检测、抗原检测、核酸检测、CD4+/CD8+T淋巴细胞测定和HIV分离培养。 2 规范性引用文件 Guidelines for Using HIV Testing Technologies in Surveillance WHO/CDS/CSR/EDC/2001.16 UNAIDS/01.22E ISBN 9713-92-063-7. 3 操作步骤 3.1 样品的采集和处理 艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用的血液样品的采集和处理方法如下： 3.1.1 血清样品采集和处理 3.1.1.1 用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置12h，待血液凝固、血块收缩后再用3、000r/min离心15min，吸出血清备用。 3.1.1.2 如用滤纸片采样，则手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后再包装送检。 3.1.2 抗凝血样品采集和处理 3.1.2.1 用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。 3.1.2.2 应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或肝素或枸橼酸钠，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。 3.1.2.3 用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。病毒载量测定不同方法对样品的要求见第四章4.1中表2；CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品采集要求见第五章4.1。 3.1.3 采集样品注意事项 3.1.3.1 采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒书有特殊要求除外）。 3.1.3.1 采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液；直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。 3.2 样品的保存 3.2.1 用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8℃。 3.2.2 用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下，进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于-80℃。 3.2.3 用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。 3.3 样品的运送 3.3.1 实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。 3.3.2 应采用WHO提出的三级包装系统 3.3.2.1 第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。 3.3.2.2 第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。 3.3.2.3 第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（数量，收、发件人）。 3.3.3 血清和血浆样品应在28℃条件下由专人运送。用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下1823℃运送。每一包装的体积以不超过50ml为宜。 3.3.4 运送感染性材料必须有记录。 3.3.5 如分离血浆仍有困难，可直接将抗凝血-20℃以下冻存，采用冰壶冷藏运输，避免冻融。 3.3.6 特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好，避免使用玻璃容器，以保证不会破碎和溢漏。 3.4 样品的接收 3.4.1 含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的、穿戴防护衣的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。 3.4.2 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告有关领导和专家。 3.4.3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。 3.4.4 打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。 样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。 3.4.5 因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。 3.4.6 接收样品时应填写样品接收单。 第二章 HIV抗体检测 1 范围 本章规定了HIV抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略，适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者/AIDS病人的诊断、报告和处理的实验室依据。 2 规范性引用文件 Revised recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. WHO/UNAIDS Revised version 2001. 实验室生物安全通用要求（GB 19489-2004）。 3 HIV抗体检测实验室 应符合《全国艾滋病检测工作规范（1997年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。 应符合《实验室 生物安全通用要求》（GB 19489-2004）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。 实验室的质量保证按本规范第八章规定执行。 实验室安全防护按本规范第七章规定执行。 4 HIV抗体检测的目的和要点 4.1 HIV抗体检测的目的 4.1.1 HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。 4.1.2 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。 4.1.3 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。 4.1.4 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 4.2 HIV抗体检测的要点 4.2.1 筛查试验阳性不能出阳性报告。 4.2.2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。 4.2.3 严格按照试剂盒说明书操作。 4.2.4 注意防止样品间交叉污染。 5 常规HIV抗体检测的方法和程序 HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验。 5.1 HIV抗体检测筛查试验 5.1.1 筛查试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。 5.1.2 筛查方法 5.1.2.1 常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA） 目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。血源筛查仍以第三代ELISA为主，国际上有些国家和地区已将线性免疫酶测定（第四代ELISA试剂）用于血源筛查。第四代ELISA试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂相比，检出时间提前了4~9.1d。其优点在于能同时检测抗原抗体，降低血源筛查的残余危险度。 5.1.2.2 快速检测（RT）及其它检测 随着对HIV感染者和AIDS病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快速的HIV检测方法被广泛应用。常用的主要有以下几种： （1）明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准；HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。 （2）斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。 （3）斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。 （4）艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准。 （5）其它快速筛查试验方法：家庭HIV检测（Home Access System）等。 5.1.2.3 尿液HIV抗体检测 1996年美国FDA首次批准HIV-1尿液ELISA试剂，我国也正在研制尿液HIV抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品（IDUs）人群和其它高危人群的大面积流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定。 5.1.3 筛查试验 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检）。 5.1.3.1 初筛试验：以第三代ELISA（双抗原夹心法）为例。 （1）实验准备：试验开始前将试剂和样品放置在室温(1823℃), 按实验室SOP做好试剂准备。 磷酸盐缓冲液：若液体内有结晶,应放置在37℃直至溶解，用蒸馏水1：25稀释浓缩液，4℃保存2周。 TMB底物液：使用前配制，TMB液和过氧化脲液等量混匀。 1M硫酸终止液：85 ml蒸馏水中加入5 ml浓硫酸。 备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。 （2）实验操作 ①装好所需使用数目的孔条,每孔均加入100μl样品稀释液。设3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。 ②每孔加入50μl待检样品及对照（对照要后加），未用孔用样品稀释液加满以溶解结合物球，以免堵塞洗板机孔。可震摇15S，37±2℃孵育60±5min。 ③置洗板机上洗涤6遍（用洗液将反应孔完全加满,静置3060S,共洗涤6遍，洗完后孔上方及底部不应残存液体,禁止在滤纸上拍干）。 ④每孔加入100μl底物液，勿搅动，室温避光孵育30±2min。 ⑤每孔加入100μl 1M硫酸终止反应，充分混匀。 ⑥在2h内置于酶标仪读数，单波长450nm，或双波长450/630nm测OD值。 （3）实验结果 ①阴性对照（NC），HIV-1阳性对照（PC1），HIV-2阳性对照（PC2） NC 必须＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，计算NC平均值。 NC界限范围：0.6倍NC均值＜NC＜1.4倍NC均值。 ②符合以下条件的实验成立： 两个以上的NC可用。 PC1-NC均值 ≥ 0.4，PC2-NC均值 ≥ 0.4 ③Cut off值 = 阴性对照均值 + 0.100 小于Cut off为阴性，大于或等于Cut off为阳性 （4）报告：对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。 5.1.3.2 复检试验：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认（见图1）。 图1 HIV抗体筛查检测流程 5.1.4 初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告（可用附表1）；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告（附表2）。 5.1.5 初筛试验呈阳性反应样品的转送 如需送上级实验室进行复测或确认，需要填写“HIV抗体复测送检单”（附表2），经1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。 5.1.6 对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。 5.2 HIV抗体确认试验 5.2.1 确认试验的试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 5.2.2 确认试验方法 包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIATEK HIVⅢ）、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）。国内常用的确认试验方法是WB。 5.2.3 确认检测流程 有HIV-1/2混合型和单一的HIV-1或HIV-2型。先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性；如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体检测结果不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应则报告HIV-2抗体血清学阳性,并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析，见图2。 图2 HIV抗体确认检测流程 5.2.5 确认试验结果的判定 下面是我国使用WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则。在实际工作中还应参照所用试剂盒说明书综合判定，遇疑难情况应报上级实验室解决。 5.2.5.1 HIV-1抗体阳性（+） 至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1条env带和p24带同时出现。 5.2.5.2 HIV-2抗体血清学阳性（+） 同时符合以下2条标准可判为HIV-2抗体血清学阳性： （1）符合WHO阳性判定标准，即出现至少2条env带（gp36和gp140/ gp105）。 （2）符合试剂盒提供的阳性判定标准。 5.2.5.3 HIV抗体阴性（-） 无HIV抗体特异带出现。 5.2.5.4 HIV抗体不确定（±） 出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性。 注：①HIV-1抗体特异带包括：env带：gp160/gp120、gp41；gag带：p55、p24、p17（或p18）；pol带：p66（或p65）、p51、p31。②HIV-2抗体特异条带包括：env带：gp140/gp105、gp36；gag带：p56、p26、p16；pol带：p68、p53、p34。（由于使用的毒株不同，HIV-2 env带也可为gp125/gp80、gp36）。 5.2.5 HIV抗体确认试验结果报告 确认试验由确认实验室根据检测结果出具“HIV抗体确认检测报告单”（附表3），报告HIV抗体阳性（+）、HIV抗体阴性（-）及HIV抗体不确定（±）。 5.2.5.1 符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性（+）”，并按规定做好检测后咨询、保密和疫情报告工作。 5.2.5.2 符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性（-）”。如果近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等情况，为排除因“窗口期”而出现的假阴性结果，建议高危行为后3个月时再做抗体检测。也可进行HIV-1 P24抗原或HIV核酸检测，作为辅助诊断。 5.2.5.3 符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定（±）”，在备注中应注明“3个月后复检”，同时进行以下处理： (1) 随访复检：每3个月随访复检1次，连续2次，共6个月。如果检测时暴露时间已超过3个月，则在3个月后随访1次即可。将前后2份样品同时检测，仍呈不确定或阴性则报告HIV抗体阴性，如果在随访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则报告HIV-1或HIV-2抗体阳性。 (2) 必要时可做HIV-1 P24抗原或HIV核酸测定，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结果。 5.2.6 发出确认报告的同时要做好检测后咨询。 5.2.7 HIV抗体确认报告由1名具有高级卫生技术职称的人员复核签字，按原送检程序反馈。如确认对象户口不属于本辖区，确认报告应同时抄送HIV感染者户口所在地的省艾滋病确认中心实验室。其它系统确认的地方人员（包括本地和外地），也应及时向当地卫生行政部门和省艾滋病确认中心实验室报告。 5.2.8 省艾滋病确认中心实验室难以确认的样品，送国家艾滋病参比实验室确认。同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致的确认结果时，由国家艾滋病参比实验室和艾滋病确认实验室审评及技术指导专家组予以仲裁。 6 HIV抗体检测的替代策略 除上述常规检测程序以外，可以根据不同的目的，对HIV流行强度不同的地区和不同人群采用不同的替代策略，见表1。 表1 HIV抗体检测的替代策略 目的 地区 人群 替代策略 艾滋病疫情报告 任何地区 任何人群 替代策略Ⅰ VCT 高流行地区 高危人群 替代策略Ⅱ 高流行地区 一般人群 替代策略Ⅲ 其它地区 任何人群 替代策略Ⅲ 6.1 替代策略Ⅰ（HIV感染疫情报告检测策略） 6.1.1 适用范围 全国HIV 感染疫情报告。 6.1.2 检测程序及结果报告 6.1.2.1 先用一种筛查试剂检测，出现阴性反应则报告“HIV抗体阴性（-）”。出现阳性反应则用两种不同原理或不同厂家的试剂复测（其中包括进口第三代ELISA试剂）。 6.1.2.2 两种试剂复测均为阳性，且其中第三代ELISA试剂复测样品OD值与临界值（Cutoff）的比值（S/CO）≥6.0者可作阳性考虑，上报疫情（附表4）。两种试剂复测结果均为阳性，但第三代ELISA试剂复测S/CO比值在1.05.9之间，或两种试剂复测结果呈一阴一阳，应进一步作确认试验，按照确认试验的标准判断结果（图3）。 图3 替代策略Ⅰ（HIV感染疫情报告检测策略）检测流程 6.2 替代策略Ⅱ（高危人群VCT检测策略） 6.2.1 适用范围 HIV感染高流行地区高危人群的VCT。应在确认中心实验室和确认实验室或以上实验室指定的筛查实验室进行，用高质量筛查试剂检测及判断结果（见6.2.2）。使用该策略判断结果，阳性报告须由确认中心实验室和确认实验室或以上实验室认可的筛查实验室出具。 6.2.2 检测程序及结果报告 6.2.2.1 先用第一种筛查试剂（ELISA-1）检测，出现阴性反应报告HIV抗体阴性；出现阳性反应则报告“HIV抗体待复查”，并用第一种酶联试剂（ELISA-1）和第二种酶联试剂（ELISA-2）复检。 6.2.2.2 两种ELISA试剂检测结果均阴性则报告HIV抗体阴性；两种ELISA试剂检测结果均阳性，且S/CO比值均大于或等于6.0者，用第三种筛查试剂（高特异性筛查试剂）检测，如果第三种试剂检测结果为阳性，在符合使用该策略条件的地区和人群中可以出具“HIV-1抗体阳性（+）”报告，使用“HIV抗体替代策略检测报告单”（附表5）。 6.2.2.3 下列情况均需做确认试验，按照确认试验的结果出报告：两种ELISA试剂检测结果一阴一阳、两种ELISA试剂检测结果均阳性但一种或二种S/CO在1.0～5.9之间、第三种筛查试剂检测结果为可疑或阴性。 图4 替代策略Ⅱ（高危人群VCT检测策略）检测流程 6.2.3 在发放检测报告的同时上报疫情。 6.2.4 做好检测后咨询。 6.3 替代策略Ⅲ（一般人群VCT检测策略，图5） 6.3.1 适用范围 HIV高流行地区一般人群检测及其它地区各类人群的VCT检测。 6.3.2 检测程序及结果报告 6.3.2.1 先用一种高敏感性筛查试剂检测，出现阴性反应报告HIV抗体阴性；出现阳性则用第二种筛查试剂（高特异性）复检。 6.3.2.2 第二种筛查试剂检测阴性则用第三种筛查试剂（另一种高特异性试剂）检测；第二种筛查试剂检测为阳性则按疑似阳性咨询，建议进一步做确认试验，按确认试验的结果报告。 6.3.2.3 第三种筛查试剂检测为阴性则报告HIV抗体阴性；第三种试剂检测为阳性按疑似阳性咨询，建议进一步做确认试验，按确认试验的结果报告。 图5 替代策略Ⅲ（一般人群VCT策略）的检测及结果报告流程图 6.3.3 发放检测报告的同时上报疫情。 6.3.4 对报告阳性者做好检测后咨询。 7 HIV抗体检测情况季报的时间和程序（图6） 7.1 艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点应于每季度首月5日前填写“HIV抗体检测数季报表”（附表6），向艾滋病筛查中心实验室报告上季度检测情况。没有艾滋病筛查中心实验室的地区可直接向艾滋病确认中心实验室报告。 7.2 艾滋病筛查中心实验室应于每季度首月10日前将本实验室和本辖区内各筛查实验室上季度报告的检测情况（附表6）汇总，报告艾滋病确认中心实验室。 7.3 艾滋病确认实验室应于每季度首月10日前将上季度检测情况汇总后（附表6），报告当地艾滋病确认中心实验室和同级卫生行政部门。 7.4 艾滋病确认中心实验室应及时收集、整理和分析辖区内HIV抗体检测情况，于每季首月15日前向省级卫生行政部门和中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心（简称中国疾控中心性艾中心）参比实验室报告。同时，按艾滋病疫情报告的有关规定上报疫情。 7.5 在非送检样品中（如专项调查与研究等）发现的艾滋病病毒抗体阳性者，应向所在地的省疾病预防控制中心报告, 并填写“HIV抗体确认检测报告单”（附表3），报中国疾控中心性艾中心参比实验室。 7.6 实验室上报检测结果的同时，应随时报同级监测人员，以便及时随访调查。 图6 HIV抗体检测情况季报流程 第三章 HIV核酸定性检测 1 范围 本章规定了核酸检测、核酸序列测定的实验室条件、检测方法及结果判定标准，适用于HIV核酸的定性检测。 2 规范性引用文件 卫生部关于印发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》的通知（卫医发[2002]第10号） Butcher A, Spadoro J: Using PCR for detection of HIV-1 Infection. Clin Imm Newsletter, 12:73:76, 1992. http://www.niaid.nih.gov/daids/vir_manual/full_vir_manual.pdf 3 实验室条件 3.1 实验室功能分区 3.1.1 实验室原则上应分为4个独立工作区 试剂准备区、样品处理区、扩增区和扩增产物分析区，并设在不同房间。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区的功能是： 3.1.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存。 3.1.1.2 样品处理区：样品登记、分装；核酸提取、保存和加样。套式PCR的第二轮加样不能在此区。 3.1.1.3 扩增区：核酸扩增。 3.1.1.4 扩增产物分析区：扩增产物的电泳、杂交、成像、序列测定、结果分析、登记及报告。 3.1.2 扩增前区与扩增后区应严格分开，须使用不同的房间，两区之间最好有一定的间隔距离。 3.1.3 使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制。 3.1.4 在满足下列操作和清洁处理要求的前提下，样品处理区和试剂准备区可设在同一房间内： 3.1.4.1 在生物安全柜内操作。 3.1.4.2 每个实验人员、实验组分别使用各自的试剂及耗材。 3.1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。 3.1.4.4 用有效的方法对操作区域和共享器具在实验前后进行清洁及消毒。 3.1.4.5 推荐的实验室处理程序是： （1）实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除。 （2）移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进行试验。 （3）一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。 （4）实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域；封好污染材料盛放器皿并移至污物袋；移出共享器具至专门区域保管；将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15min。 3.1.5 产物分析使用相对封闭的系统时，如特定的检测系统或全自动分析仪，扩增区和扩增产物分析区可设在同一房间内。 3.1.6 各区域的仪器、设备、器具和试剂为该区专用，不得交叉使用。 3.2 人员 进行HIV核酸检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室生物安全及实验操作技术培训。 3.3 设施和设备 3.3.1 根据检测项目配备相应的设施和设备。 3.3.2 各区域的设施和设备为区域性专用，开展特定试验时应根据要求在相应区域放置专用设备。以下是各区域应配备的设备： 3.3.2.1 试剂准备区：冰箱、洁净工作台、离心机、加样器、振荡器、废弃物容器、紫外灯。 3.3.2.2 样品处理区：冰箱、生物安全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴、上下水设备、废弃物容器、紫外灯。 3.3.2.3 扩增区：核酸扩增设备、冰箱、离心机、加样器、废弃物容器、紫外灯。 3.3.2.4 扩增产物分析区：冰箱、离心机、加样器、电泳仪、振荡器、恒温水浴、紫外透射仪、摄影/像设备、上下水设备、废弃物容器、核酸污染物处理设备，紫外灯等。 3.3.2.5 测定HIV RNA应配备-80℃冰箱，上述其它冰箱为2-8℃和-20℃。 3.3.3 各区域应备有专用的或一次性工作服、帽子和鞋套，必要时配备防紫外线眼镜和/或口罩。 4 方法和试剂 4.1 方法 4.1.1 检测血浆或血清样品使用RT-PCR方法，检测血细胞样品使用PCR方法，一般使用套式PCR方法扩增两轮。 4.1.2 除待测样品外，还应设立阳性、阴性对照。 阳性对照：与待测样品同质、含有目的基因片段的标本。 阴性对照：与待测样品同质、不含有目的基因片段的标本。 空白对照：不含模板的扩增试剂。 4.2 试剂 每个实验室使用的方法不尽相同，下面所列试剂供参考。 4.2.1 引物 以检测为目的一般使用HIV gag和/或pol和/或env和/或其它基因区的引物、进行HIV-1的基因亚型测定常使用HIV-1 gag 和/或pol和/或env基因区的引物。在进行RNA逆转录时可使用扩增的下游特异性引物或随机引物，可参考文献的引物序列或自行引物，应尽量涵盖常见的HIV毒株，也可使用复合引物。 4.2.2 其它试剂 包括核酸提取纯化、逆转录、PCR所需的试剂。 主要有：DNA/RNA提取试剂盒、细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TAE缓冲液、逆转录酶及其缓冲液、RNA酶抑制剂、PCR反应缓冲液、DNTPs、Taq酶。 5 扩增目的基因片段 5.1