基于检测报告基因的药物筛选方法研究进展

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Phytomedicine ,1996 ,3 (2) :147.(收稿日期 :1999211225) 基于基因的药物筛选方法研究进展 孙哲 ,吕秋军 (军事医学科学院放射医学研究所 ,北京 100850) 摘要 :目的 　介绍国内外基于报告基因原理在细胞水平进行小分子化合物类药物筛选的研究成果 ,为我国新药开发提供参 考。方法 　以国内外有代表性的论文为基础 ,将各报告基因系统的特点及检测方法相比较 ,进行。结果 　应用基于报告 基因的功能性新药筛选方法进行先导化合物的筛选 ,不仅使小分子有机化合物替代生物大分子作为药物成为可能 ,而且应用 此方法可以明显提高筛选的流通量并在筛选的过程中得到有关细胞内功能性反应的信息。结论 　基于报告基因检测的药物 筛选方法具有广阔应用前景。 关键词 　报告基因 ;靶标 ;药物筛选 ;小分子有机化合物 中图分类号 :R965. 1 　文献标识码 :A 　文章编号 :1001 - 2494(2000) 08 - 0507 - 04 　　近年来 ,细胞因子的新药研究开发逐渐成为研究热点。 但由于有机小分子化合物具有高效、安全、成本低和稳定等 优点 ,决定了通过建立高效和特异的筛药模型筛选有机小分 子化合物成为新药研制领域的一项重要课。并且 ,随着基 因组及蛋白组学研究的不断进展 ,为新药研究提供了大量的 靶标 ,而靶标的分子生物学研究取得的成果使得对靶标基因 表达的更精确、更敏感、更微观的调控元件的研究成为可能。 另外 ,生物学和化学的不断发展 ,更加先进仪器设备的不断 开发都为新的药物筛选方法的建立奠定了现实基础。通常 对候选药物的检测方法有 :报告基因法、ELISA 法、受体2配体 结合法、酶2底物反应法以及最新的基因芯片等。笔者结合 本实验室工作讨论基于报告基因的药物筛选方法。 1 　基于报告基因筛药模型的构建元件 在药物筛选过程中筛药模型的构建是最初的 ,也是最重 要的一个环节 ,它对新药发现的效率和效果起着至关重要的 作用。由于转录因子和基因表达是药物发现过程中的重要 靶标 ,如病毒感染、肿瘤、炎症、免疫系统疾病等都有上述的 变化。但经典的基因表达的检测方法比较复杂。如果把靶 基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连 ,转入细 胞内 ,通过简单地检测酶活性的变化 ,就可以反映化合物对 转录因子和基因表达的作用性质和程度。一般地把这种能 间接反映基因转录水平的编码某种酶活性的基因称为报告 基因。 构建针对靶基因表达的筛药模型首先要确定构建模型 所需要的调控序列。分子及细胞生物学上的一个中心问题 是 ,顺式作用的 DNA 序列与反式作用的因子如何协同控制 真核基因的表达。这些相互作用是由转录因子或转录因子 复合物特异结合到增强子或启动子元件上介导的。这些元 件即通常我们所说的调控序列 ,它一般见于转录起始位点的 上游。调控序列的确定一方面可以通过查阅已有的文献 ;另 一方面可以通过一个测定转录变化的替代方法来确定 ,即将 所研究的基因中推测的顺式作用序列与一个易于检测其产 ·705·中国药学杂志 2000 年 8 月第 35 卷第 8 期 　　　　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2000 August , Vol . 35 No. 8 ' 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 物的报告基因编码序列相连 ,通过对报告基因表达产物的测 定 ,来测出完整的调控序列。类似的 ,也可以用这种方法测 定转录激活物的结合位点。然后 ,根据具体情况选择表达载 体。典型的表达载体应具有相应的复制起始位点 ,如具有一 个噬菌体的复制起点 (f1 ori) ,以产生单链 DNA 产物便于测 序和诱变研究 ;一个细菌复制起点以便载体在大肠杆菌中扩 增 ;载体中还常常加入其他的复制起点 ,以使得其在其他宿 主中能稳定扩增。载体还需要抗生素抗性基因 ,例如抗氨苄 青霉素的抗性基因。载体中除了应具有报告基因的插入位 点外 ,为了插入调控序列 ,还要求在报告基因的上游存在若 干个紧密相邻的单一限制性内切酶位点 ,此外载体中报告基 因下游若存在一个或多个单酶切位点 ,可用来检测可能的增 强子元件或用于切除报告基因。 可以选择的载体类型共有两种 :附加体型表达载体和诱 导性哺乳动物细胞表达载体。两者的区别在于 ,前者不需要 向后者一样整合到宿主细胞核的 DNA 上就可以在宿主细胞 内转录翻译元件的作用下 ,启动表达。 2 　报告基因的选择 2. 1 　选择报告基因的原则 对于报告基因的选择主要应遵循以下几个原则 [1 ] : ①应 该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法检测报告基因 的表达产物。②报告基因蛋白总数与报告基因可转录的 mRNA 的总数相一致。③在靶细胞中不存在或仅存在极微量 的与报告基因分子相同或相似的内源性蛋白或酶的活性。 ④为便于分析启动子活性的大小 ,报告基因分子的分析结果 应具有很宽的线性范围。⑤该基因的表达必须不改变受体 细胞或生物的生理活动。 2. 2 　报告基因的种类 报告基因的种类很多 ,根据对其表达产物的分析方法的 不同 ,可以分为体外报告基因和体内报告基因。前者的分析 需要在含有报告分子的细胞或组织的裂解液 ,或 (对于分泌 型的报告分子) 被转染细胞的培养液中进行报告分子的定 量。比较典型的包括氯霉素乙酰基转移酶基因 (CAT) 、人生 长激素基因 (hGH) 及分泌型碱性磷酸酶基因 (SEAP) 等。后 者的分析可以在活的细胞或组织 (如转基因动物) 中 ,或在已 经过组织化学固定的细胞或组织中进行 ,较典型如绿色荧光 蛋白基因 ( GFP) 或称为水母素基因。而β2半乳糖苷酶基因 (β2gal) 、β2葡糖醛酸酶基因 (β2GUS)和萤火虫荧光素酶基因既 可以进行体外分析也可以进行体内分析。各报告基因系统 的详细特点见表 1。各报告基因系统都不同程度的符合上述 标准。每一报告基因及其相应的分析系统都各具特色及局 限性 ,在选择时应加以考虑。 表 1 　报告基因系统 报告基因 体外分析 体内分析 优点 缺点 氯霉素乙酰转移酶基因 (CAT) 荧光或免疫分析 不常用 在哺乳动物中内源性活性极小 ;蛋白稳定 ; CAT mRNA 的 t1Π2短 ;工作量大 , 　有不同的分析方法 　费时 ;灵敏度相对较低 ;线性 　范围较窄 人生长素基因 (Hgh) 放射免疫分析 不常用 分泌型报告分子 ,直接检测蛋白水平 ;可在 放射性分析需125 I标记 ;灵敏度 　96 孔板进行高流通量分析 ;操作简单 　相对较低 ;费用昂贵 ;线性范 　围较窄 分泌型碱性磷酸酶 比色分析 ;生物发光 不常用 非同位素 ;分泌型报告分子 ;化学发光非常 对于表达低水平胎盘型碱性磷 　基因 (SEAP) 　或化学发光 (发光 　灵敏且线性范围较宽 ;有利于在 96 孔板 　酸酶的细胞不合适 ;对于影响 　剂或闪烁计数仪) 　上进行高流通量分析 　靶细胞分泌功能的实验设计 　不合适 绿色荧光蛋白基因 ( GFP) 不常用 荧光 (紫外光箱 ,荧 报告活细胞内的基因表达和基因定位 ;荧光 对于某些应用来说信号强度可 　光显微镜或 FA 　发射无种属依赖性 ;荧光是该蛋白的内在 　能太弱 　CS分析) 　属性 ;不需求附加基因产物、底物或辅助 　因子 ;荧光信号对光漂白具有高抗性 ;在 　细菌及真核细胞中 GFP表达无明显毒性 　作用 β2葡糖醛酸酶基因 (β2GUS) 比色分析 ;荧光或化 X2Gluc 为底物进行 非同位素 ; GUS蛋白很稳定 ;化学发光非常 最灵敏的分析需要荧光计或发 　学发光 (发光剂 　组织化学染色 　灵敏且线性范围较宽 　光计 (闪烁计数仪可以代替) 　或闪烁计数仪) 萤火虫荧光素酶基因 生物发光 (发光剂或 活细胞内以荧光素 非同位素 ;灵敏性好 ,线性范围宽 ;在哺乳 蛋白半寿期短 ;分析需要发光计 　闪烁计数仪) 　酯为底物进行生 　动物中内源性活性极小 ;相对廉价 　或闪烁计数仪 ,常规分析重复 　物发光分析 　性差 β2半乳糖苷酶基因 (β2Gal) 比色分析 ;荧光或化 荧光素222β半乳糖 非同位素 ;对不同用途有多种分析方法 ;化 分析需要荧光计或发光计 ;许多 　学发光 (发光剂或 　吡喃糖苷 (FDG) 　学发光分析非常灵敏 ,并具有较宽的线性 　细胞类型具有内源性β2半乳 　闪烁计数仪) 　在活细胞内进行 　范围 ;适合作为校正其他报告分子的内对 　糖苷酶活性 　生物发光分析 ;X2 　照 　gal 组织化学染色 　　近来基于细胞功能的光学指示剂和基于分子生物学原 理的常规性光学生物传感器的研究 ,为应用荧光和化学发光 原理检测报告基因的表达奠定了基础 [2 ] 。此类基因主要包 括 Ca2 + 敏感的光蛋白水母素基因和一系列以 1 ,22二氧杂环 丁烷类化合物为探针的报告基因 [3 ] ,如β2gal ,β2GUS和碱性磷 酸酶基因等。这类报告基因的表达可以在多种组织和细胞中 ,采用不同光学检测方法通过对探针或化学发光底物的光学信号的检测 ,来进行靶标功能的研究。各种光学检测方法的比较见表 2[4 ] 。在应用光学原理检测报告基因的表达时 ,为了提高细胞水平的筛选流通量 ,选择适当的靶标及对 ·805· Chin Pharm J , 2000 August , Vol . 35No. 8 　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2000 年 8 月第 35 卷第 8 期 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 表 2 　光学检测方法的比较 方法 探针 优点 缺点 吸光度 X2gal (β2gal 的 方法简单 不适于微量检测 　底物) 荧光强度 Fluo23 (Ca 指示 高信号 ;灵敏性好 由于荧光自动分 　剂) FDG(β2Gal 　;适于微量分析 　布 ,所以其他类 　的底物) 　荧光化合物会 　影响筛选 荧光共振能 香豆素2荧光素 可检测 nm级的 供体和受体的发 量转移 　(CCF2、FRET的 　生物相互作 (如 　射光谱会发生 (FRET) 　检测底物) 　用蛋白2蛋白相 　重叠 ,对检测仪 　互作用) ;适用 　器的要求高 　于微量检测 荧光分布 绿色荧光蛋白 适合胞内分析 ;电 筛选流通量相对 　( GFP)嵌合 　势改变较大 　较低 发光 　体荧光素、水母 本底较低 ;灵敏性 　质子流量低 ,需 　素、1 ,22二氧杂 　好 　要较长的阅读 　间环丁烷 　时 胞内信号转导途径进行充分的研究是十分必要的。应针对 不同的靶标选择不同的信号分析方法 ,见表 3[4 ] 。 表 3 　靶标及信号分析方法的概述 信号 靶标 分析资料 分析方法 Ca G蛋白偶联受体 Ca 指示剂 荧光法 　( GPCR) Ca 　离子通道 Ca 光蛋白 发光法 报告基因 荧光法和发光法 cAMP G蛋白偶联受体 FlchR 荧光共振能量转 ( GPCR) 　移法 报告基因 荧光法和发光法 电压 离子通道 Ca 指示剂 荧光法 强度染色 荧光法 FRET染色系统 荧光共振能量 　转移法 酶 激酶 ,磷酸酶 ,蛋 报告基因 荧光法和发光法 　白酶及其底物 GFP定位 荧光法和荧光共 　振能量转移法 蛋白相互作用 很多 ,包括受体二 GFP定位 荧光法 　聚体 ,酶及其底 GFP缔合 荧光共振能量转 　物 　移法 信号转导 很多 ,包括受体 , 报告基因 荧光法、发光法 　酶及信号转 和荧光共振能量 　导因子 转移法 定位 荧光法 　　在选择报告基因系统时 ,应充分考虑其各自具有的优点 和局限性 ,并且适于某一特定的报告基因系统的细胞类型可 能因其表达水平低 ,或因有内源性活性物质导致的高背景而 受到某些限制。最后 ,选定某一报告基因系统对报告基因表 达产物的分析既可以选择体外活性分析或免疫学分析 ,也可 以选择体内的组织化学方法进行分析。因此在解决特定问 题时应综合考虑多方面影响因素。 3 　应 　用 本实验室正在进行的新药筛选工作 ,就是基于造血生长 因子及其受体 JAK2STAT信号转导 ,选择信号转导分子 STAT 蛋白为靶标和 CAT为报告基因 ,以能够与 STAT蛋白特异性 结合的细胞核内的 DNA 序列为调控序列 ,在载体 pMTΠEP 的 基础上进行筛选模型的构建 [5 ] 。将构建好的筛选载体转染 入特异的宿主细胞中 ,进行具有激活 STAT活性的化合物筛 选。由于 CAT是一种原核生物来源的酶 ,因而在许多真核生 物细胞中很少有竞争活性 ,使对报告分子的分析可以达到很 高的信噪比 ,但许多 CAT分析方法都需价钱昂贵的放射性底 物 ,并且操作费时 ,灵敏性差 ,所以我们利用 CAT的 t1Π2较长 , 相对稳定的特点 ,转染后在 96 孔微量滴定板上采用 CAT2 ELISA 方法进行 CAT的定量检测。目前 ,我们已利用类似的 原理构建筛选模型得到了一个具有雌激素活性的有机小分 子化合物。 Tian 等 [6 ]基于同样的原理 ,以人工合成的 4 个拷贝的 STAT结合序列为调控序列 ,以荧光素酶基因为报告基因 ,将 构建成的表达载体导入转染了粒细胞集落刺激因子 ( G2CSF) 受体的 4B6 细胞中。利用此细胞株进行筛选 ,得到了一个有 机小分子 SB 247464。该分子在 4B6 细胞株中 ,能够同 G2CSF 一样 ,启动荧光素酶基因表达。虽然活性稍低 ,但却避免了 有机大分子类药物不宜口服 ,毒性较大等缺点 ,并且以 SB 247464 为先导化合物 ,经过组合化学方法的改造 ,在此基础 上完善其结构 ,易得到高活性的有机小分子化合物。同 CAT 相比 ,荧光素酶的活性检测通过应用可穿过质膜的可溶性荧 光素酶底物 ,在活细胞内直接进行 ,所以更方便 ,更快速。但 由于这些化合物一般是不带电核的荧光素脂类 ,很容易穿过 脂质膜进入到细胞中 ,一旦进入细胞中 ,这些底物即被内源 性酯酶转变成荧光素 ,后者即成为报告基因所编码的荧光素 酶的底物。所以 ,这种方法还欠灵敏 ,并且缺乏 GFP 所具有 的进行实时分析能力。 目前 ,Kimura 等 [7 ]也已成功筛选到造血生长因子小分子 有机物模拟物 ,他们应用一种完全不同于报告基因法的竞争 性结合法筛选得到两个化合物 TM4 和 TM41 ,最后经过 UT27Π TPO细胞系的增殖功能检测发现 ,虽然两种化合物都能与 TPO 受体的胞外配体结合区域相结合 ,但只有 TM41 能够通 过激活 STAT5 而促进 UT27ΠTPO 细胞增殖。由此可见 ,用受 体结合方法筛选得到的有机小分子化合物必须进行功能性 实验 ,才能确定该分子是否具能在细胞内引发功能性反应。 这也是受体结合筛药法逊于基于报告基因的功能筛药法之 处。 应用荧光或化学发光方法对此类原理的报告基因进行 检测 ,更简单 ,更灵敏。例如 Zlokarnik 等[8 ] 在进行转录定量 和单一活细胞克隆筛选的研究中用β2内酰胺酶基因为报告 基因。在细胞株转染受体表达后 ,再转染构建好的 NF2AT2β2 内酰胺酶质粒。报告基因的表达产物可以水解细胞内的一 种跨膜脂蛋白 ,每一个酶分子可以催化很多底物分子的化学 键断裂 ,从而改变底物分子的共振能。在哺乳动物细胞中 , 这种变化可以通过胞内颜色由绿到蓝的改变来探测到。用 这种方法对候选药物进行筛选 ,最大的优点在于 :整个筛选 过程可以直接在存活细胞中进行 ,而不必破碎细胞 ,报告基 因表达的定性定量分析可以简单的通过胞内颜色的变化来 探测。 另外 ,报告基因β2gal 的表达则可以在多种体系中应用 化学发光法进行检测 ,如在哺乳动物细胞的提取物、转基因 动物的组织提取物、酵母及细菌细胞提取物和大肠杆菌中都 ·905·中国药学杂志 2000 年 8 月第 35 卷第 8 期 　　　　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2000 August , Vol . 35 No. 8 ' 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 可进行体外翻译体系中酶合成的定性定量分析 [9 ] 。应用 Ga2 lacton2Plus 底物进行迁延发光动力学的研究可以大大简化高 流通量的药物筛选方法。若用双重光的报告基因分析系统 对β2gal 和荧光素酶的活性同时进行定量 ,则不仅可以将两 个报告基因同时转染并同时进行实验分析 ,而且用这种多重 报告基因的实验分析方法可以明显提高筛选效率。 在研究中还发现 ,分泌型报告基因 SEAP[10 ] ,相对于其他 报告基因具有很多优点 : ①表达产物是一种分泌型蛋白 ,可 以直接在细胞培养液的上清液中进行检测 ,不必进行细胞的 破碎。②SEAP的表达引发的是一种发光、发热的动力学效 应 ,因此可以简单地使用发光计进行测量 ,无须其他复杂仪 器。③采用 CSPD 为底物相对于其他显色底物 (如对硝基苯 磷酸) ,检测灵敏度提高了 1000 倍 ,同时线形范围也延宽至 5 个数量级。④SEAP 的热稳定好 ,因此可以通过热处理抑制 其他非胎盘碱性磷酸酶同工酶的活性 ,对非胎盘碱性磷酸酶 的进一步活性抑制可以用 L2高精氨酸。SEAP 的化学发光分 析法不仅可以应用到对稳定转染细胞培养液的分析中 ,还可 以用于细胞浓缩物中的非分泌型胎盘碱性磷酸酶的分析 ,在 对核激素受体、肿瘤引发物调控序列、生长因子、及在稳定转 染细胞系中 cAMP 的应答元件的分析过程中 ,可以明显提高 筛选的流通量。 在生物化学分析法 [11 ]和受体结合分析 [12 ]过程中还可以 结合其他的荧光检测方法 ,例如 :荧光偏振法 [13 ] 、荧光相关光 谱学法 [14～16 ]及时间荧光分析法 [17～18 ]等。这些方法可以将分 析过程转移到细胞内进行 ,获得更多的有关细胞功能的信 息 ,而且随着新的研究工具的出现 ,还将促进对报告基因的 研究不断趋向自动化和微量化 [19 ] 。 总之 ,在药物筛选的过程中将不同的转录因子或基因表 达作为研究靶标 ,根据实际情况选择不同的报告基因作为筛 选标记可以明显提高药物筛选的流通量 ,具有很高的科研价 值和商业价值。鉴于小分子类药物优点 ,对那些可以改变转 录因子活性或影响细胞调控的小分子在细胞水平上进行筛 选 ,将功能反应作为筛选指标 ,筛选结果不仅可以证明筛选 出的化合物与受体有亲和力 ,而且还能够提供有关化合物生 物学活性的功能信息 ,如作用强度、特异性等 ,在临床研究 , 如对病毒感染、炎症、癌症、免疫功能障碍的研究中 ,具有广 阔的应用前景。 参考文献 [ 1] Bronstein I , Martin CS , Fortin JJ , et al . 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