胰蛋白酶改性的研究现状和展望
营养与饲料 兽药与饲料添加剂 2009 年第 14 卷第 4 期
VETERINARY PHARMACEUTICALS & FEED ADDITIVES
胰蛋白酶是动物消化道中一种主要的碱性蛋
白水解酶,属丝氨酸蛋白酶家族,被广泛应用于食
品业、纺织业、皮革工业、制药业、畜牧业和现代生
物技术等领域。 但由于天然酶活性低、稳定性差等
原因,其应用受到很大限制。 蛋白酶改性研究可提
高稳定性,满足工业生产加工中酸、碱及高温条件
要求,因此该方面研究也受到更多重视。
1 胰蛋白酶的固定化技术
由于液相胰蛋白酶存在严重自溶...
营养与饲料 兽药与饲料添加剂 2009 年第 14 卷第 4 期
VETERINARY PHARMACEUTICALS & FEED ADDITIVES
胰蛋白酶是动物消化道中一种主要的碱性蛋
白水解酶,属丝氨酸蛋白酶家族,被广泛应用于食
品业、纺织业、皮革工业、制药业、畜牧业和现代生
物技术等领域。 但由于天然酶活性低、稳定性差等
原因,其应用受到很大限制。 蛋白酶改性研究可提
高稳定性,满足工业生产加工中酸、碱及高温条件
要求,因此该方面研究也受到更多重视。
1 胰蛋白酶的固定化技术
由于液相胰蛋白酶存在严重自溶、 解折叠作
用,限制了其在生产上的直接应用。 而酶固定化技
术克服了这一不足,能使酶稳定性增加并可重复利
用。影响固定化酶制备的因素很多,包括载体
结
构和性能、固定化方法、固定化位点、固定化条件
等,其中载体选择和固定化方法是固定酶制备的关
键。 近年来,固定技术发展迅速,各种大分子载体被
开发出来并成功应用于胰蛋白酶固定化技术上。
1.1 高分子载体
近年来,国内外已有很多以壳聚糖作为酶固定
化介质的报道, 用壳聚糖固定化胰蛋白酶制备高比
活性抑肽酶已显示出工业应用前景。 研究
明,用
戊二醛预交联的网状壳聚糖为载体制备的固定化
胰蛋白酶表现出较好的热稳定性、pH 稳定性和在
乙醇水溶液中的稳定性 [1]。 另外,海藻酸钠 [2]、珠状
琼脂糖凝胶[3] 、纤维素及其衍生物等作为固定化介
质都有大量报道,结果都可明显提高酶稳定性。 另
外,利用丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、聚微球
(N-乙烯基-α-苯丙氨酸)等合成有机高分子载体固
定后的酶活性也得到了很好保留[4-5]。
1.2 无机载体
无机材料因其良好的机械性能、 热稳定性、对
微生物腐蚀以及有机溶剂的耐受性等,在酶固定技
术上得到广泛应用,常用的有玻璃、硅凝胶、铝等。
近年来,大量新型无机载体被用于研究报道,如玻
璃纤维膜、分层固体材料 、硅微芯片的应用取得了
很好效果[6-7]。
1.3 复合载体
复合载体是将有机聚合物材料涂覆在具有刚
性结构的无机载体上制得的兼有聚合物载体。 这种
材料兼有二者优点:键合蛋白质能力高、易成型、刚
性结构、不易变形等。 目前,实验室制备的复合载体
已有很多种,磁性材料作为酶固定化基质,在磁场
作用下易从反应混合物中分离出来,因此被广泛应
用。 Amaral等[8]把胰蛋白酶通过磁化的涤纶–酰肼
共价连接在磁性涤纶颗粒上,结果显示这种固定化
酶可在 10 ℃时储存 2 个月。 此外,涂敷了交联壳聚
糖的硅胶、多糖-纤维素、碳纳米复合材料等,均成
功应用于胰蛋白酶固定技术。
2 大分子结合修饰
若通过改变 DNA 上碱基来重新设计酶结构和
功能, 只能在密码子相对应的 20 种氨基酸之间变
动。 通过改变蛋白酶侧链基团就可突破该限制,达
到更理想的修饰效果。 利用大分子或小分子修饰剂
对酶分子侧链进行改造,以获得具有临床和工业应
用价值的酶蛋白,是目前应用最广泛的酶化学修饰
技术。 尤其是大分子修饰剂以其优良的修饰效果,
得到了更广泛的应用。 研究表明,大分子修饰剂是
胰蛋白酶改性的研究现状和展望
李秀娟 1, 郭 娟 2, 易 艳 3, 李英文 3
(1. 重庆市动物生物学重点实验室,重庆 400047; 2. 重庆市生物活性物质工程研究中心,重庆 400047;
3. 重庆师范大学生命科学学院,重庆 400047)
摘要:近年来,随着蛋白酶改性研究的不断进步,试图提高胰蛋白酶稳定性的有关研究也取得了长足发展。 综述
了目前国内外关于胰蛋白酶的固定技术和大分子修饰技术的研究现状, 并提出了通过定点改造和体外定向进化技
术提高胰蛋白酶稳定性的可能。
关键词:胰蛋白酶;固定化技术;大分子修饰;体外定向进化
中图分类号:Q556+.9 文献标识码:A 文章编号:1007-9157(2009)04-0026-03
综 述
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通过与酶分子表面的赖氨酸残基共价结合,改变酶
分子微环境进而影响其催化特性的,因此该修饰反
应是随机的,没有特异位点,产物不均一。
2.1 多糖类大分子及其衍生物
常见的用于蛋白酶修饰的多糖有蔗糖、 聚蔗
糖、右旋糖苷、肝素、羧甲基纤维素、环糊精及其衍
生物。 蛋白酶稳定性主要依赖于热力学原理和疏水
相互作用, 引入多个共价键可加固蛋白质构象,通
过大分子遮蔽减少酶分子表面非极性基团,增加其
稳定性。 这类修饰剂具有良好的生物相容性和水溶
性,其糖链上的双羟基经活化后可与酶分子游离氨
基相结合。
对于修饰剂来说,最常用的活化方法是高碘酸
钠氧化法,活化产物见光易分解,所以活化和修饰过
程都必须避光进行。 Venkatesh 等(1998)分别将蔗
糖、聚蔗糖氧化后共价结合在胰蛋白酶上,修饰过
程中没有酶活损失,修饰酶最适温度升高,热稳定
性明显高于自然酶,在尿素溶液中稳定。 聚蔗糖修
饰后的胰蛋白酶由于引入大量分子内交联和氢键
更稳定。 Fernandez 等[9]用环糊精的单胺衍生物、单
醛衍生物修饰胰蛋白酶,结果修饰酶抗自解能力和
酯酶活性都有明显升高。 经活化羧甲基纤维素修饰
的胰蛋白酶的 Km 是天然酶的 2.2 倍, 热稳定性提
高,且在甲醇及酸碱介质中的稳定性也得到提高。
2.2 交联剂
分子内交联可增加酶分子刚性,提高其构象稳
定性,因此设法增加酶分子在表面交联键的数目是
酶稳定化的方法之一,且研究已取得较好进展。 最
先使用的交联剂是戊二醛。Venkatesh等(1998)用戊
二醛和聚戊二醛修饰胰蛋白酶,结果表明:修饰酶
热稳定性明显增加,但效果低于聚蔗糖修饰后的胰
蛋白酶。 利用戊二醛或蔗糖二乙醛单体或多聚体交
联的丝氨酸胰蛋白酶,最适温度从 45 ℃升至 76 ℃,
解链温度也升高 22 ℃。
Clair 等(1992)证实,利用交联晶体技术可提高
嗜热芽孢菌蛋白酶稳定性,至今已成功制得多种交
联晶体酶,但由于酶结晶过程耗时耗力,需高纯酶,
且复合酶不可结晶,这在很大程度上限制了交联晶
体酶在工业上的使用。Sheldon研究小组提出了 1种
新型交联酶聚体技术。 在溶液中对酶进行简单的沉
淀处理就可得到酶聚体,再将之交联得到交联酶聚
体。 由于其表面及内部形成一层网状交联化酶膜,
不仅可使聚体内部酶分子不会扩散到溶液中,而且
使酶分子具有很好舒展性, 从而保留了较高酶活。
王梦凡等(1998)成功制备胰蛋白酶的交联聚体,并
指出沉淀是控制酶活保留的关键,高沉淀剂浓度有
利于酶活保留,试验表明酶的最适温度升高,热稳
定性和溶剂稳定性都明显高于自然酶,且无明显酶
泄漏现象。
2.3 聚乙二醇及其衍生物
聚乙二醇(PEG)作为 1 种生物相容性高分子聚
合物在生物技术领域具有广泛应用。 对酶修饰技术
来说,PEG 也是研究最早、 最为完善且应用最广的
化学修饰剂,其修饰可降低酶分子免疫原性,延长
其在体内的半衰期, 增加蛋白质溶解性和热力学稳
定性以及抗蛋白酶降解能力 [10]。 研究证明,综合修
饰反应中酶活损失及修饰后蛋白酶性质改变,相对
分子质量 4 000~6 000 Da 的 PEG 及其生物修饰效
果比较好。
PEG 末端的羟基是其化学反应的功能基团,但
活性比较低,只能在激烈条件下与其他基团发生反
应,而蛋白质不能耐受这样的条件,因此必须对其
进行活化,将其改造成各种活性中间体。如聚乙二醇
均三嗪衍生物、聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物、聚乙二
醇马来酸酐衍生物、聚乙二醇胺类衍生物等。现在普
遍采用的是单甲氧基聚乙二醇(mPEG),因其一端是
惰性的单甲氧基,故修饰反应不会出现交联。
Treetharnmathurot等[11]选用相对分子质量 1 100、
2 000 和 5 000 Da 的 mPEG通过不同活化方法连接
到胰蛋白酶上, 得到的修饰酶稳定性都高于自然
酶,且用氰尿酰氯法活化的相对分子质量 5 000 Da
的 mPEG 修饰后的胰蛋白酶热稳定性最好。 Gaert-
ner等(1992)用不同相对分子质量的 PEG 修饰胰蛋
白酶,结果显示:用 BAPNA 做底物时,所有修饰酶
的 Vm 都增大了 3~4 倍, 抗变性剂量、 能力增强。
PEG相对分子质量和修饰酶的 Km成反比。 当酶分
子中 80%游离氨基被 PEG结合后,其热稳定性和抗
去污剂能力显著提高。Abuchowski等研究了 PEG修
饰后的胰蛋白酶性质, 发现其与抗体结合能力减
弱,BAEE 做底物时反应速率增大,与血管紧张素反
应活性损失 3/4,与牛肝脏过氧化氢酶反应几乎完全
丧失。 国内,对此研究并不多,董伟等[12]用不同相对
分子质量的 PEG 和 mPEG 合成不同类型的聚乙二
醇衍生物用于修饰胰蛋白酶,结果修饰酶稳定性均
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高于原酶。Km值增加,最适 pH值不变,酶活力大小
受修饰度影响。
3 定点改造和体外定向进化
引入 1 个特定功能基团是保证蛋白酶特异位
点修饰的重要手段,活性部位微环境的改变就可引
起蛋白酶性质变化。 如枯草杆菌蛋白酶的改造,在
其特异性口袋 S1 的 Ser166 引入 Cys,再共价连接上
个 R-SSO2CH3,就可改变底物特异性 [13]。 枯草杆菌
蛋白酶 N-末端引入巯基可改变侧链基团的解离情
况, 在巯基上连接马来酰胺修饰的聚丙烯酰胺后,
酶的热稳定性和抗自溶能力明显提高[14]。 但关于胰
蛋白酶特异位点修饰的报道并不多。
体外定向进化技术是改造酶蛋白质分子的 1
种新策略,其不需要事先了解酶的定向结构和催化
机制,在实验室模拟自然进化机制,通过易错 PCR、
致突变等方法对编码酶蛋白质的基因进行随机诱
变,由 DNA 改组、随机引发重组和交错延伸等方法
进行突变基因体外重组,设计高通量筛选方法来选
出需要的突变株。 它不仅可快速生产工业上有用的
新酶,而且为研究蛋白质结构与功能的关系开辟了
新途径, 极大拓展了蛋白质工程学研究与应用进
展,体外定向进化作为后基因组时代一个重要的技
术平台得到日益广泛的应用。
体外定向进化技术走向应用的关键在于,在保
证突变质量的前提下, 尽可能缩小突变体库容量、
降低筛选成本、减少工作量。 目前体外定向进化技
术已在多种酶中试验成功, 如枯草杆菌蛋白酶、植
酸酶 [15]、淀粉酶 [16]等,但有关胰蛋白酶的此类报道
尚未看到。
目前国内对于胰蛋白酶的固定技术和大分子
修饰等传统研究较多,且发展非常迅速,尤其是随
着新型材料的开发, 这些研究技术也会越来越完
善。 但只有少数固定化酶的实际应用被报道,主要
原因是成本太高和大规模生产的限制。 因此,进一
步探索适合工业生产的有效固定技术和修饰方法,
意义更加重要。 定点改造和定向进化技术出现较
晚,但近年来在新技术、新理论指导下有了长足发
展,有多种酶已报道研究成功。 相信将来关于胰蛋
白酶的研究也会不断涌现并取得进一步成功。
参 考 文 献
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作者简介:李秀娟(1984—),女,山东聊城人,硕士研究生,研究
方向为生物化学与分子生物学。
[收稿日期:2009-06-18]
综 述
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