对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法(修订稿)

附件 对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法(修订稿)保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1试验项目 动物实验分为一(刀豆蛋白A急性肝损伤模型)、方案二(急性酒精性肝损伤模型)和方案三(亚急性酒精性肝损伤模型)三种 1.1 方案一(刀豆蛋白A急性肝损伤模型) 1.1.1体重 1.1.2血清中谷丙转氨酶(ALT) 1.1.3血清中谷草转氨酶(AST) 1.1.4血清中乳酸脱氢酶(LDH) 1.1.5 肝组织病理学检查 1.2 方案二(急性酒精性肝损伤模型) 1.2.1体重 1.2.2血清甘油三酯(TG) 1.2.3血清极低密度脂蛋白(VLDL) 1.2.4肝组织病理学检查 1.3 方案三(亚急性酒精性肝损伤模型) 1.3.1体重 1.3.2血清中胆固醇(CHOL) 1.3.3血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL) 1.3.4血清中胆红素(TBIL) 1.3.5肝组织病理学检查 2 试验原则 2.1所列指标均为必做项目。 2.2根据受试样品作用原理的不同,方案一、方案二和方案三任选其一进行动物实验。 3 结果判定 方案一(刀豆蛋白A急性肝损伤模型)在模型成立的前提下,ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性,可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。 方案二(急性酒精性肝损伤模型):血清中TG、VLDL指标阳性和病理组织学检查结果阳性,可判定该受试样品具有对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。 - 1 - 方案三(亚急性酒精性肝损伤模型):①血清中CHOL、LDL和TBIL三项检测指标结果阳性,可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用;②血清中CHOL、LDL和TBIL三项指标中任两项结果阳性,且肝脏病理组织学检查结果阳性,可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。 在急性或亚急性酒精性肝损伤结果判定中,任何一项方案为阳性时,可认为该受试物具有降低酒精性肝损伤危害功能。 对化学性肝损伤有辅助保护功能检验方法 Method for the Assessment of Assisting the Protection Against Chemical Injury of Liver Function 1 方案一(刀豆蛋白A急性肝损伤模型) 1.1 原理 刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素,它能在体外激活T细胞的丝裂原,进入循环后首先活化T淋巴细胞,继而激活肿瘤坏死因子(TNF)和白介素2等细胞因子,引发炎症反应,可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用,通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。 1.2实验动物 成年大鼠或小鼠,单一性别,大鼠(180-220克),每组8-12只;小鼠(18-22克), 每组10-15只。 1.3 实验方法 1.3.1 剂量和分组 至少设三个剂量组,同时设阴性对照组和模型对照组,必要时设溶剂对照组。以人体推 荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)一个剂量(等效应剂量),另设二个剂量组,最高剂量不得 超过人体推荐量(以公斤计算)的30倍。 1.3.2受试样品的给予 经口灌胃给予受试样品,无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可,并记录每只动物 的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天,必要时可延长至45天。 1.3.3实验步骤 1.3.3.1造模方法 每日经口灌胃给予受试样品,阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两 次,以调整受试样品剂量。模型组及各样品组于实验结束时一次尾静脉给予剂量为15~ 20mg/kg的刀豆蛋白A,小鼠10ml/kg BW,禁食8h后经腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉,腹主动脉采血,并取肝组织,进行各项指标的检测及病理组织学检查。 1.3.3.2检测指标 体重、血清中谷丙转氨酶(ALT)、血清中谷草转氨酶(AST)、血清中乳酸脱氢酶(LDH)、 肝脏病理组织学变化。 1.4 血清ALT、AST和LDH的测定 1.4.1检测方法 血清中ALT、AST 推荐采用速率法, LDH推荐采用乳酸为底物的速率法(LD-L法)。 血样离心(2500rpm)后取上清,血清中的ALT、AST和LDH的检测采用用全自动或 半自动生化分析仪进行。 1.4.2 数据处理 数据采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐,计算F值, F值F0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐

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后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。 1.4.3 结果判定 模型对照组与阴性对照组比较,血清ALT、AST和LDH含量升高有统计学意义(P< 0.05),表示模型成立。在模型成立的前提下,受试样品组血清ALT、AST和LDH含量与模型对照组比较降低,差异有显著性(P<0.05),可分别判定ALT、AST和LDH指标结果阳性。 1.5 肝脏病理组织学检查 1.5.1 实验材料 取小鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定,从肝左叶中部做横切面取材,常规病理制片(石蜡包埋,HE染色)。 1.5.2镜检 从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化,用5倍物镜连续观察整张组织切片,可见肝脏多发的灶状、片状坏死。 1.5.3 评分标准 1.5.4 数据处理 采用方差分析或秩和检验。但方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值F0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。 1.5.5 病理结果判定 模型对照组与阴性对照组比较肝细胞坏死程度加重有统计学意义(P<0.05),表示模型成立。在模型成立的前提下,受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较,肝细胞坏死程度减轻,有统计学意义(P<0.05),可判断为阳性结果。 1.6 结果判断 在模型成立的前提下,ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性,可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。 2.方案二:急性酒精性肝损伤模型 2.1 原理 机体大量摄入乙醇后,在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化,使三羧酸循环和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。乙醇通过增加甘油三酯合成,减少脂肪氧化,降低肝脏运出脂肪的功能,增加脂肪组织的脂肪动员,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血症。 2.2 实验动物 成年大鼠或小鼠,单一性别,大鼠(180-220克),每组8-12只;小鼠(18-22克),每组10-15只。 2.3 实验方法 2.3.1 剂量和分组 至少设三个剂量组,同时设阴性对照组和模型对照组,必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组,另设两个剂量组,最高剂量不得超过人体推荐量(以公斤计算)的30倍。用无水乙醇(分析纯)造成肝损伤模型,无水乙醇浓度为50%(以纯净水稀释),灌胃量12ml~14ml/kgBW(乙醇密度0.8g/ml,折合乙醇的剂量为4800~5600mg/kgBW)。 2.3.2 给予受试样品的途径和时间 经口灌胃给予受试样品,无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可,并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天. 2.3.3 实验步骤和造模方法 每日经口灌胃给予受试样品,阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次,按体重调整受试样品量。模型对照组和各样品组于实验结束时一次灌胃给予50%的乙醇,小鼠灌胃量12ml/kg BW,阴性对照组给予纯净水,禁食16h。动物腹腔注射60mg/kg BW 的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血,并取肝组织,进行各项指标的检测及病理组织学检查。 2.3.4 检测指标 体重、血清中甘油三酯(TG)、血清中极低密度脂蛋白(VLDL)、肝组织病理学检查(肝细胞脂肪变性)。 2.4 血清中甘油三酯(TG)测定 2.4.1测定方法 推荐采用酶法(GPO-PAP法)。采用用全自动或半自动生化仪测定血清中TG的含量。 2.4.2 数据处理 数据采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值, F值F0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。