药物小分子与血清白蛋白的相互作用 -

毕 业 设 计（综述） 药物小分子与血清白蛋白的相互作用 申请学位：    学士学位      院    系：    药 学 院      专    业：    药    学      姓    名：  　 梅 艳 飞      学    号：  　 122120213    指导老师：    闫 苗 苗      二〇一三年六月一日 目  录 摘要    I Abstract     II 前言    1 1 蛋白质与小分子物质    2 1.1 蛋白质的定义及概述    2 1.2 蛋白质的结构与功能    2 1.3 血清白蛋白    3 1.3.1血清白蛋白的结构    3 1.3.2血清白蛋白的生理功能    4 1.4 小分子物质    5 2 药物小分子与血清白蛋白相互作用的研究    7 2.1 紫外可见吸收光谱(UV-Vis)法    7 2.2 荧光光谱法    7 2.3 圆二色光谱(CD)法    9 2.4 傅里叶转换红外光谱(FT-IR)法    9 2.5 其他研究方法    10 3 药物小分子与血清白蛋白相互作用研究的主要    11 3.1 结合常数和结合位点数的确定    11 3.2 结合位点的确定    12 3.3 作用力类型    12 3.4 药物小分子对蛋白质二级结构的影响    13 4 研究意义及展望    14 参考文献    15 致谢    18 药物小分子与血清白蛋白的相互作用 梅艳飞 摘要:蛋白质是一切生物体内最基本的生命物质，在生物体内发挥着各种与生命活动有关的重要作用。蛋白质是遗传性状的直接表达者。因此，对蛋白质的各种研究是当前生命科学、医药学、化学等领域的前沿和热点。蛋白质是药物的一种非常重要的运输载体。药物与蛋白质的相互作用不仅影响药物在体内的分布，而且还影响药物在体内的代谢与排泄方式，研究药物与蛋白质的结合为药物分子结构与药效之间的关系提供了有利的信息。基于研究生物大分子与药物小分子相互作用的重要意义，本文对前人就这方面的研究成果进行了系统的，以期从中找出未来研究的突破口，从而进一步丰富生物大分子与药物小分子相互作用的研究。 关键词：药物小分子；血清白蛋白；相互作用；研究方法；研究内容 The Interaction of Medicine Small Molecule                      with Serum Albumin MEI Yan-fei Abstract: Protein is the basic composition of all organism, it plays impo- rtant roles in all kinds of life activities. Protein is the expresser of these genetic materials. So, there have been all interesting research field of life sciences, pharmacodynitics and chemistry of it. Protein serves as a trans- port carrier for drugs, the binding of drugs with protein has a great influ- ence not only upon the distribution of the drugs in the body but also upon their patterns of metabolism and excretion. The studies on this aspect may provide information of the structural features that determine the therapeutic effectiveness of drug. On the basis of the previous research, the predecess- ors had a system to its total nodes, but the role of polyamines in mechanism of the current review rarely, the former polyamine research achievements in this field are summarized, with a view to find polyamine future research br- each, so as to enrich the polyamine research. Key Words: medicinal molecules; serum albumin(SA); interactions; resea- rch methods; research content 前  言 生命的奥秘一直是人类孜孜探索的重大问题，从分子水平测定、表征和阐明在生命过程中起作用的各类小分子与生物大分子的相互作用，以及探究这些作用于生物功能之间的关系，其根本目的是探索生命过程的奥秘。 蛋白质（protein）是由氨基酸组成的一类生物大分子，它与核酸等其他生物大分子共同构成生命的物质基础。生物体内蛋白质的种类繁多，单细胞的大肠杆菌就含有3000余种。人体含蛋白质种类多达10万余种，是细胞中含量最丰富的高分子化合物。各种蛋白质都有其特定的结构和功能，在生命活动中发挥着不可替代的作用。对蛋白质与有机小分子的相互作用机理的研究，有助于考察蛋白质的结构和功能与有机小分子的结构和性质之间存在的相关性[1]。 与生命相关的许多外源性小分子、离子等物质都需要通过和蛋白质的相互作用从而起到生物活性功能。研究药物小分子与生物大分子的相互作用，有助于人们对药物与生物大分子相互作用方式及其在体内作用机理的认识和理解，有助于人们进行疗效更好、毒性更低的新药设计和筛选[2]。药物的吸收、分布、代谢及排泄等体内过程，直接影响到药物在其作用部位的浓度和有效浓度的持续时间，从而决定着药物的作用——药理作用和毒性作用的发生、发展和消除。研究多种药物与血浆蛋白(主要是白蛋白)的结合，是药物动力学及临床药理学的重要内容[3]。 国外对小分子与蛋白质相互作用的研究较早，国内化学工作者在这方面的研究也已有数十年的历史[4,5]。近年来，随着现代实验手段的提高，人们采用多种方法从不同角度对药物小分子和蛋白质之间的作用进行了广泛的研究。现在常用手段包括荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色光谱、傅里叶变换红外光谱、电化学方法、激光拉曼光谱、平衡透析法、液相色谱法、X-晶体衍射等，质谱、核磁共振、毛细管电泳激光散射等方法的应用也日益增多。由于蛋白质溶液所处的环境和其体内环境存在一定的差别，无论用何种方法对他们之间的相互作用进行研究，得到的仅仅是一种大致近似的结果，各种方法之间的合理搭配运用，从多方面多角度来研究同一反应体系，也可以得到更多、更详细、更准确的信息。 1 蛋白质与小分子物质 1.1 蛋白质的定义及概述 蛋白质是荷兰科学家格里特在1838年发现的。他观察到有生命的东西离开了蛋白质就不能生存。蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与，蛋白质占人体重量的16.3％，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.8kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例排列组合而成的，并在体内不断进行着代谢与更新。 1.2 蛋白质的结构与功能 蛋白质是由一条或多条多肽链通过各种组合形成的生物大分子。蛋白质的基本结构在三维空间中以非常专一的方式组织结合在一起，构成特定的三维结构，形成功能性蛋白质。蛋白质结构分为一级、二级、三级和四级结构(图1)。一级结构是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。二级结构是指多肽主链原子的局部空间排列，不涉及氨基酸残基侧链的构象，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等主要形式。蛋白质的三级结构系指每一条多肽链内所有原子的空间排布，包括主链、侧链构象内容，是在主链构象二级结构的基础上，由于侧链R基团相互作用，进一步折叠盘曲而成的。蛋白质的四级结构是指各个亚基之间的空间排布及相互接触的关系，结构可以相同，也可以不同。 1973年，Rossman提出了超二级结构(supersecondaty structure)和结构域(struau- re domain)， 两种新的概念目前已被生物化学家及分子生物学家所公认。蛋白质的三级结构的基本单位是结构域。结构域是指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。蛋白质的三级结构是结构域在三维空间结构中以专一的方式组合排列，或者二级结构、结构模体及其与之相关联的各种多肽链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布。较大的蛋白质都有多个区域存在，它们能够以非常不同的方式组合，从而以有限类型的区域结构组合成极为复杂多样的蛋白质整体结构。正是在结构域的基础上，才有可能对蛋白质进行结构分类。结构域同时也是功能单位，不同的结构域常常与蛋白质的不同功能相关联[6]。 根据分子的组成，可将蛋白质分为简单蛋白质和结合蛋白质两大类。简单蛋白质的分子完全由氨基酸构成，如淀粉酶、核糖核酸酶、胰岛素等。结合蛋白质除了含蛋白质成分外，还含有非蛋白质成分(即辅基)，如血红蛋白、核蛋白等。 图1 蛋白质的四级结构图            图2 HSA的X-射线单晶衍射图 蛋白质在生物过程中起着重要的作用，可以简略概括：(1)作为有机体新陈代谢的催化剂——酶：这是最重要的生物学功能，几乎所有的酶都是蛋白质。生物体内的各种化学反应几乎都是在相应的酶参与下进行的；(2)作为有机体的结构成分：在高等动物里，胶原纤维是主要的细胞外结构蛋白，参与结缔组织和骨骼作为身体的支架；(3)贮藏氨基酸；(4)运输功能；(5)协调动作的功能；(6)激素的功能；(7)防御机能。 1.3 血清白蛋白 1.3.1血清白蛋白的结构 血清白蛋白是简单蛋白质中的一种，它是血浆中最为丰富的蛋白质，它的浓度达到了40mg/ml(0.6mM)，占了血浆中所有蛋白总量的60％，提供了80％的血液渗透压[7]，它能与许多内源及外源性化合物结合，从而起到重要的存储和转运作用[8]。 人血清白蛋白(HSA)是由585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，分子量约为66500。HAS肽链含有35个半胱氨酸残基，仅34位有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键中有8对组成交叉二硫键，只有接近N端的是一个单个二硫键，二硫键对维系蛋白质空间结构的稳定性起着重要作用。HSA含有十八个酪氨酸残基，在214位上含有一个色氨酸残基。N端为天冬氨酸残基，C端为亮氨酸残基。 1989年，Carterd小组发表了HSA的低分辨晶体结构[9]，并于1990年进行了一些修正[10]，而后，又于1992年发表了HSA的高分辨晶体结构[11]，从而最终揭开了这一生物大分子的真面目。正像以前的预测一样，HSA分子包括三个结构上相似的功能域(domain Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)(图2)，每个功能域又包含两个相似的螺旋结构的亚域(subdomain A和subdomain B)，六个亚域聚集在一起，形成了一个不对称的心型分子。分子有约67％的螺旋结构，其余则为转角及伸展肽链。 牛血清白蛋白(BSA)是由582个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其氨基酸序列与HSA非常类似[8]。BSA肽链也含有35个半胱氨酸残基，仅34位有一个巯基，其余都为二硫键，二硫键中有8对组成交叉二硫键，只有接近N端的是一个单个二硫键。与HSA不同的是，BSA在134及212位各含有一个色氨酸残基，因此两者的荧光性质略有不同。 另外，由于BSA与HSA的结构相似，二者的氨基酸序列高度相似，且不同氨基酸均为保守性替换，而BSA更价廉易得，故人们常研究药物-BSA的结合情况，作为对HSA结合情况的参考。 1.3.2血清白蛋白的生理功能 血清白蛋白(SA)是血液缓冲系统的组分之一，具有营养作用，是维持血液渗透压的主要组分和运输内源性及外源性物质的重要载体[8]。 血液缓冲剂:与其它蛋白质一样，SA也为两性化合物。白蛋白等电点低于正常血液pH，是弱酸，一部分以酸的形式存在，另一部分与阳离子(主要是Na+)结合成弱酸盐，这两部分形成的缓冲离子对是构成血液总缓冲系统的一部分。 营养作用:在生命活动中，组成组织和器官的蛋白质不断地进行新陈代谢，血浆蛋白质在体内分解产生的氨基酸可参与氨基酸代谢池，用于组织蛋白的合成；白蛋白对细胞营养具有较高的价值，滋养细胞的蛋白质中约有1/3来自肝脏合成的白蛋白；此外，白蛋白还为细胞提供合成其它蛋白质的材料。 维持血浆胶体渗透压和体液交换:正常人血浆渗透压在37℃时，约为7.7个大气压。血浆中蛋白质浓度大于组织液，故具有较高的渗透压，血浆与组织液渗透压差称为血浆的有效渗透压，正常为15mmHg，它有从组织间隙吸收水分进入血循环的作用。在正常人体微循环中，血浆与组织液间不断频繁的交换液体及溶于水的营养物质和代谢产物，在新陈代谢中起重要作用。 运输功能:SA是血浆蛋白质中具有广泛结合能力的蛋白质。能结合内源性和外源性物质，能结合大、中、小分子的化合物，也能同难溶于水和溶于水的物质结合，具有重要的生理意义和临床意义。 白蛋白能与许多化合物结合，可能与它的“构象适应性”有关。在生理条件下，白蛋白的结合部位易变，几乎能以相同能量产生不同的构象。因为它螺旋内的维系力较弱，当与某化合物结合时，螺旋分开，肽链内残基侧链方位改变，导致基团的分布相应变化，新的结合位点随之产生，发生构象变化和协同作用。白蛋白分子表面结构疏松，具有柔性，对其在血浆中作运输和解毒剂极为有利。 1.4 小分子物质 在小分子与SA相互作用的研究中，国内外文献报导涉及的小分子可做如下简要分类：(1)按照来源区分，可分为内源性物质和外源性物质两大类；(2)按照化学类别区分，可分为中性分子、离子；(3)按照功能区分，可分为食品营养成分及添加剂、药物及制剂辅料、蛋白质的变性剂以及测试探针试剂等。 内源性物质:内源物质是泛指生物体代谢的产物，其在生物体内(尤其是在血液循环系统中)的分布、贮存、转运以及进一步的消化等过程都涉及到与SA相互作用。二十世纪四十年代前，人们认为SA只是参与维持血浆渗透压，后来发现脂肪酸(fatty acid，FA)能够与SA结合，从而认识到血液中脂肪酸氧化是一个全新的代谢活性源。FA-SA复合物的晶体结构研究表明，FA结合在由SA分子中极性支链覆盖着的疏水空腔内。此外，氨基酸、胆红素、尿素等各类内源物质与SA的相互作用也有广泛报导。 外源性物质:外源性有机毒物与蛋白质相互作用的研究越来越多。有机毒性物质进入人体后，一部分和SA结合，然后被转运到其它组织部位释放出来，产生危害作用。环境化学污染物与SA相互作用的研究对揭示环境化学污染物在体内蓄积、代谢及危害机理有重要意义。如农药及杀虫剂、毒剂与HSA的相互作用都已有报导。 金属离子:无机离子广泛存在于生物体内并积极参与着各种生命活动，尤其是各类内源和外源金属离子广泛参与甚至是调控着生命活动过程。各类无机离子与蛋白质的相互作用研究已经成为当今化学新兴分支——生物无机化学的主要内容[12]。根据目前文献，与蛋白生物大分子作用的已研究的金属离子可归纳为三类：一是作为营养物质的人体必须的微量元素，如锌、铜、铁；二是对生物体有毒副作用的重金属离子如镉、汞、铅、铝等；三是稀土金属离子如铷、镧离子。研究重金属离子(汞、镉、铬离子等)与蛋白的作用为揭示其危害机理及在生物体内的吸收、分布、蓄积和排泄过程等提供了重要信息。 染料:种类繁多、功能特异的光度显色剂(染料)作为外源性物质与蛋白质分子相结合，形成染料蛋白质复合物，这些复合物又往往能够在特定光波区域有特异性吸收或发射，可对蛋白质、DNA等生物大分子进行快速定量测定。但是到目前为止，蛋白质与普通染料分子间是否以化学计量定量结合、结合方式如何，形成复合物的种类是否单一等问题仍未解决，这些悬而未决的问题一方面制约了蛋白质分子快速定量方法的建立，同时也为该方向的深入研究提供了广泛的空间。因此，关于染料小分子与蛋白质的相互作用研究也是目前所关注的热点之一。 表面活性剂:表面活性剂在食品、化工、制药、化妆品和洗涤剂等领域广泛应用。蛋白质与表面活性剂之间相互作用会显著影响产品的质量，既可能在界面上发生竞争吸附，也可能由于缔合作用导致蛋白质结构的变化[13]。如果表面活性剂进入人体，会刺激人体体重增加，提高肝脏合成胆固醇的速度。因此体外研究表面活性剂与蛋白质的相互作用对表面活性剂的环境效应具有十分重要的意义。目前，表面活性剂与蛋白质相互作用的研究主要集中在两方面：一是探讨相互作用的影响因素及结合等温线的特性[14]；二是探讨蛋白质结构的变化与相互作用的机理，以及这些变化对蛋白质功能的影响[13]。大多数研究是针对离子型表面活性剂，但最近考虑到非离子型表面活性剂与蛋白质混合体系的性质对食品、医药和生物体系具有重要影响，人们对非离子表面活性剂与蛋白质相互作用的研究开始重视。 药物:药物自给药部位进入体内后，通过各种生物膜从血液转移到各组织器官。从现有的认识水平来看，药物进入血液系统后不同程度地与SA结合，形成药物-SA复合物。未结合的药物才能通过毛细血管壁向组织扩散产生药效，最终被肝脏代谢或被肾小管滤过排出体外。药物-SA复合物可以看作是药物在生物体内的暂时贮存形式，可有效避免药物被迅速代谢而消除，从而维持血浆中血药总浓度和有效浓度的持续。药效的发挥直接与药物的游离浓度相关，而生物体对药物毒副作用的耐受也与游离药物浓度直接相关，药物-SA结合也被看作是SA对生物体自我保护功能[15]的重要体现。所以，药物-SA结合直接影响着药物在生物体内的分布、贮存、转运、药效、药物代谢以及毒副作用等方面的性质[8]。 目前文献报导涉及的药物主要有抗癌药物、抗菌素类药物、镇痛药物、精神治疗药物、心血管类药物等。一些药物制剂的辅料、食品成分及添加剂与血清白蛋白相互作用研究也有报导。近年来关于传统中药有效成分甚至中药总提取物与血清白蛋白相互作用已经引起国内外学界和业界的普遍关注。 2 药物小分子与血清白蛋白相互作用的研究方法 近年来，人们采用多种现代实验手段从不同角度对血清白蛋白与药物小分子之间的作用进行了广泛研究。目前常用的方法有：紫外可见吸收光谱法[16,17]、荧光光谱法[18,19]、圆二色光谱法[20]、傅里叶转换红外光谱法[21]、毛细管电泳法[22]、平衡透析法[23]、核磁共振波谱法[24]、微量热法[25-27]、电化学法[28]等。 2.1 紫外可见吸收光谱(UV-Vis)法 蛋白质之所以能产生紫外可见光谱，其主要原因是组成蛋白质常见的20种ɑ-氨基酸中有几种芳香族氨基酸残基的侧链基团和肽键对光的吸收，其中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三个氨基酸残基由于其生色团的不同有不同的吸收光谱，色氨酸和酪氨酸残基中共轭双键在280nm波长处有一个吸收峰，苯丙氨酸在257nm波长附近有一个特征吸收峰。一般来说，氨基酸残基的微环境由蛋白质分子的构象决定，构象改变，微环境改变，生色团的紫外吸收光谱随之发生改变[29]。 当血清白蛋白的生色团所处的微环境发生变化时，其紫外-可见吸收光谱也随之发生变化：吸收峰红移或蓝移，吸光度及谱带亦有变化。变化前后的光谱之差称为差光，利用紫外差光谱可以获得蛋白质的结构信息。一些小分子配体与蛋白质结合后其分子结构会发生一定的变化，相应的会出现一定大小的差光，UV-Vis光谱一般与荧光发射光谱互相补充，研究者通常结合荧光光谱法与紫外光谱法来研究蛋白质与药物是否相互作用，也进一步用紫外差谱法来判断配体对蛋白质内源荧光的猝灭是属于静态还是动态猝灭，这是由于动态猝灭影响到荧光体的激发态，而并不改变荧光物质的吸收光谱；静态猝灭中静态复合物的生成往往导致荧光物质吸收光谱的改变。据此可研究蛋白质与小分子配体间的结合强弱和结合机理。 2.2 荧光光谱法 有些分子吸收一定波长的入射光，经过10-9～10-8秒，能发射较长波长的光，这种光就是荧光。能产生荧光的物质叫做荧光物质。荧光物质分子在吸收不同波长的入射光后，能发射不同波长的荧光，从而产生荧光光谱。蛋白质分子中因含有色氨酸残基、酪氨酸残基及苯丙氨酸残基而具有内源性荧光，它们的荧光峰分别位于348 nm、303 nm和282 nm，不过蛋白质的荧光主要来自色氨酸残基，其贡献了大约95％的蛋白质荧光。在激发波长为280 nm下可以近似的认为蛋白质的荧光全部来自色氨酸残基和酪氨酸残基，且绝大部分来自色氨酸残基[30]。 荧光光谱法是目前研究小分子与生物大分子相互作用最常用的方法之一。在荧光光谱法中，又可以分为荧光猝灭法、荧光增强法、同步荧光法、三维荧光法、荧光偏振法等。 荧光猝灭是指任何可以使得荧光物质荧光强度下降的作用，可分为动态猝灭和静态猝灭，能降低荧光物质荧光强度的物质就称为猝灭剂，因此猝灭剂是相对的。荧光增强主要是给体与受体之间发生了偶极—偶极能量转移，给体荧光被猝灭，受体荧光被敏化。一般来讲，研究小分子与蛋白质相互作用，主要运用的是荧光猝灭法。根据蛋白质与小分子作用的荧光光谱，可以判断出反应所属的猝灭类型，对静态猝灭来说，还可以计算出蛋白质与小分子的结合常数、结合位点数，以及小分子与蛋白质结合的能量转移效率、结合距离等。 许多药物都具有荧光，在加入蛋白质后药物荧光会发生变化，还有一些药物加入到蛋白质溶液中后会使蛋白质荧光增强或有新荧光峰出现，因此可以利用荧光增强来研究蛋白质分子与药物的相互作用，这种方法的优点是光谱干扰较小，可以避免荧光淬灭中自吸收效应以及内滤效应的干扰，所得光谱不需校正。 同步荧光技术是同时扫描激发和发射两个单色器波长，具有选择性好、灵敏度高、干扰少等特点，故常被用来考察小分子对蛋白质构象的影响。当△λ=60nm时所作出的同步荧光光谱只显示色氨酸残基的光谱特性，△λ=15nm时所作出的同步荧光光谱仅显示酪氨酸残基的光谱特性[31]。色氨酸的最大荧光发射峰位对环境很敏感，所处环境的疏水性降低，其最大发射波长红移，所处环境的疏水性增强，其最大发射波长蓝移。若色氨酸的最大发射波长改变，则说明蛋白质的构象发生了变化。 三维荧光光谱是近20年来发展起来的荧光分析新技术[32]。它是以激发波长、发射波长和荧光强度为坐标的三维空间图谱，同时可用强度等高线描述被测组分的分布和浓度，不仅可以提高测量灵敏度和对分子结构的选择性，而且能够更加全面地展现样品的荧光信息，有利于综合考查样品的组分分布及构型变化特征。 荧光偏振法是用偏振光激发荧光样品，使得样品发射偏振荧光。在溶剂粘度可以忽略的情况下，当激发光位于荧光分子主吸收带且没有发生分子间能量损失时，其偏振度与荧光分子的转动速度有关，转动速度越快，荧光偏振就越小，转动速度越慢，荧光偏振就越大。蛋白质分子的内源荧光团的寿命通常比较短，可利用外源荧光团来检测荧光偏振。当外源荧光体分子与蛋白质结合时，其转动受阻，导致小分子转动速度变慢，荧光偏振会随之变大。如果利用蛋白质的荧光来检测偏振，蛋白质与小分子作用后，蛋白质的偏振度降低，说明蛋白质与小分子发生了结合作用。 2.3 圆二色光谱(CD)法 一束平面偏振光进入某些物质并通过该物质传播时，若出射光的偏振面相对于入射光的偏振面旋转了一定的角度，则称这种物质为光学活性物质或“手性”物质。光活性物质的这种使平面偏振光偏振面产生旋转的性质称为光学活性。光活性物质除使入射并通过其传播的平面偏振光的偏振面旋转一定角度(称之为旋光)，还可能存在光吸收各向异性，即它对左旋圆偏振光和右旋圆偏振光吸收率不同，从而使平面偏振光变为椭圆偏振光。光学物质将平面偏振光改变成椭圆偏振光的效应称为“圆二色性”，并可用吸收系数差△ε=εL-εR表示。如果在一定波长范围内下左旋和右旋偏振光的△ε的连续变化并对波长作图，就可以得到该物质的圆二色谱(circular dichroism，CD)。 蛋白质具有多个手性中心分子。在蛋白质或多肽中，主要的光活性是肽链骨架中的肽键，芳香氨酸残基及二硫键。蛋白质的CD光谱一般分为两个波长范闱，即178-250nm为远紫外区CD光谱，250-320 nm为近紫外区CD光谱。远紫外区CD光谱反映肽键的圆二色性，即生物大分子主链的构象信息，包括ɑ-螺旋：在205-235nm范围内有双负峰，峰项分别位于约208和222nm处，称为双槽曲线；β-折叠：在216nm处有一负峰；无规则卷曲：200nm附近的负峰是其特征曲线[33]。近紫外圆二色谱作为一种灵敏的光谱探针，可反映蛋白质中二硫键、芳香氨基酸残基微环境的变化。如二硫键在250-260nm有一个峰；色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸这三种残基的三个侧链的吸收峰在230-310nm之间。研究白蛋白主要用远紫外圆二色光谱谱图的变化。在蛋白质与配体相互作用时，通过CD光谱的变化，就可探知血清白蛋白的二级结构的构象变化。 2.4 傅里叶转换红外光谱(FT-IR)法 FT-IR法是指在红外波段(10000-10cm-1)的吸收光谱，它作为研究药物与蛋白质相互作用的一种新方法，其突出的优点是适用于不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白质和多肽的测定。FT-IR法的形成是以分子的振动为基础，这些振动(包括化学键的伸缩、扭曲、旋转等)能定位到分子中特殊的键和基团。与生物化学有关的键和基团主要包括C=O、-COOH、COO-、O-H、S-H等，许多振动模型并不是由单一键和基团的振动形成，而是由许多邻近键的叠加而形成。 FT-IR可以用于研究多肽和蛋白质分子的二级结构，能在不同条件下提供二级结构有价值的信息，因此在药物-蛋白质的结合研究中应用较多。Xie等[34]利用FT-IR法对总三七皂甙(TPNS)与HSA的相互作用进行了研究，认为TPNS-蛋白复合物造成了多肽链的氢键网络的重排，最终导致了ɑ-螺旋结构的减少。Xie等[35]还利用FT-IR技术对黄烷酮化合物与HSA的相互作用进行了研究。 2.5 其他研究方法 在小分子物质与蛋白质相互作用的研究方法中，还有其他一些常用的方法，如毛细管电泳法(CE)、平衡透析法(ED)、核磁共振(NMR)、电化学法等。 毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以电场为驱动力驱动离子或荷电粒子，按其淌度或分配系数不同进行分离的一种新型液相分离分析技术。CE的不同形式包括亲和毛细管电泳，毛细管亲和凝胶电泳或利用蛋白质固定相的毛细管电色谱。它具有分离能力强、分离速度快、应用范围广、消耗试剂量小等优点。但由于需要解决生物大分子与管壁的吸附问题，限制了该方法的应用。 平衡透析法(ED)是研究小分子与生物大分子结合平衡的经典方法，其是依靠半透膜将与生物大分子结合的小分子与游离的小分子分离。小分子与生物大分子形成的复合物被保留在透析袋内，而游离的小分子可以在半透膜内外自由穿过，直到半透膜内外的小分子浓度达到平衡。通过检测小分子化合物的手段可以获得小分子与生物大分子的结合强度。在诸多实验方法中，ED法虽然操作复杂且费时，但因它可以直接得到游离小分子的浓度，从而被认为是较准确的方法。 核磁共振(NMR)已经成为研究小分子和生物大分子相互作用的一种非常重要的手段。在外磁场中，磁矩不为零的原子核吸收一定波长（0.6~300m）的无线电波后而发生核自旋能级的跃迁现象称为核磁共振。在配体与受体发生作用时，许多NMR参数将发生变化，这就是NMR能用于药物与生物大分子相互作用研究的主要原因。NMR可用多种方法测定，如化学位移变化、线宽变化、转移NOE及脉冲梯度场实验等。这些方法可以分为检测生物大分子信号和检测配体信号。Sulkowaska等[36]研究了阿糖胞苷、阿斯匹林与牛血清白蛋白的相互作用，研究表明在阿斯匹林存在下可使阿糖胞苷与牛血清白蛋白的亲和力减弱。 电化学方法比较适用于一些吸收光谱比较弱，或由于其电子跃迁谱带发生重叠而无法用紫外可见吸收光谱等方法来研究的分子，尤其是对于一些主要通过静电结合模式与DNA作用的分子。李红等[37]采用循环伏安法、微分脉冲伏安法、交流阻抗数据拟合技术研究了Co(phen)33+配合物与DNA相互作用，确定作用方式为部分插入。赵洁等[38]用微分脉冲伏安法、UV-电化学法研究了紫杉醇对柔红霉素与DAN作用的影响。 3 药物小分子与血清白蛋白相互作用研究的主要内容 蛋白质与小分子物质作用后生成超分子复合物，体系中蛋白质或者小分子物质的浓度、光谱、电化学等性质发生改变，通过适当的分析方法，测定作用前后不同参数的变化值，可以获得结合常数、结合位点数、结合位点、作用力类型以及小分子对蛋白质二级结构的影响等信息。 3.1 结合常数和结合位点数的确定 确定小分子与生物大分子之间相互作用的结合常数与结合位点数，常用的有以下几种方法： 1. Scatchdrd方程 Scatchdrd等[39]将小分子配体与大分子结合看作是小分子配体与大分子特定部位的结合，在此基础上推导了溶液平衡处理的经典理论公式即Scatchdrd方程，其具体形式为： r/cf  = nK-rK                         (1) 式中，r为每个蛋白质分子键合的药物分子的个数，cf游离药物的浓度，n为结合位数，K为结合常数。以r/cf对r作图，可得到n、K的值。若反应存在多种结合部位，上式变为： r =Σni Ki cf /(1+Ki cf)                 (2) 通过非线性拟合，可计算n、K，n、K分别表示结合位数和第i的结合常数。 Seatehard作图法是研究生物大分子与有机小分子结合反应的经典方法。此法在应用时须知道反应体系中游离态药物的浓度，这一点用荧光法测定时常不易做到，而且Seatehard作图法所得结果往往不理想，因此，在研究药物分子与蛋白质的结合反应中，Seatchard作图法应用不多。 2. Stern-Volmer方程[39] 当猝灭剂分子与血清白蛋白结合时，血清白蛋白的内源性荧光会因猝灭分子浓度的增加发生有规律的猝灭，对于动态猝灭，可根据Stern-Volmer方程来加以计算出猝灭常数： F0／F = l+Kq τ0 Cq = l + Ksv Cq                        (3) 式中F0是不加猝灭剂时血清白蛋白的荧光强度，F为当加入的猝灭剂浓度为Cq时血清白蛋白的荧光强度，Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命，Cq为猝灭剂浓度，Ksv为猝灭常数。对于静态猝灭，当血清白蛋白与小分子发生l：l的结合时，可以推导出公式： F0 /( F0- F ) = 1/{[Q] f K}+1/ f              (4) 式中F0为不存在猝灭剂时的荧光强度，F0-F为加入猝灭剂后荧光强度的变化，K为结合常数，[Q]为猝灭剂浓度，f为荧光体的荧光被猝灭的分数。以F0 / ( F0-F )对[Q]-1作图，得直线的斜率为(f K )-1，截距为1/ f ，因此可以求得结合常数K。