血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义

血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义 摘要同型半胱氨酸是人体内含硫氨基酸的一个重要的代谢中间产物,可能是动脉粥样硬化等心血管疾病发病的一个独立危险因子。血浆中同型半胱氨酸含量与遗传因素、营养因素、雌激素水平、年龄因素等有关,与同型半胱氨酸代谢有关的N5N10-亚甲基四氢叶酸还原酶和胱硫醚-β-合成酶的基因突变,酶活性下降,也可引起高同型半胱氨酸血症。同型半胱氨酸的测定方法有:气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法(HPLC)、全自动的荧光偏振免疫测定(Fluorescence polarization immunoassay FPIA)、高效毛细管电泳法。HPLC最常用,而高效毛细血管电泳最有发展前途。 同型半胱氨酸(homocysteine, hCY)是一种人体内的含硫氨基酸,为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物,其本身并不参与蛋白质的合成。近年来,国内外许多学者均认为血液同型半胱氨酸含量升高已成为动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子,遂成为基础医学和临床医学研究的新热点。本文综述血液同型半胱氨酸的测定方法及临床意义。 1 同型半胱氨酸的代谢过程 1.1 人体内同型半胱氨酸是蛋氨酸脱甲基后的产物,蛋氨酸是重要的“一碳单位”供体,蛋氨酸在S-腺苷蛋氨酸合成酶崔化下与ATP结合生成S-腺苷蛋酸(SAM),SAM在供出甲基后,水解生成同型半胱氨酸和腺苷。相反,体内的同型半胱氨酸在蛋氨酸合成酶的作用下,以维生素B12为辅助因子,接受N5-甲基四氢叶酸携带的甲基,再形成蛋氨酸。此反应必须有N5-甲基叶酸作为甲基的供体,N5-甲基四氨叶酸是四氢叶酸经N5N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methyleneterahydrofolatereductase mTHFR)催化而产生的。同型半胱氨酸另一代谢途径是在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-beta-synthase cBS)催化下,与丝氨酸缩合成胱硫醚。因此,血浆同型半胱氨酸浓度的升高与遗传因素和营养因素有关,MTHFR和CBS基因发生突变,导致酶活性降低,产生高同型半胱氨酸血症。 1.2 人MTHFR基因定位在lp36.3上,cDNA全长约 2.2kb,大鼠的MTHFR基因的cDNA 与人MTHFR基因有85%同源性。人MTHFR基因有多个等位基因,经流行病学,纯合子与高同型半胱氨酸血症之间呈现很强相关性。Frosst等应用PCR-SSCP分析证明MTHFR 基因在667位发生的突变与心血管疾病密切相关。由于T代替了C,编码的氨基酸已由缬氨酸代替了丙氨酸,而缬氨酸可能与MTHFR活性中心密切相关,MTHFR酶活性大大降低。 1.3 CBS是一个63kD均一四聚体蛋白,定位于染色体21q2 2.3,可编码551个氨基酸,目前已鉴定出33个突变位点,与心血管疾病可能有关的是位于287密码子T283c,由编码的异亮氨酸代替了苏氨酸。另一个突变位点为307密码子上的G919A,由编码的甘氨酸取代丝氨酸。CBS这两个位点的突变均可使CBS酶活性降低,发生高同型半胱氨酸血症。 2 血液中的同型半胱氨酸 2.1 由于氨基酸分析仪器的灵敏度限制,过去一般认为血液中不存在同型半胱氨酸。Wicken等首先报道,男性血浆中同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物总量为 3.3±0.8μmol/L,女性为2.4±0.7μmol/L,男性显著高于女性。他们使用磺基水杨酸沉淀蛋白质,层析用离子交换柱,氨基酸分析仪进行测定。还发现,血浆同型半胱氨酸水平受雌激素水平、高脂饮食、维生素B12。叶酸缺乏、年龄等因素的影响较大。 2.2 wu等发现正常人和高同型半胱氨酸血症患者血浆中,同型半胱氨酸大部分是与蛋白质结合,可达70%,血浆中与同型半胱氨酸结合的蛋白是白蛋白。动物试验和人体试验明,半胱氨酸不能取代同型半胱氨酸在血浆白蛋白上的结合位点,可能原因是同型半胱氨酸有更大的亲和力。同型半氨酸在血液中的存在方式是,部分以同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫 化物存在,微量以还原型同型半胱氨酸存在,大部分可能通过二硫键与白蛋白结合而存在。当血浆被有机酸沉淀蛋白质时,结合的同型半胱氨酸也被沉淀下来,测定上清液所得的称为游离同型半胱氨酸,游离半胱氨酸加上与白蛋白结合的同型半胱氨酸称为总同型半氨酸。血浆标本的处理方式也使游离和结合的同型半胱氨酸重新分配。在较高温度放置,游离同型半胱氨酸很快与血浆白蛋白结合,血浆在-20℃储存几周后,大部分都变成结合型同型半胱氨酸,只能检测到极少量游离同型半胱氨酸。 3 同型半胱氨酸测定方法 同型半胱氨酸在血浆中以多种形式存在,标本的采集和处理方式显得非常重要。通常要求血液标本采取后要尽快分离血浆,制成无蛋白滤液,所有操作尽可能在4℃进行。无蛋白滤液在-20℃一般可保存数月。可以检测三种不同的同型半胱氨酸组分:还原型同型半胱氨酸,氧化型同型半胱氨酸即同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物占10%~20%,及结合型同型半胱氨酸(>70%)。为了准确测定,在分析前应加入巯基试剂如二硫苏糖醇(DTT)、硼氢化钠等打开二硫键。 3.1 stabler等首先报道气相色谱-质谱联用测定血浆中总同型半胱氨酸、总半胱氨酸和蛋氨酸。所用的仪器为HP5992B气相色谱-质谱仪,标本的处理过程包括:先加入三种内标[D.L-3,3,3′,3′,4,4,4′,4′-2H8]同型胱氨酸,[D.L-3,3,3′,3′-2H4]胱氨酸和L-[甲基-2H3]蛋白酸,然后加EDTA-Na2和β-巯基乙醇100℃15min,再以磺基水杨酸沉淀蛋白,上清液用离子交换柱预处理,氮气吹干后,用水重新溶解,进行衍处理后上样。气相色谱仪进行温度250℃,毛细血管柱箱温度180℃,以8℃/min速度升温至276℃,柱前端压力为26psi,以保留时间和质谱进行定性和定量。此法操作十分复杂,耗时长,仪器设备要求高,现除了在某些专门的实验进行测定外,普及很困难。 3.2 氨基酸分析仪和高效液相色谱法(HPLC)这两种方法都属色谱分离技术,HPLC由于其分离的高效率和检测方式灵敏而更常用一些。HPLC根据所用的色谱柱(反相柱或离子交换柱)、衍生方式(柱前或柱后衍生)、检测方式(紫外或荧光)又分为多种测定方法。其中以Fiskerstrand等报道的方法较有代表性。血液标本以EDTA-Na2抗凝,0℃~4℃,2000g 离心5min,碘基水杨酸沉淀蛋白质,上清液再与NaBH4溶液反应,还原二硫键,衍生化试剂为0.025mol/L的Monobromobimane,反应3min后以冰醋酸终止反应。20μl衍生后的样本进入一根150mm× 4.6mm oDS柱。色谱柱预先以Ph3.5的硝酸铵缓冲液平衡,用含有乙腈的流动相进行梯度洗脱。用荧光检测器激发波长365nm,发射波长475nm检测。在此条件下,半胱氨酸、同型半胱氨酸的保留时间分别为8min和10.5min。衍生化和色谱条件稍加改变之后也可用于尿标本的测定。此方法灵敏度高,能分离、分析血液中存在的多种含硫氨基酸。 3.3 shipchandler等报道了全自动的荧光偏振免疫测定(Fluorescence polarizationimmunoasssay FPIA)是通过竞争性免疫反应来测定血浆中同型半胱氨酸。血浆标本并不沉淀蛋白质,直接加入巯基试剂DTT,再加荧光素标记的同型半胱氨酸,标记的同型半胱氨酸分子较小,能在溶液中进行旋转运动,受偏光激发光照射后所发出的光不具有偏光性,荧光偏光度下降。当标记的同型半胱氨酸与相应抗体结合后,抑制了旋转运动,用偏光激发光照射,发出的荧光具有偏光性,荧光偏光度增大。样品中同型半胱氨酸与标记同型半胱氨酸竞争结合抗体,如果样品同型半胱氨酸越多,抗体与标记同型半胱氨酸结合就越少,游离标记物增多,荧光偏光度下降。此法需要专门的荧光偏光免疫检测仪。美国Abbot 公司已有专门的FPIA同型半胱氨酸的检测试剂盒,配合使用Abbot imx系列FPIA分析仪,简便快速。 3.4 高效毛细血管电泳法分析测定血液中硫氨酸及代谢产物如同型半胱氨酸,同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物、蛋氨酸及胱硫醚等。高效毛细血管电泳法快速测定血液中的游离氨基酸已经报道。我们在此研究基础上,摸索适宜的分离条件,同时分离、分析血液中多种含硫氨酸及其代谢产物,目前国内外均没有文献报道。与传统的反相高效液相色谱相比,高效毛细血管电泳是近年来发展的一项高效分离、分析技术,一般30min内即可完成一次分析,试剂消耗量少,重复性好,是一项十分有前途的分析方法。 4 血液同型半胱氨酸浓度变化的临床意义 4.1 本世纪60年代末期,一些学者注意到患有遗传性高胱氨酸尿症的病人,大多数伴有亚临床心血管病。1976年,Wichen等通过流行病学调查提出同型半胱氨酸是心血管病人一个独立危险因素,但一直未受到人们重视。近年来,通过分子水平研究同型半胱氨酸在心血管发病中的作用已重新引起人们的关注。动物试验表明,应用3%蛋氨酸饮食长期喂养家兔,诱发同型半胱氨酸血症。家兔血中甘油三酯、游离脂肪酸、脂质过氧化物含量均明显升高,病理检查表明主动脉脂肪大量沉积,并发生动脉粥样硬化。Glueck等报道,他们对482例高血脂病人进行分析,18例患者同时伴有血浆同型半胱氨酸含量升高。其中13人患有动脉粥样硬化,发病率为72%,远高于血浆同型半胱氨酸含量正常的高血脂患者。在18例高同型半胱氨酸血症患者的直系亲属中动脉粥样硬化的发病率可达78%。目前关于高同型半胱氨酸血症诱发动脉粥样硬化的机制尚不了解。可能有多方面因素起作用。田学军等报道,同型半胱氨酸可以促进大鼠血管平滑肌细胞增殖,诱导血管平滑肌细胞中新的mRNA生成。另外,同型半胱氨酸可以抑制内皮细胞增殖,促进氧自由基的生成,加速低密度脂蛋白的氧化,并可激活血小板的粘附和聚集。总之,同型半胱氨酸是诱发心血管疾病的一个独立危险因素。 4.2 其他一些疾病,如肾功能障碍患者常伴有血同型半胱氨酸含量升高,机制未明。机体缺乏维生素B12、叶酸也会引起血同型半胱酸含量升高,但给予维生素B12、叶酸一般能取得较好的疗效。