DNA甲基化PCR引物的设计

DNA甲基化PCR引物的 2010-08-03 12:01 DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生[1]。目前,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究DNA甲基化最为常用且准确度较高的方法之一,而理想的引物设计则是其成功的关键因素之一。国外互联网上有1个提供免费在线引物设计程序“MethPrimer”,它能够预测CpG岛,根据实验者要求设计硫化测序PCR(bisulfate-sequencing PCR, BSP)和甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物。本研究旨在介绍甲基化特异性PCR引物设计的原则及“MethPrimer”设计程序的和有关注意事项。 1　材料与方法 1. 1　序列的转换 DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的“C”转化为“U”,通过随后的PCR,将“U”转化为“T”,但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化,因此,根据经亚硫酸氢盐处理的DNA设计引物时,先输入感兴趣的DNA序列,程序将会显示2种序列:一种是输入的源DNA序列;另一种是硫化处理后的DNA序列,除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的“C”都转换成了“T”,根据转化后的序列设计引物,进行BSP和MSP。 1. 2　CpG岛的预测[2] 哺乳类动物基因组中5% ~10%是CpG(二核苷酸),其中70% ~80%呈甲基化状态,称为甲基化的CpG(mCpG)。CpG的聚集称CpG岛,已知在所有管家基因和一些组织特异基因的5′端调控区均有CpG岛呈高度甲基化,基因组中平均100个bp有1个跨度为0. 5~5 kb的CpG岛。 “MethPrimer”设计程序默认的CpG岛跨度至少为200 bp,GC含量>50%,CpG出现频率>0. 6。因此,符合这些参数的区域都默认为CpG岛,我们根据任意1个CpG岛设计引物进行扩增。 1. 3　BSP的引物设计原则 标准的PCR引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准PCR的一些参数外,“MethPrimer”应用3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的Tm区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C”都被转换成“T”,所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为8个,而其他碱基重复数为5个。 DNA的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG的“C”区域作为源序列,设计引物。对于BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不应含有CpG位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG位点。 1. 4　MSP的引物设计原则[3,4] 对于MSP需要设计2对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的DNA为模板的PCR扩增甲基化的DNA;根据非甲基化的DNA为模板的PCR扩增非甲基化的DNA。MSP引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的3′端至少包含1个CpG位点,我们可以自己设定CpG的“C”距3′末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为3,即是在引物的最后3个碱基中,至少有1个是CpG的“C”。②引物序列中应包含尽可能多的CpG位点。③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的CpG位点。如果,2对引物不在相同的CpG位点退火, PCR结果就不能准确反映样本DNA甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基化引物长,因为受Tm值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致GC含量降低,从而引起Tm降低。④2套引物应有相近的Tm值,“MethPrimer”中默认2套引物Tm值相差不超过5℃,这种限制可使2个PCR反应在同一PCR仪中进行。 2　结果 2. 1　MethPrimer设计的BSP引物 我们运用人雌激素受体β(ERβ)启动子序列(AF191544)来设计硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR, BSP)引物。首先进入免费在线引物设计程序“MethPrimer”(http: //www. uro-gene. org/methprimer/),点击“Go to MethPrimer”,进入“MethPrimer-Design Primers forMethylation PCRs”网页(http: //www. urogene. org/methprimer/index1. html),在网页的方框内输入ERβ启动子序列,选择“Pick primers forbisulfite sequencingPCR or restriction PCR”,其他参数选择程序默认值,也可根据实验需要加以限制,然后点击“Submit”键,“MethPrimer”软件即可显示预测的ERβ启动子序列的CpG岛及引物的相应位置,同时也显示设计的BSP引物有5组,我们可选择1组引物进行PCR(表1),通常情况下选择第1组引物,进行PCR。如果所选择的引物PCR效果不佳,可选择其他几组引物,也可优化PCR反应条件,或者是更改BSP引物设计参数,重新设计引物。 表1　M ethPrim er软件设计的ERβ启动子的BSP引物引物 起始 　大小　Tm(℃) GC含量 　引物序列(5′→3′)(bp) 　(bp) 　(% )1　上游引物　1 163 　25 57.94 56.00 ATATTTTATTAAGTTGGGGGAATTG下游引物　1 370 　25 58.26 64.00 ACCCTCAAAAAATCACTAAAAAAAC2　上游引物　1 163 　25 57.94 56.00 ATATTTTATTAAGTTGGGGGAATTG下游引物　1 377 　25 59.47 56.00 ATTCTCAACCCTCAAAAAATCACTA3　上游引物　1 163 　25 57.94 56.00 ATATTTTATTAAGTTGGGGGAATTG下游引物　1 365 　25 56.92 56.00 CAAAAAATCACTAAAAAAACCTTTC4　上游引物　1 152 　25 59.06 60.00 GGGTGAGGGGAATATTTTATTAAGT下游引物　1 377 　25 59.47 56.00 ATTCTCAACCCTCAAAAAATCACTA5　上游引物　1 161 　26 58.32 53.85 GAATATTTTATTAAGTTGGGGGAATT下游引物　1 370 　25 58.26 64.00 ACCCTCAAAAAATCACTAAAAAAAC 2. 2　MethPrimer设计的MSP引物 输入ERβ启动子序列,选择“PickMSP primers”,其他参数选择程序默认值,点击“Submit”,“MethPrimer”软件即可显示预测的ERβ启动子序列的CpG岛,及引物的相应位置,同时也显示设计的MSP引物,有5组引物,每组分别有甲基化引物、非甲基化引物,我们可选择1组引物进行PCR(表2),通常情况下选择第1组引物,进行PCR,如果所选择的引物PCR效果不佳,可选择其他几组引物,也可优化PCR反应条件,或者是更改MSP引物设计参数,重新设计引物。 表2　M ethPrim er软件设计的ERβ启动子的M SP引物引物 　起始　大小 Tm(℃)　GC含量 引物序列(5′→3′)(bp)　(bp) (% )1　上游甲基化引物 1 406　25 58.99 64.00　TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 571　23 59.46 65.22　ACCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物　1 409　24 55.40 66.67　TTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物　1 572　24 59.01 62.50　AACCAATCTAAAAACCACACTTCA2　上游甲基化引物 1 406　25 58.99 64.00　TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 570　22 58.67 63.64　CCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物　1 409　24 55.40 66.67　TTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物　1 572　24 59.01 62.50　AACCAATCTAAAAACCACACTTCA3　上游甲基化引物 1 406　25 58.99 64.00　TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 569　23 58.36 60.87　CAATCTAAAAACCACACTTCGAA上游非甲基化引物　1 409　24 55.40 66.67　TTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物　1 572　24 59.01 62.50　AACCAATCTAAAAACCACACTTCA4　上游甲基化引物 1 406　25 58.99 64.00　TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 571　23 59.46 65.22　ACCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物　1 408　25 56.22 68.00　GTTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物　1 572　24 59.01 62.50　AACCAATCTAAAAACCACACTTCA5　上游甲基化引物 1 406　25 58.99 64.00　TTGTTATTTTAGGGTTCGAGGTTAC下游甲基化引物 1 571　23 59.46 65.22　ACCAATCTAAAAACCACACTTCG上游非甲基化引物　1 407　26 58.51 65.38　TGTTATTTTAGGGTTTGAGGTTATGT下游非甲基化引物　1 572　24 59.01 62.50　AACCAATCTAAAAACCACACTTCA 3　讨论 引物的成功设计对于PCR是至关重要的,硫化反应促使DNA链中的“C”转化为“U”,导致GC含量降低,使PCR反应后在序列中出现长的连续“T”,容易引起DNA链的断裂[5, 6]。此外,纯化过程中的DNA的丢失,也是要考虑的另一个因素,这些因素又会影响下面的PCR的进行,这些都是设计PCR引物时需要考虑的。 一般情况下, PCR产物的长度大于300 bp时,就很难以硫化DNA为模板进行扩增。因此,“MethPrimer”程序设计PCR产物的长度在100~300 bp, 200 bp的长度比较合适。与标准PCR不同的是甲基化PCR引物的长度,甲基化PCR一般需要更长的引物,引物长度在30 bp左右,原因是硫化降低了模板DNA的GC含量,使序列中出现长的连续“T”,导致很难选择具有合适的Tm值及稳定的引物;另一方面,为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的DNA,需要引物有足够数量的“C”,这些都增加了选择稳定引物的困难。因此,为了获得更稳定的双链,选择更长的引物是有必要的,因为DNA的Tm值取决于引物的长度[7]。一般情况下,甲基化PCR引物的长度在20~30 bp。“MethPrimer”默认的引物长度在20~30 bp, 25 bp为最适长度。 “MethPrimer”在设计引物时,不考虑输入序列中的重复元件和载体序列。因为,对于DNA甲基化的研究,我们一般注重有特点的序列或者序列中确定的区域,大部分这些序列或区域是启动子序列,因此载体序列不考虑;另一方面,输入的序列由程序模拟硫化处理发生了转化,这样重复的元件不再重复了,即使是引物位置所在的序列在转化前是重复序列,也不会影响引物的质量。 总之,“MethPrimer”是一个特异性的针对硫化PCRs(BSP和MSP)设计引物的程序,其操作简便、快速、准确,对于研究DNA甲基化是一个至关重要的工具。目前,“MethPrimer”正在进一步地发展和完善,使它可以设计出更多其他的硫化PCRs的引物。 关键词:甲基化; PCR 中图法分类号:R394-33 　文献标识码:B 参考文献:[1] PaulsenM, Ferguson-SmithA C. DNAmethylation in genomic imprinting, development, and disease[J]. JPatho,l 2001, 195(1): 97-110. [2] Ribeiro-Filho LA, Franks J, SasakiM,et al. CpG hypermethylation ofpromoter region and inactivation ofE-cadherin gene in human bladder cancer[J]. MolCarcinog, 2002, 34(4): 187-198. [3] LiLC, YehC C, NojimaD,etal. Cloning and characterization ofhuman estrogen receptor beta promoter[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 275(2): 682-689. [4] LiL C, ChuiR, NakajimaK,etal. Frequentmethylation of estrogen receptor in prostate cancer: correlation with tumor progression[ J].CancerRes, 2000, 60(3): 702-706. [5] RychlikW. Priming efficiency in PCR[J]. Biotechniques, 1995, 18(1): 84-86, 88-90. [6]高丽莉,胡义德,刘洪旗.石蜡包埋组织中DNA甲基化特异性PCR技术[J].第三军医大学学报, 2006, 28(18): 1915-1917. [7] Rozen S, SkaletskyH. Primer3 on theWWW forgeneralusers and for biologistprogrammers[J]. MethodsMolBio,l 2000, 132: 365-386.