药物非临床药代动力学研究技术指导原则

附件5 药物非临床药代动力学研究技术指导原则 一、概述 非临床药代动力学研究是通过体外和动物体内的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, 简称ADME）的过程和特征。 非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。在药物制剂学研究中，非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据。在药效学和毒理学评价中，药代动力学特征可进一步深入阐明药物作用机制，同时也是药效和毒理研究动物选择的依据之一；药物或活性代谢产物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础，可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据。在临床试验中，非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床试验给药提供有关参考信息。 本指导原则是供中药、天然药物和化学药物新药的非临床药代动力学研究的参考。研究者可根据不同药物的特点，参考本指导原则，科学合理地进行试验设计，并对试验结果进行综合评价。 本指导原则的主要内容包括进行药物非临床药代动力学研究的基本原则、试验设计的总体要求、生物样品的测定方法、研究项目（血药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性及转运体的影响）、数据处理与分析、结果与评价等，并对研究中其他一些需要关注的问题进行了分析。附录中描述了生物样品分析和放射性同位素标记技术的相关方法和要求，供研究者参考。 二、基本原则 进行非临床药代动力学研究，要遵循以下基本原则： （一）试验目的明确； （二）试验设计合理； （三）分析方法可靠； （四）所得参数全面，满足评价要求； （五）对试验结果进行综合分析与评价； （六）具体问题具体分析。 三、试验设计 （一）总体要求 1. 受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较长时，应考察配制后体积是否存在随放置时间延长而膨胀造成终浓度不准的因素。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。 化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。 在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。 化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。 2. 试验动物 一般采用成年和健康的动物。常用动物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、小型猪和猴等。动物选择的一般原则如下: 2.1  首选动物：在考虑与人体药代动力学性质相关性的前提下，尽可能选择与毒理学和药效学研究相同的动物。 2.2  尽量在动物清醒状态下进行试验，最好从同一动物多次采样获取药代动力学参数。 2.3  创新性药物应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物（如犬、小型猪或猴等）。其他药物，可选用一种动物，建议首选非啮齿类动物。 在动物选择上，建议采用体外模型比较动物与人代谢的种属差异性，包括代谢反应类型的差异和代谢产物种类及量的差异。通过比较，选取与人代谢性质相近的动物进行非临床药代评价；同时尽可能明确药物代谢的研究对象（如：原形药物、原形药物与代谢产物、或几个代谢产物同时作为药代动力学研究观察的对象）。 2.4  经口给药不宜选用兔等食草类动物。 3. 剂量选择 动物体内药代动力学研究应设置至少三个剂量组，低剂量与动物最低有效剂量基本一致，中、高剂量按一定比例增加。不同物种之间可根据体表面积或药物暴露量进行剂量换算。主要考察在所设剂量范围内，药物的体内动力学过程是属于线性还是非线性，以利于解释药效学和毒理学研究中的发现，并为新药的进一步开发和研究提供信息。 4. 给药途径 所用的给药途径和方式，应尽可能与临床用药一致，也要兼顾药效学研究和毒理研究的给药途径。 （二）生物样品的分析方法 生物样品中药物及代谢产物的分析方法包括色谱法、放射性同位素标记法和微生物学方法等。应根据受试物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和色谱-质谱联用法（如LC-MS，LC-MS/MS，GC-MS，GC-MS/MS方法）。在需要同时测定生物样品中多种化合物的情况下，LC-MS/MS和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优势。 对于前体药物或有活性（药效学或毒理学活性）代谢产物的药物，以及主要通过代谢从体内消除的药物，建立生物样品分析方法时应考虑测定原形药和主要代谢产物，考察物质平衡（Mass Balance），阐明药物在体内的转归。在这方面，放射性同位素标记法和色谱-质谱联用法具有明显优点。 应用放射性同位素标记法测定生物样品可配合色谱法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难以用上述的检测方法，可选用其他方法，但要保证其可靠性。 方法学验证（Validation）是生物样品分析的基础。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品分析，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。应通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究，对建立的方法进行验证。制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保生物样品分析数据的可靠性。 本指导原则提供了生物样品分析方法的基本要求［见附录（一）］，研究时可根据药物特点及分析方法的具体类型进行选择。 （三）研究项目 1. 血药浓度-时间曲线 1.1  受试动物数：以血药浓度-时间曲线的每个采样点一般不少于5个数据为限计算所需动物数。建议受试动物采用雌雄各半。对于单一性别用药，可选择与临床用药一致的性别。 1.2  采样点：采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若采样点过少或选择不当，得到的血药浓度-时间曲线可能与药物在体内的真实情况产生较大差异。给药前需要采血作为空白样品。为获得给药后一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和消除相。对于吸收快的血管外给药药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在Cmax附近需要3个时间点，尽可能保证Cmax的真实性。整个采样时间应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。为保证最佳采样点，建议在正式试验前进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。同时应注意采血途径和整个试验周期的采血总量不影响动物的正常生理功能和血液动力学，一般不超过动物总血量的15％~20%。例如，每只大鼠24 h内采血总量不宜超过2 mL。在采血方式上，同时也要兼顾动物福利（Animal welfare）。 1.3  口服给药：一般在给药前应禁食12小时以上，以排除食物对药物吸收的影响。另外在试验中应注意根据具体情况统一给药后禁食时间，以避免由此带来的数据波动及食物的影响。 1.4 多次（重复）给药 对于临床需长期给药或有蓄积倾向的药物，应考虑进行多次（重复）给药的药代动力学研究。 多次给药试验时, 一般可选用一个剂量(有效剂量)。 根据单次给药药代动力学试验结果求得的消除半衰期，并参考药效学数据, 确定药物剂量、给药间隔和连续给药的天（次）数。 1.5  血药浓度测定 按照已验证的分析方法，对采集的生物样品进行处理及分析测定，获得各个受试动物的各采样点的血药浓度数据。 生物样品的处理应与分析方法验证中的处理方法一致。 1.6  药代动力学参数 根据试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间数据，求得受试物的主要药代动力学参数。静脉注射给药，应提供消除半衰期（t1/2）、表观分布容积（Vd）、血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、清除率（CL）等参数值；血管外给药，除提供上述参数外，还应提供峰浓度（Cmax）和达峰时间（Tmax）等参数，以反映药物吸收、消除的规律。另外，应提供统计矩参数，如: 平均滞留时间（MRT）、AUC(0-t)和AUC(0-∞)等，对于描述药物药代动力学特征也是有意义的。 1.7  应提供的数据 1.7.1  单次给药 各个受试动物的血药浓度-时间数据及曲线和各组平均值、标准差及曲线。 各个受试动物的主要药代动力学参数及各组平均值、标准差。 对受试物单次给药非临床药代动力学的规律和特点进行讨论和评价。 1.7.2  多次（重复）给药 各个受试动物首次给药后的血药浓度-时间数据及曲线和主要药代动力学参数及各组平均值、标准差和曲线。 各个受试动物的3次稳态谷浓度数据及各组平均值、标准差。 各个受试动物血药浓度达稳态后末次给药的血药浓度-时间数据和曲线和主要药代动力学参数，及各组平均值、标准差和曲线。 比较首次与末次给药的血药浓度-时间曲线和有关参数。 对受试物多次给药非临床药代动力学的规律和特点进行讨论和评价。 2. 吸收 对于经口给药的新药，进行整体动物试验时应尽可能同时进行血管内给药的试验，提供绝对生物利用度。如有必要，可进行体外细胞试验、在体或离体肠道吸收试验等以阐述药物的吸收特性。 对于其他血管外给药的药物及某些改变剂型的药物，应根据立题目的，提供绝对生物利用度或相对生物利用度。建议采用非啮齿类动物（如：犬或猴等）自身交叉试验设计，用同一受试动物比较生物利用度。 3. 分布 一般选用大鼠或小鼠进行组织分布试验，但必要时也可在非啮齿类动物（如犬）中进行。通常选择一个剂量（一般以有效剂量为宜）给药后，至少测定药物及主要代谢产物在心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织的浓度，以了解药物在体内的主要分布组织和器官。特别注意药物浓度高、蓄积时间长的组织和器官，以及在药效靶组织或毒性靶组织的分布（如对造血系统有影响的药物，应考察在骨髓的分布）。必要时建立和说明血药浓度与靶组织药物浓度的关系。参考血药浓度-时间曲线的变化趋势，选择至少3个时间点分别代表吸收相、平衡相和消除相的药物分布。若某组织的药物或代谢产物浓度较高，应增加观测点，进一步研究该组织中药物消除的情况。每个时间点，一般应有6个动物（雌雄各半）的数据。 以下情况可考虑进行多次给药后特定组织的药物浓度研究： （1）药物/代谢产物在组织中的半衰期明显超过其血浆消除半衰期，并超过毒性研究给药间隔的两倍； （2）在短期毒性研究、单次给药的组织分布研究或其他药理学研究中观察到未预料的，而且对安全性评价有重要意义的组织病理学改变； （3）定位靶向释放的药物。 进行组织分布试验，必须注意取样的代表性和一致性。 4. 排泄 建议同时提供啮齿类和非啮齿类动物的排泄数据，啮齿类（大鼠、小鼠等）每个性别3只动物，非啮齿类（如犬）每个性别2~3只动物。根据药物特性，也可选择单一性别动物，但需说明。 4.1  尿和粪的药物排泄：将动物放入代谢笼内，选定一个有效剂量给药后，按一定的时间间隔分段收集尿或粪的全部样品，直至收集到的样品中药物和主要代谢产物低于定量下限或小于给药量的1%。粪样品收集后按一定比例制成匀浆，记录总重量或体积，取部分尿或粪样品进行药物和主要代谢产物浓度测定或代谢产物谱（Metabolite profile）分析，计算药物和主要代谢产物经此途径排泄的速率及排泄量。每个时间段至少有5只动物的试验数据。 4.2  胆汁排泄：一般在动物麻醉下作胆管插管引流，待动物清醒且手术完全恢复后给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，进行药物和主要代谢产物测定。 4.3  记录药物及主要代谢产物自粪、尿、胆汁排出的速度及总排出量（占总给药量的百分比），提供物质平衡的数据。 5. 与血浆蛋白的结合 一般情况下，只有游离型药物才能通过脂膜向组织扩散，被肾小管滤过或被肝脏代谢，因此药物与蛋白的结合会明显影响药物分布与消除的动力学过程，并降低药物在靶部位的浓度。建议根据药理毒理研究所采用的动物种属，进行动物与人血浆蛋白结合率比较试验，以预测和解释动物与人在药效和毒性反应方面的相关性。 研究药物与血浆蛋白结合可采用多种方法，如平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法、色谱法等。根据药物的理化性质及试验室条件，可选择使用一种方法进行至少3个浓度（包括有效浓度）的血浆蛋白结合试验，每个浓度至少重复试验３次，以了解药物与血浆蛋白结合率以及可能存在的浓度依赖性和血浆蛋白结合率的种属差异。 对血浆蛋白结合率高，且安全范围窄的药物，建议开展体外药物竞争结合试验，即选择临床上有可能合并使用的高蛋白结合率药物，考察对所研究药物蛋白结合率的影响。 6. 生物转化 对于创新性的药物，尚需了解在体内的生物转化情况，包括转化类型、主要转化途径及其可能涉及的代谢酶表型。对于新的前体药物, 除对其代谢途径和主要活性代谢产物结构进行研究外, 尚应对原形药和活性代谢产物进行系统的药代动力学研究。而对主要在体内以代谢消除为主的药物(原形药排泄<50%)，生物转化研究则可分阶段进行：临床前可先采用色谱方法或放射性同位素标记方法分析和分离可能存在的代谢产物，并用色谱-质谱联用等方法初步推测其结构。如果临床研究提示其在有效性和安全性方面有开发前景，需进一步研究并阐明主要代谢产物的代谢途径、结构及酶催化机制。但当多种迹象提示可能存在有较强活性或毒性的代谢产物时，应尽早开展活性或毒性代谢产物的研究，以确定开展代谢产物动力学试验的必要性。 体内药物生物转化可考虑与血药浓度-时间曲线和排泄试验同时进行，应用这些试验采集的样品进行代谢产物的鉴定及浓度测定。 应尽早考察药效和毒性试验所用的实验动物与人体代谢的差异。这种差异有两种情况，其一是量的差异，动物与人的代谢产物是一致的，但各代谢产物的量不同或所占的比例不同；其二是质的差异，即动物与人的代谢产物是不一致的，这时应考虑这种代谢的种属差异是否会影响到其药效和毒性，并以此作为药效和毒性试验动物选择的依据。建议在早期非临床药代动力学研究时，进行药物体外（如动物和人肝组织匀浆、原代肝细胞、肝S9、肝微粒体等）代谢试验，以预测动物与人体体内代谢有无差异。 7. 药物代谢酶及转运体研究 药物的有效性及毒性与血药浓度或靶器官浓度密切相关。一定剂量下的血药浓度或靶器官浓度取决于该药物的吸收、分布、代谢及排泄过程（ADME），而代谢酶和转运体是影响药物体内过程的两大生物体系，是药物ADME的核心机制之一。因此，创新性药物的研究开发应该重点关注药物吸收和主要消除途径的确定、代谢酶和转运体对药物处置相对贡献的描述、基于代谢酶或转运体的药物-药物相互作用的评估等。 体外试验体系是评价药物代谢酶和转运体作用机制的有力手段，应结合体内试验，综合评价药物的处置过程。非临床ADME研究应主要采用人源化材料（如：人肝微粒体、肝S9、原代肝细胞及P450重组酶等），鉴定药物是否是代谢酶的底物或抑制剂。P450同工酶之外的药物代谢酶，如葡萄糖醛酸结合酶、硫酸转移酶等，也应该在适当的情况下进行评估。 对细胞色素P450同工酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等）抑制的考察可以通过使用类药性探针底物（Drug-like Probe Substrate）完成。抑制试验应该在酶动力学线性范围进行，即探针底物药物的浓度Km（米氏常数），抑制强弱通过IC50或Ki判断。P450同工酶抑制试验的思路与方法适用于其他药物代谢酶和转运体的研究评价。药物对P450酶的诱导应该重点对人CYP3A4以及CYP1A2、CYP2B6进行评估。体外诱导试验可运用人肝细胞多次给药后相关mRNA表达和/或酶活性的变化进行评价。 具有重要临床意义的外排和摄入转运体主要包括P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3和OCT2等，建议针对这些转运体进行研究。除此之外的其他转运体研究，在必要时也可予以考虑。 创新药物非临床ADME研究还应该考虑到代谢酶与转运体之间的相互影响及潜在的相互作用、人特异性代谢产物的评估等。 8. 物质平衡 在临床前和临床早期阶段，特别是毒性剂量和有效治疗剂量范围确定的情况下运用放射性标记化合物，可通过收集动物和人体粪、尿以及胆汁以研究药物的物质平衡。这些研究能够获得化合物的排泄途径和排泄速率等信息，而且有助于代谢产物的性质鉴定，并通过有限的数据比较它们的体内吸收和分布特点。通过体外和动物样品中分离出的代谢产物有时可作为参比品用于临床和非临床的定量研究。同时，组织分布研究和动物胆管插管收集的胆汁能够提供药物的组织分布数据和明确胆汁清除特点。一般应采用放射性同位素标记技术研究物质平衡。有关试验方法的介绍及相关考虑见附录（二）。 考虑到每一个化合物及其代谢产物具有各自的理化特性，在开展不同化合物的同位素标记研究时对试验方法作慎重的调整/修改是很有必要的。 四、数据处理与分析 应有效整合各项试验数据，选择科学合理的数据处理及统计方法。如用计算机处理数据，应注明所用程序的名称、版本和来源，并对其可靠性进行确认。 五、试验结果与评价 对所获取的数据应进行科学和全面的分析与评价，综合论述药物在动物体内的药代动力学特点，包括药物吸收、分布和消除的特点；经尿、粪和胆汁的排泄情况；与血浆蛋白结合的情况；药物在体内蓄积的程度及主要蓄积的器官或组织；如为创新性的药物，还应阐明其在体内的生物转化、消除过程及物质平衡情况。 在评价的过程中注意进行综合评价，分析药代动力学特点与药物的制剂选择、有效性和安全性的关系，从体外试验和动物体内试验的结果，推测临床药代动力学可能出现的情况，为药物的整体评价和临床研究提供更多有价值的信息。 六、附录 （一）生物样品分析方法的基本要求 1. 基本概念 生物样品分析方法的基本参数包括：（1）准确度，（2）精密度，（3）特异性，（4）灵敏度，（5）重现性，（6）稳定性。现将相关的概念介绍如下： 准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。 精密度：在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。 特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢产物、杂质、分解产物、基质组分等。 灵敏度：生物样品分析方法的灵敏度主要通过测定定量下限样品的准确度和精密度来表征。 重现性：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。 稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定基质中的化学稳定性。 标准曲线：试验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。 提取回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。 定量范围：包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的浓度范围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重复的定量，其准确度和精密度可以接受。 生物基质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。 基质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。 分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。 标准样品：在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。 质控样品：即QC样品，系指在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。 2. 生物样品分析方法的建立和验证 由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢产物）及个体差异等多种因素影响生物样品测定，所以必须根据待测物的结构、生物基质和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品分析方法，并对方法进行验证。 分析方法验证分为全面验证和部分验证两种情况。对于首次建立的生物样品分析方法、新的药物或新增代谢产物定量分析，应进行全面方法验证。在其他情况下可以考虑进行部分方法验证，如生物样品分析方法在试验室间的转移、定量浓度范围改变、生物基质改变、稀少生物基质（动物组织样品）、证实复方给药后分析方法的特异性等。 应考察方法的每一步骤，确定从样品采集到分析测试的全过程中，环境、基质、材料或操作上的可能改变对测定结果的影响。 （1）特异性 必须证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢产物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要考察6个不同个体空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品（注明样品来源基质、用药后的时间）色谱图。对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS、LC-MS/MS等），应注意考察分析过程中的基质效应，如离子抑制等。 （2）标准曲线与定量范围 根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法（如用加权最小二乘法）获得标准曲线。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 用至少5个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物基质，定量范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。 （3）精密度与准确度 要求选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限附近，其浓度在定量下限的3倍或3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获得批间精密度，应至少3个分析批合格。 精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示，相对标准差一般应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%。 准确度一般应在85%～115%范围内，在定量下限附近应在80%～120%范围内。 （4）定量下限 定量下限是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定3～5个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/10～1/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，RSD应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明。 （5）样品稳定性 根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。 （6）提取回收率 应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密和可重现。 （7） 稀释可靠性 样品稀释不应影响准确度和精密度。应该通过向基质中加入分析物至高于标准曲线上限浓度，并用空白基质稀释该样品（每个稀释因子至少5 个测定值），来证明稀释的可靠性。准确度和精密度应在±15%之内。稀释的可靠性应该覆盖试验样品所用的稀释倍数。 （8） 残留 方法开发期间应使残留最小化。方法验证期间应通过检测标准曲线定量上限浓度后测定空白样品来确定其残留，通常残留应不大于定量下限的20%。生物样品分析期间也应进行残留检测，如在测定高浓度样品后和分析下一个样品之前测定空白样品。 （9） 微生物学分析 上述分析方法验证的很多参数和原则也适用于微生物学分析，但在方法验证中应考虑到它们的一些特殊之处。结果的准确度是关键的因素，如果重复测定能够改善准确度，则应在方法验证和未知样品测定中采用同样的步骤。 （10）组织分布样品 组织分布样品由于每种组织样本数目少，所以其分析方法只需验证选择性、日内精密度和准确度等。通常选择一两种代表性组织（如肝、肺、肾、大肠等）进行分析方法验证。 3.生物样品分析方法的应用 应在生物样品分析方法验证完成之后开始测试未知样品。推荐由独立的人员配制不同浓度的标准样品对分析方法进行考核。 每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。药代动力学比较试验中，来自同一个体的生物样品最好在同一分析批中测定。 每个分析批应建立标准曲线，随行测定高、中、低3个浓度的质控样品，每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，最多允许1/3质控样品的结果超限，但不能在同一浓度中出现。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废。 同一天内进行不同组织样品测试时，用代表性组织作为基质建立标准曲线，但质控样品应采用目标空白组织制备。根据当日标准曲线计算质控样品的浓度，若相对偏差在15%之内，则可共用一条标准曲线，否则采用与待测组织样品相同的空白组织建立标准曲线。 浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白基质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到Cmax以后取样的样品应以无法定量（Not detectable, ND）计算，以减小零值对AUC计算的影响。 4.分析数据的记录与保存 分析方法的有效性应通过试验证明。在分析报告中，应提供成功完成这些试验工作的相关资料。建立一般性和特殊性标准操作规程，保存完整的试验记录是分析方法有效性的基本要素。生物分析方法建立中产生的数据和QC样品测试结果应全部记录并妥善保存，必要时接受检查。 5.需提交的数据与材料 提供给药品注册管理部门的材料应当包括：（1）综合信息；（2）方法建立的数据；（3）在日常样品分析中的基本资料；（4）其他相关信息。 （1）综合信息 项目编号、分析方法编号、分析方法类型、分析方法验证简化的理由，以及相应的项目编号、标题等。 （2）方法建立的数据 分析方法的详细描述；该方法所用对照品（被测药物、代谢产物、内标物）的纯度和来源；稳定性试验描述及相关数据；描述测定选择性、准确度、精密度、回收率、定量限、标准曲线的试验并给出获得的主要数据；列出批内、批间精密度和准确度的详细结果。根据具体情况提供代表性的色谱图或质谱图并加以说明。此外，尚需对所建立的方法学在实际分析过程中的优缺点进行评价。 （3）在日常样品分析中的基本资料 所用样品（受试物、代谢产物、内标物）的纯度和来源。样品处理和保存的情况，样品编号、采集日期、运输前的保存、运输情况、分析前的保存。信息应包括日期、时间、样品所处条件，以及任何偏离试验计划的情况。样品分析批的综合信息，包括分析批编号、分析日期、分析方法、分析人员、开始和结束时间、主要设备和材料的变化，以及任何可能偏离分析方法建立时的情况。 用于计算结果的回归方程，分析样品时标准曲线列表，各分析批质控样品测定结果综合列表并计算批内和批间精密度、准确度，各分析批包括的未知样品，浓度计算结果。 在现场考核中，应能提供全部受试物样品测试的色谱图或其他原始数据，包括相应分析批的标准曲线和质控样品的色谱图或其他原始数据。 注明缺失样品的原因，重复测试的结果。应对舍弃任何分析数据和选择所报告的数据说明理由。 （4）其他相关信息 缩略语列表、参考文献列表、标准操作规程列表。 （二）应用放射性同位素标记技术进行药物非临床药代动力学研究 新药研发过程中，了解候选药物在人体和用于毒理和药效研究的动物体内的变化情况至关重要。因此，在新药研发不同阶段必须进行各种体内、体外药代试验以阐明候选药物的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）等性质。尤其是对于仅在人体存在的代谢产物，或在稳态时体内暴露水平高于所有与药物相关物质总暴露量的10%并远高于任何毒理试验动物种属中的水平的代谢产物，会有药物安全性隐患，需进行代谢产物安全性研究。尽管液质联用技术已大量应用于这些试验，但放射性同位素标记技术仍被广泛使用。低能量放射性同位素（如14C、3H）标记化合物应用于药代动力学研究，因其生物界背景值很低因而检测容易且灵敏、半衰期较长而不需根据放射性半衰期校正试验结果、可定量分析候选药物产生的代谢产物而不需知道它们的结构、产生的非离子化β-射线能量极低而不需特殊防护，被证明为一种安全有效的特殊技术，其结果简单、明了、可靠，目前在多数情况下尚无别的取代方法。 1.放射性同位素标记药代动力学研究的应用范围 低能量放射性同位素标记技术可用于多方面ADME试验中，如: 1) 进行原形药和代谢产物总体和分别的药动学研究，确定总体的系统暴露和生物利用度等; 2) 考察物质平衡及排除途径; 3) 确定血液和排泄物中的代谢产物谱，结合色谱与质谱技术可利于代谢产物鉴定; 4) 确定体内清除机制; 5) 进行肝细胞、肝微粒体等体外药代动力学试验可获得全面的人和动物（如小鼠、大鼠、兔、犬、猴等）体外代谢产物谱、显示种属差异、帮助毒理研究动物种属的选择; 6) 鉴于同一种放射性同位素在不同结构的化合物（如：药物或代谢产物）上产生相同的放射能量，放射性代谢产物可用于同种动物稳态时、其他动物种属及人体中产生的代谢产物的定性定量分析，有助于人体代谢酶的鉴定，早期发现人体高比例代谢产物，并为药物相互作用研究的试验设计提供依据; 7) 获得组织分布数据。大鼠给药后不同时间点的整体放射自显影结果还可为临床放射性剂量的计算提供数据。 2.放射性同位素标记方法的选择 小分子化学药物ADME研究中常用的低能量放射性同位素为碳-14（14C）和氚（3H）。14C标记最为常用，其生物界背景低，生物学几乎无同位素效应而影响代谢，极少发生同位素交换，灵敏度较3H高而容易定量。标记碳-14化合物时应选择代谢稳定的位点。体内试验除非14C标记非常困难或根本无法标记、给药剂量极低需很高的比活性时才选用3H标记。3H标记相对简单并比14C标记化合物比活性高，尤其适合小剂量给药化合物或早期生物转化研究；同样，氚标记化合物时也应选择代谢稳定的位点作为标记位点，不推荐非定位的氚水交换标记方式。 14C和3H标记化合物的放化纯度与化学纯度一般均应≥95%，并不含有>1%的单一杂质。 3.放射性同位素标记药物的药代动力学试验 放射性化合物药代动力学试验与非标记药物药代动力学试验相似，如剂量、给药途径、受试动物等等。剂量除按常规剂量水平(mg/kg)表示外，还需提供放射性剂量（μCi/kg）。给药制剂的配制和给药途径一般也应与非标记药代动力学试验相似，特殊情况需说明。为减少实验误差，常采用称重法确定实际给药量。样品收集常包括全血、血浆、尿液、胆汁、粪便、笼具清洗液及组织等样本。血液样本的收集时间点可根据药物的药代动力学参数决定，排泄物一般采样7~10天（对于长半衰期的药物，应适当延长采样时间），或采样至排出的放射性量超过给药量的90%或连续2天的排出放射性量小于放射性给药剂量的1%。进行小动物（如小鼠、大鼠等）物质平衡试验时，如总放射性回收率<90%，应测定尸体残留总放射量，必要时应解剖动物，观察药物的主要储留部位和组织。为防止原形药及代谢产物降解，尿液和胆汁收集过程中容器置放于干冰内。样品处理（如液体样品离心去固体杂质、血浆、粪便及组织提取等）和分析（如应用HPLC和在线或离线放射性检测仪联用获得放射性代谢产物谱）应密切关注放射性的回收率，一般总回收率应≥85%。应根据放射性代谢产物谱研究获得的各代谢产物的血浆暴露量百分比和在排泄物中占给药百分率选择需要鉴定的代谢产物，并使用HPLC在线或离线放射性检测仪帮助鉴定工作中对代谢产物的监测。 放射性ADME试验报告除包括常规药代动力学研究内容外，还应提供放射性同位素标记药物的标记位置、放化纯度、化学纯度、比活度等以及在给药制剂中的放化稳定性数据。实验结果应提供放射性回收率，代谢产物鉴定需提供质谱和在线或离线放射性检测仪关联数据。 （三）几个需要关注的问题 1.关于中药、天然药物药代动力学研究 在中药、天然药物新药研究开发的过程中，通过对活性成分或活性代谢产物非临床药代动力学研究，了解其相关药代动力学参数，可作为阐明药效或毒性产生的基础及了解药效或毒性反应靶器官的依据，并为设计和优化临床试验给药方案提供有关参考信息。 中药活性成分情况较为复杂，有些活性成分较为单一，有些物质基础比较清楚但成分较多，有些活性成分复杂且不清楚。 对于活性成分单一的中药、天然药物，其非临床药代动力学研究与化学药物基本一致。 对于非单一活性成分但物质基础基本清楚的中药、天然药物，其中药效或毒性反应较强、含量较高的成分，一般需要进行药代动力学探索性研究。对于活性成分复杂且物质基础不太清楚的中药、天然药物，应根据对其中部分已知成分文献研究的基础上，重点考虑是否进行有明确毒性成分的非临床药代动力学研究。若有足够证据表明某类结构相似的一类成分中某一个成分的药代动力学属性可以代表该类成分的药代动力学特征，可从同类成分中选择一个代表性成分进行测定。被测成分应根据机体的暴露水平和暴露形式，以及药效作用/安全性相关性等因素来确定。 此外，在进行中药、天然药物非临床药代动力学研究时，应充分考虑中药、天然药物所含化学成分不同于化学合成药物的特点，结合其特点选择适宜的方法开展体内过程或活性代谢产物的研究，为后续研发提供参考。若拟进行的临床试验中涉及到与其他药物（特别是化学药）联合应用，应考虑通过体外、体内试验开展药物相互作用研究。 2.关于药代动力学研究的体外方法 随着体外生物技术的发展，为深层次地了解和阐明药物的某一性质以及与药效和毒性的相关性，不少药代动力学的体外方法有效地应用于药物代谢和相互作用评价，如体外吸收模型（Caco-2细胞模型）、体外肝系统研究、体外转运系统等。这些体外方法学在推测人药代动力学参数和特征时，提供了同种属的体外到体内的推测。体外方法学可以通过应用不同辅酶、不同选择性抑制物，不同重组基因纯酶，在试验设计上，可以弥补动物体内方法学的缺陷。人和动物的体外方法学结合动物的体内方法学，在新药研发的临床前阶段，可以较准确和有效地评价药物的吸收、运转、分布、代谢，比如药物代谢产物鉴定、代谢途径鉴定、药物对代谢酶和转运体的抑制和诱导等，为阐明药理和毒理作用机制和设计第一个临床研究剂量和评价潜在性药物代谢性或运转性相互作用提供可靠的参数。药代动力学的体外方法学的应用，在不影响或优化临床前研究信息量的同时，减少了实验动物的使用，使动物伦理学的实施逐渐可行。 对于体外研究发现有明显种属差异的药物，应进一步分析解释。 3.关于动物选择 由于动物药代动力学研究是联系动物研究与人体研究的重要桥梁，动物选择的恰当与否是该研究价值大小的关键。应尽量选择适宜的动物来进行研究，如口服给药的药物不宜选择食草类动物或与人胃肠道情况差异较大的动物，以免由于吸收的差异造成试验结果不能充分提示临床。对于创新性的药物，可利用体外药代动力学手段预先对动物种属进行筛选，以选择药物动力学特点与人体最接近的动物，提高试验结果的临床预测价值。由此也可为毒性试验选择合适的动物种属提供依据，并对毒性试验与人体的相关性做出判断。 4.关于手性药物 对映异构体具有几乎相同的物理性质（旋光性除外）和化学性质（在手性环境中除外），通常需要特殊的手性技术对它们进行鉴定、表征、分离和测定，但生物系统常常很容易区分它们，并可能导致不同的药代动力学性质（吸收、分布、代谢、排泄），以及药理学、毒理学效应的量或质的区别。 为评价单一对映体或对映体混合物的药代动力学，研究者应在药物开发前期，建立适用于体内样品对映体选择性分析的定量方法，为后期研究对映体之间的相互转化以及各自的吸收、分布、代谢和排泄提供方法学基础。 如果外消旋体已经上市，研究者希望开发单一对映体，则应测定该对映体转化为另一对映体的程度是否显著，以及该对映体单独用药是否与其作为外消旋体组分时的药代动力学性质一致，这对丰富和解释单一对映体研发的立题依据、优化剂量、制定给药方案具有重要的意义。 为监测对映异构体在体内的相互转化和处置，应获得单一对映体在动物体内的药代动力学曲线，并与其后在临床I期试验中获得的药代动力学曲线相比较。 附件6 药物毒代动力学研究技术指导原则 一、 概述 毒代动力学研究目的是获知受试物在毒性试验中不同剂量水平下的全身暴露程度和持续时间，预测受试物在人体暴露时的潜在风险（注释1）。毒代动力学是非临床毒性试验的重要研究内容之一，其研究重点是解释毒性试验结果和预测人体安全性，而不是简单描述受试物的基本动力学参数特征。 毒代动力学研究在安全性评价中的主要价值体现在： （一）阐述毒性试验中受试物和/或其代谢物的全身暴露及其与毒性反应的剂量和时间关系；评价受试物和/或其代谢物在不同动物种属、性别、年龄、机体状态（如妊娠状态）的毒性反应；评价非临床毒性研究的动物种属选择和用药方案的合理性。 （二）提高动物毒性试验结果对临床安全性评价的预测价值。依据暴露量来评价受试物蓄积引起的靶部位毒性（如肝脏或肾脏毒性），有助于为后续安全性评价提供量化的安全性信息。 （三）综合药效及其暴露量和毒性及其暴露信息来指导人体试验设计，如起始剂量、安全范围评价等，并根据暴露程度来指导临床安全监测。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。生物制品的毒代动力学研究可参考本指导原则（注释2）。 二、基本原则 毒代动力学研究需执行《药物非临床研究质量管理》（GLP）（注释3）。 毒代动力学试验通常伴随毒性试验进行，常被称为伴随毒代动力学试验。开展研究时可在所有动物或有代表性的亚组或卫星组动物中进行，以获得相应的毒代动力学数据（注释4）。 三、基本内容 （一）暴露量评估 毒代动力学试验的基本目的是评估受试物和/或其代谢物的全身暴露量，常通过适当数量的动物和剂量组来开展研究。伴随毒代动力学研究所用动物数量应保证能获得足够的毒代动力学数据。由于毒性试验中通常采用两种性别动物，暴露测定也应包括两种性别的动物。选择单性别动物时应说明理由（注释5）。 暴露评估应考虑以下因素（注释6）：血浆蛋白质结合、组织摄取、受体性质和代谢特征的种属差异、代谢物的药理活性、免疫原性和毒理学作用。在血浆药物浓度相对较低时，特殊的组织或器官也可能会有较高水平的受试物和/或其代谢物。对于血浆蛋白结合率高的化合物，用游离（未结合）浓度来表示暴露更为合适。 暴露评估中需关注血浆或体液中代谢物浓度的情况有：1）受试物为“前体化合物”且其转化生成的代谢物为主要活性成分；2）受试物可被代谢为一种或多种具有药理或毒理活性代谢物，且代谢物可导致明显的组织/器官反应；3）受试物在体内被广泛代谢，毒性试验仅可通过测定血浆或组织中的代谢物浓度来进行暴露评估。  （二）毒代动力学参数 毒代动力学研究是通过测定合适时间点的样品浓度来计算动力学参数的。暴露程度可用原型化合物和/或其代谢物的血浆（血清或全血）浓度或AUC来表示。某些情况下，可选择测定组织中的受试物浓度（见注释7）。 用于评估的毒代动力学参数通常有： AUC0-T、Cmax、C(time)。某些试验可考虑仅开展毒代动力学的监测或特征的研究（注释8）。 （三）给药方案 毒代动力学试验的给药方案设计应完全参照毒性试验研究方案，包括给药剂量、途径、动物种属选择和给药频率、周期等。为达到毒性反应的最大暴露，应评估高剂量水平下受试物和/或其代谢物的暴露程度（注释9）。 某些情况下，非临床试验中可能会采用与临床拟用药方式不同的给药方式（如不同的给药途径、不同制剂）开展毒性试验，此时应依据暴露量评估全身暴露是否充分。 （四）样品采集 伴随毒代动力学研究中，样品采集的时间点应尽量达到暴露评价所需的频度，但不可过于频繁，避免干扰毒性试验的正常进行并引起动物过度的生理应激反应。每项研究中的时间点数量应满足暴露评价的要求，时间点的确定应以早期毒性试验、预试验或剂量探索毒性试验以及在相同动物模型或可以合理外推的其它动物模型上获得的动力学数据为基础。 应该考虑样品是从所有的实验动物采集，还是从具有一定代表性的亚组或卫星组动物采集。通常情况下，在大动物的毒性试验中毒代动力学数据从主研究实验动物收集，而啮齿类动物的毒性试验中毒代动力学数据可从卫星组实验动物收集。 采集血样的前提是受试物在血浆中的暴露量与作用靶点或毒性靶点的受试物浓度存在动态平衡关系，并且受试物容易进入动物和人的全身系统。若血液中受试物暴露量无法反映靶组织或器官的毒性反应时，则可能需要考虑采用尿液、其他体液、靶组织或器官来测定受试物浓度。 （五）分析方法 毒代动力学研究的分析方法应基于早期建立的分析物和生物基质（生物体液或组织）的分析方法，且要根据代谢和种属差异而定。分析方法应具有特异性，并且有足够的精确度和精密度，检测限应满足毒代动力学研究时预期的浓度范围。分析物和生物基质分析方法的选择应排除样本中内源性物质可能引起的干扰。 如果分析物是消旋体或对映异构体的混合物，应予以说明。 生物样品分析方法的具体技术要求可参考《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》中的相应内容。 （六）数据统计与评价 暴露评价的数据需有代表性。由于动力学参数多存在个体差异，且毒代动力学资料多来源于小样本的动物，因此通常难以进行高精度的统计学处理。统计分析时应注意求算平均值或中位数并评估变异情况。某些情况下，个体动物的数据比经整理、统计分析过的成组数据更为重要。 如果进行了数据转换（如对数转换），应提供理由。 在评估连续给药是否引起体内蓄积时，不仅要观察是否出现蓄积现象，还要结合受试物半衰期长短、受试物暴露对关键代谢酶或转运体的影响等方面进行分析，并注意种属差异。 （七）报告 完整的毒代动力学资料应包括对毒代动力学研究结果的自身评价和对毒性反应的相关解释，并报告分析方法，说明分析中所选生物基质和分析物的理由。毒代动力学的结果分析中，应比较分析受试物和/或其代谢物的药效、毒性、药代和临床拟定用药的暴露量，采用暴露量来评估受试物的安全范围。 四、毒代动力学在不同毒性试验中的应用 毒代动力学研究在不同毒性试验中的内容，如暴露监测和特征描述的频度，可根据研究需要有所增减。不同毒性试验的毒代动力学研究考虑如下： （一）单次给药毒性试验 单次给药毒性试验的毒代动力学研究结果有助于评价和预测剂型选择和给药后暴露速率和持续时间，也有助于后续研究中选择合适剂量水平。 （二）重复给药毒性试验 毒代动力学研究内容一般应纳入重复给药毒性试验设计中，它包括首次给药到给药结束全过程的定期暴露监测和特征研究。后续毒性试验所采用的方案可依据前期试验的毒代研究结果修订或调整。当早期毒性试验出现难以解释的毒性问题时，可能需要延长或缩短对该受试物的毒性监测和特征研究的时间，或修订研究内容。 （三）遗传毒性试验 当体内遗传毒性试验结果为阴性时，需结合暴露量数据来评估遗传毒性风险，尤其是当体外试验显示为明确的阳性结果或未进行体外哺乳动物细胞试验时。 体内暴露的评估应采用与遗传毒性试验相同的动物种属、品系和给药途径，在最高剂量或其他相关剂量中进行。体内暴露可通过试验中所显示的体内细胞毒性（如微核试验中所检测组织的未成熟红细胞占红细胞总数的比例发生显著变化）或暴露情况（测定血液或血浆中的受试物和/或其代谢物的暴露，或直接测定靶组织中的受试物和/或其代谢物的暴露）来证明。 若体外遗传毒性试验结果为阴性，可采用上述方法或者为其他目的进行的啮类齿动物药代/毒代试验结果，结合体内暴露进行评估。 （四）生殖毒性试验 生殖毒性毒代动力学研究主要目的在于分析生殖毒性试验的结果，有助于确定生殖毒性试验中不同阶段的不同剂量是否达到了充分暴露。应考虑妊娠期与非妊娠期动物的动力学特征的可能差异。 毒代动力学数据可以来自生殖毒性试验的全部动物，也可以来自部分动物。毒代动力学数据应包括胎仔/幼仔数据，以评价受试物和/或代谢产物能否通过胎盘屏障和/或乳汁分泌。 （五）致癌性试验 1.剂量探索研究 为获得有助于主研究的毒代动力学资料，剂量探索研究中需适当开展毒代动力学的监测或特征描述，尤其应注意在早期毒性试验中未采用的动物种属、品系以及首次采用的给药途径和方法等情况。 应特别注意掺食给药情况下获得的毒代动力学数据。应根据受试动物和人可能达到的全身暴露量来确定致癌性试验中的合适的最高剂量。致癌性试验所选择剂量产生的全身暴露量应超过人用最大治疗剂量时暴露量的若干倍。 2.主研究 试验方案、动物种属及品系的选择应尽可能根据已有的药代动力学和毒代动力学资料来考虑。 建议通过监测来确保主研究中的暴露与独立的或特定的剂量探索研究所获得的动力学特征描述相一致。这种动力学监测可在试验中的某些时间点即可，超过６个月的监测通常无必要。 五、参考文献 1.国家食品药品监督管理局药品注册管理办法，附件2：第四项：（二）说明：第8条，2007. 2. ICH Guideline S3B, Pharmacokinetics: repeated dose tissue distribution studies, 1995. 3. ICH Guideline S3A , Toxicokinetics: A guidance for assessing  systemic exposure in toxicology studies, 1995. 4. OECD Guideline: Toxicokinetics (draft), 2008. 六、注释 注释1：通常情况下，受试物的药理作用与作用部位受试物浓度的相关性比与给药剂量的相关性好。同样，受试物的毒性反应与特定毒性靶器官或组织的受试物浓度相关性较好。如果受试物在靶部位是高渗透性的，该部位的受试物浓度应该与血液中的受试物呈动态平衡和一定比率，可以采用测定血浆或血液中受试物浓度来反映靶部位的受试物暴露量。但有时受试物的系统暴露量与毒性反应缺乏很好的相关性，这时应进行慎重分析，一般有两种情况：1）所选择的分析物不正确，它不是毒性产生的物质基础；2）全身的系统暴露量与毒性靶器官或器官暴露量之间的变化不平行。此时需测定靶部位的暴露量来评价其毒性或借助于数学模型来揭示全身暴露量与毒性靶器官的暴露量之间的关系，利用这种关系来间接反映全身暴露量与毒性之间的关系。 注释2 ：关于中药的适用性，可参考相关非临床安全性评价的技术指导原则和非临床药代研究技术指导原则，在此不再阐述。生物制品中的大分子治疗用蛋白、抗体等通常需要进行毒代动力学研究，可参考该指导原则。 注释3：毒代动力学研究中的动物试验和样品分析工作有的是在非临床研究机构中完成；也有的是在非临床研究机构中完成动物给药和采样，而在生物分析试验室中完成样品分析和数据处理。无论何种情况，毒代动力学研究的样品分析和数据处理工作除需遵守《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》的技术要求外，还需严格遵循GLP。 注释4： 毒性试验最好采用伴随的动物暴露量数据来解释毒性反应、种属差异、预测人体毒性等。但是，当毒代动力学研究的样品收集可能会影响毒性试验结果时，需考虑采用卫星组动物研究。 注释5：毒性试验中应采用合适的动物数和剂量组数对全身暴露量进行估计。一般情况下，建议受试物的每个剂量组至少每性别4只动物。若有证据提示受试物在性别间有明显毒性差异，试验中可选择敏感性别的动物。 注释6：为了更好地用“受试物体内暴露”在“给药剂量”与“受试物毒性”之间搭建桥梁，在讨论毒代动力学结果时，应了解：受试物的毒性反应是因其药效作用随剂量升高而产生的，还是来自与药效作用机制不同的其他机制；受试物的毒性反应是来自受试物化合物本身，还是来自其代谢物；血浆蛋白结合与受试物毒性反应的关系；受试物的血药浓度与其在产生毒性反应的脏器中浓度之间的关联性等。 注释7： 测定组织中受试物暴露量的可能情况有：长半衰期受试物；不完全清除；出现非预期的毒性靶器官等。 注释8：监测（monitor）是指在给药间期内采血1~3时间点，用以估算C(time)或Cmax，常在给药开始和结束时取样，单剂量毒性给药试验或较短期的重复给药毒性试验可考虑开展暴露量监测。特征（profile）是指在给药间期采血样4~8时间点，用以估算Cmax和/或C(time)和AUC。 注释9：当毒代动力学数据表明受试物的吸收特性限制了原型受试物化合物和/或代谢物暴露，且无其他剂量限制因素存在时，该化合物能达到最大暴露的最低剂量将被认为是可采用的最高剂量。当增加剂量导致非线性动力学时，应特别注意其与毒性研究中毒性反应的关联性，非线性动力学并不意味着剂量不可以递增，也不意味着不会有新毒性反应出现。  附件7 药物QT间期延长潜在作用 非临床研究技术指导原则 一、 概述 心电图（ECG）中QT间期（从QRS波群开始到T波结束）反映心室去极化和复极化所需的时间。当心室复极化延迟和QT间期延长，尤其伴有其他风险因素（如低血钾、结构性心脏病、心动过缓）时，患者发生室性快速心律失常的风险增加，包括尖端扭转型室性心动过速（torsade de pointes，TdP）。 本指导原则主要是关于评价受试物延迟心室复极化潜在作用的非临床研究策略，以及对非临床研究信息的分析和综合风险性评估。QT间期研究结果可以和其他信息一起，用来阐明药物作用机制，以及对人体的延迟心室复极化和延长QT间期的风险评估。 本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。 二、基本原则 （一）试验方法 《药物安全药理学研究技术指导原则》中所述的关于研究设计的基本原则和推荐方法，也适用于本指导原则。建议采用体内和体外的方法进行研究。 应基于受试物的药效学、药代动力学、安全性的特点对研究方法设计、风险性证据进行个体化分析。 （二）执行GLP的要求 体外试验建议执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）规范，体内试验遵循GLP，追加研究（Follow-up studies）应在最大可行限度内遵循GLP。 （三）受试物 中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。当给药时间较长时，应考察配制后体积是否存在随放置时间延长而膨胀造成终浓度不准的因素。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。 化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。 在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。 化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。 三、基本内容 （一）试验设计的基本要求 1.生物材料 应选择合适的试验体系和动物种属。体外研究可采用离体心肌细胞、培养心肌细胞系或克隆的人离子通道的异种表达体系、离体心脏标本。用于体外研究的组织和细胞标本可来源于不同的实验动物，包括兔、雪貂、豚鼠、犬、猪。当采用原代组织或细胞时，应考虑所用标本的特点及来源，因为离子通道的分布可因组织和细胞类型而不同。 用于整体研究的动物包括犬、猴、猪、兔、雪貂以及豚鼠。 成年大鼠和小鼠复极化的离子机制不同于包括人在内的大动物种属（在成年大鼠、小鼠，复极化的主要离子流是Ito），因此用这些种属的组织或动物是不合适的。 实验动物应符合国家对相应等级动物的质量规定要求，并具有实验动物质量合格证明。 2.样本量 体外试验：体外样本量每组不少于4个平行样本，一般3~5个组。 体内试验：试验组的组数及每组动物数的设定，应以能够科学合理地分析所获得的试验结果，恰当地反映有生物学意义的作用，并符合统计学要求为原则。小动物每组一般不少于10只，大动物每组一般不少于6只，一般雌雄各半。 3.剂量 体外研究中，受试物的浓度应涵盖和超过预期临床最大治疗血药浓度。试验中逐步提高药物浓度直到出现特征性的浓度-反应曲线或达到因受试物理化特性所限的最高浓度。除了受到细胞或组织活性的限制外，理想状态下应有充分的药物暴露时间以获得稳态电生理效应，应注明药物暴露时间的长短。体外研究中应使用合适的阳性对照药，以确认该体外试验系统的敏感性。 体外研究应确定受试物的浓度-效应关系。当体外研究无明显作用时，应对浓度选择的范围进行说明。 整体试验剂量范围应与《药物安全药理学研究技术指导原则》的原则一致。如果可能，剂量范围应包括和超过预期的人暴露水平。当给药剂量可能会因动物的耐受性而受到限制时，如动物出现呕吐、震颤、活动过度等，可采用静脉给药或麻醉动物进行研究。当研究用于评价延迟心室复极化程度与原药及代谢产物浓度关系时，可采用持续静脉滴注的方式控制药物暴露水平。监测受试物及其代谢产物的暴露量有助于解释药物的量效关系或剂量或浓度-反应，也为设计可能追加的试验提供信息。 4.对照 体外离子通道和动作电位时程试验中应采用次最大有效浓度（即药物对通道的抑制率达70%～80%时的浓度）的阳性对照药说明试验系统的反应性，并且应用于每项试验。整体试验研究中使用阳性对照药则是为了验证试验系统的敏感性，但不必在每一项试验中都使用阳性对照药。 如受试物在化学结构/药理分类上属于与延长人体QT间期或促心律失常有关的药物时，在体内外研究中应与现有同类药物比作用强度。 5.给药途径 整体动物试验，首先应考虑与临床拟用途径一致，可以考虑充分暴露的给药途径。对于在动物试验中难以实施的特殊的临床给药途径，可根据受试物的特点选择，并说明理由。 6.观察时间 结合受试物的药效学和药代动力学特性、实验动物、临床试验方案等因素选择观察时间点和持续时间。 （二） 主要研究内容 1.主要研究 1.1采用离体动物或人心肌细胞、培养心肌细胞系或克隆的人离子通道的异种表达体系测定离子流。 1.2测定清醒或麻醉动物的ECG参数。 1.3在离体心脏标本进行动作电位参数测定，或在麻醉动物中进行能体现动作电位时程的特异性电生理参数检测。 1.4在离体心脏标本或动物进行致心律失常作用测定。 可先进行1.1、1.2研究，再进行1.3、1.4研究。 综上所述，可采用体内外方法从4个不同方面对受试物的QT间期作用进行研究，并且相互之间有互补作用。 2.追加研究 当非临床研究的结果不一致，和/或临床研究结果与非临床研究结果不一致时，可通过回顾性评价和追加研究进行分析。此种情况下，追加的研究结果可能成为综合风险评估的重要组成部分。 追加的研究是为了更深入地了解或提供更多的关于受试物潜在的延迟人心室复极化和延长QT间期的作用。这些研究可以提供更多有关作用强度、作用机制、剂量反应曲线的斜率或最大反应幅度的信息。追加的研究可以针对某一特殊问题设计试验，因此各种体外或体内的研究设计都可应用。 在选择和设计追加研究中，以下内容需与已有的非临床和临床信息一并考虑： ·用离体心脏测量记录动作电位以评价心室肌复极化； ·在麻醉动物用一些能反映动作电位时程的特殊电生理参数； ·动物的种类和性别的选择； ·用代谢诱导剂或抑制剂； ·用目前已知阳性对照物或参比物； ·未研究的对其他通道的抑制作用； ·多时间点测定电生理参数； ·在清醒动物难以解释的作用，如受试物对心率、自主神经紧张的影响，或受试物的毒性，如震颤、抽搐或呕吐； ·如药物有蓄积、临床长期使用，需考虑多次给药的观察。 四、结果分析与评价 综合风险评估应该是基于科学的、对受试物个性化的考虑。这种综合风险性评估有益于临床研究设计和其结果的分析。应结合药效学、毒理学、药代动力学以及其他研究资料进行综合评价，为药物应用于人体的安全性提出建议。 风险评估应考虑受试物是否在化学结构或药理分类上属于可延长人QT间期作用的药物，如某些抗精神病类药物、组胺H1受体拮抗剂、氟喹诺酮类等。这可能会影响参比物的选择并会纳入综合风险评估中。 对QT间期影响的非临床研究策略如下图 五、参考文献 1.ICH, ICH Guidance for Industry ICH S7A：Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals, 2001. 2.ICH, ICH Guidance for Industry ICH S7B：Safety Pharmacology Studies for assessing the potential for delayed ventricular repolarization （QT interval prolongation）by Human Pharmaceuticals, 2005. 3.Liu T, Brown BS, Wu Y, Antzelevitch C, Kowey PR, Yan GX.Blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias, Heart Rhythm 2006; 3: 948-956. 六、附录—试验方法 （一）体外试验 评价药物对离子电流的影响，主要包括IKr和其他几种参与心肌电活动的重要离子通道。体外IKr试验是采用原代心肌细胞或表达IKr通道蛋白（如由hERG编码的蛋白）的细胞系评价药物对离子电流的影响。相关研究方法见参考文献。检测中获得IC50的基本参数项目列于表2。 表1  致心律失常作用试验检测的心肌离子通道 通道种类 阳性对照（参考） 参考文献 Cav1.2 (L-type) 尼非地平(Nifedipine) Shen J et al Comparison of L-type calcium channel blockade by nifedipine and/or cadmium in guinea pig ventricular myocytes JPET, 2000；294:562–70 Zahradn?k I, Minarovic, I and Zahradn?kova A Inhibition of the cardiac L-typec calcium channel currentby antidepressant drugs JPET,2008；324:977–84 hERG 西沙必利(Cisapride)或特非那定(Terfenadine) Helliwell R, Recording hERG potassium currents and assessing the effects of compounds using the whole-cell patch-clamp technique Jonathan D Lippiat (ed ), Methods in Molecular Biology, Potassium Channels, 2008；491: 279–95 Kamiya K et al Molecular determinants of hERG channel block by terfenadine and cisapride J Pharmacol Sci,2008；108:301-7 Gintant GA et al Utility of hERG assays as surrogate markers of delayed cardiac repolarization and QT safety ToxicolPathol, 2006；34:81-90 Kv1.5 4-氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP) De Biasi M et al Open channel block of human heart hKv1 5 by the beta-subunit hKv beta 1 2 Am J Physiol 1997 272: H2932-41 Lagrutta A et al Novel, potent inhibitors of human Kv1 5 K+ channels and ultrarapidly activating delayed rectifier potassium current JPET,2006;317:1054-63 Kv4.3 氟卡尼(又名哌氟酰胺，Flecainide) 或4-AP Radicke S et al Effects of MiRP1 and DPP6 β-subunits on the blockade induced by flecainide of KV4 3/KchIP2 channels Br J Pharmacol 2008, 154: 774–86 Fischer F et al Inhibition of cardiac Kv1 5 and Kv4 3 potassium channels by the class Ia anti-arrhythmic ajmaline: mode of action Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2013, online, Jul KvLQT1/minK 二乙酰醇293B (Chromanol-293B) Yang WP et al KvLQT1, a voltage-gated potassium channel responsible forhuman cardiac arrhythmias PNAS, 1997; 94:4017- 4021 Seebohm G et al Molecular determinants of KCNQ1 channel block by a benzodiazepine Mol Pharmacol, 2003, 64:70-7 Nav1.5 利多卡因(Lidocaine) Wu L et al Role of late sodium current in modulating the proarrhythmic and antiarrhythmic effects of quinidine Heart Rhythm, 2008；5: 1726-34 McNulty, MM andHanck ,DA State-dependent mibefradil block of Na+ channels Mol Pharmacol, 2004； 66:1652-61 Kir2.1 钡(Barium)或氯喹(Chloroquine) Rodriguez-Menchaca AA et al , The molecular basis of chloroquine block of the inward rectifier Kir2 1 channel PNAS, 2008；105:1364-8 Schram G et al Barium block of Kir2 and human cardiac inward rectifier currents:evidence for subunit-heteromeric contribution to native currents Cardiovasc Res, 2003, 59: 328-38       观察记录上述所有离子通道的相关试验建议在GLP实验室进行 表2  检测阻断离子通道IC50所需的参数项目 参数项目 IC50 试验平台 手动膜片钳记录系统 所需浓度 4种 每一浓度下重复试验例数 n=3 阳性对照 n=2 溶媒对照 1个浓度，n=3 检测温度 室温 (RT)或生理性温度 (PT) 浓度范围 通过预实验确定 试验方案和报告 GLP格式 累积曲线 + 分析样品收集 + PDF格式的电子文档 +     （二）整体研究 整体QT研究主要是测定心室复极参数，如QT间期。该试验可在安全药理学研究中同时进行，这样可减少动物和其他资源的使用。 QT间期和心率是相反的、非线性的关系，且二者之间的关系在不同的种属和动物甚至同一种属之间都不相同。因此心率改变会影响QT间期，这会干扰对受试物影响心室复极化和QT间期的评价。故在QT间期分析时，应采用心率校正QT间期（QTc）来进行，常用的有Bazett和Fridericia法；心率校正的选择须根据试验系统得来的数据加以判断，如果给药组和对照组心率差异较大，可能校正公式对于评价QT间期延长风险是无效的，此时可改用心脏起搏器来获得固定的心率。对QT/RR（心电图中R波与R波的距离）关系进行分析可能更合适，包括用公式对个体动物QT间期数据进行校正。 在犬或猴等大动物记录ECG，是安全性评价的基本组成。药物引起QT间期显著延长将使致命性心律失常TdP发生的风险显著增加，因而ECG的QT间期被作为预测新化合物引起TdP的重要风险因素。鉴于犬、猴和小型猪等大动物在心肌离子通道构成和功能方面与人类具有高度相似性，通常用于整体QT分析研究中。整体QT分析试验可在麻醉和清醒动物进行，具体方法参见表3所列文献。 表3  整体QT研究试验常用动物 动物 参考文献 试验参数 麻 醉 动 物 犬 Ollerstam, A et al Comparison of the QT interval response during sinus andpaced rhythm in conscious and anesthetized beagle dogs J PharmacolToxicol Methods, 2007;56: 131-44 Chiba K, et al In vivo experimental approach for the risk assessment of fluoroquinolone antibacterial agents-induced long QT syndrome Eur J Pharmacol, 2004;486:189-200 ECG相关参数, 包括（形态、心率、节律、P波电压、R波电压、T波电压、PR间期、RR间期、 QRS时间、QT间期、QTc间期） 猴 Ishizaka T et al Evaluation of drug-induced QT prolongation in a halothane-anesthetized monkey model: effects of sotalol J PharmacolToxicol Methods, 2009;59:86-93 猪 Authier S et al Cardiovascular and respiratory safety pharmacology in G?ttingenminipigs: Pharmacological characterization JpharmacolToxicol Methods, 2011;64:53-9 遥 测 动 物 犬 Batey AJ, Doe PA A method for QT correction based on beat-to-beat analysis of the QT/RR interval relationship in conscious telemetred beagle dogs J PharmacolToxicol Methods,2002;48: 11-9 Fossa AA Assessing QT prolongation in conscious dogs: validation of a beat-to-beat method PharmacolTher, 2008;118:231-8 猴 Ando K et al QT PRODACT: In vivo QT assay with a consciousmonkey for assessment of the potential for drug-induced Qtinterval prolongation J Pharmacol Sci,2005;99: 487-500 Haushalter TM et al The cardiovascular and pharmacokineticprofile of dofetilide in conscious telemetered beagle dogs andcynomolgus monkeys Br J Pharmacology,2008;154: 1457-64 猪 Stubhan et al Evaluation of cardiovascular and ECG parameters in the normal, freely moving G?ttingenMinipig J Pharmacol Toxicological Methods,2008, 57: 202–11 KanoM et al QT PRODACT: Usabilityof miniature pigs in safety pharmacology studies: Assessment for drug-inducedQT interval prolongation J Pharmacol Sci,2005, 99:501?11 麻 醉 动 物 犬 Takahara A et al Effects of mexiletine on the canine model of sparfloxacin-induced long QT syndrome Eur J Pharmacol,2003,476:115-22 Chiba K et al Proarrhythmic effects of fluoroquinolone antibacterial agents: in vivo effects as physiologic substrate for Torsades ToxicolApplPharmacol, 2000, 169:8-16 Kimura K et al Hemodynamic and electrophysiological effects of mitemcinal (GM-611), a novel prokinetic agent derived from erythromycin in a halothane-anesthetized canine model J ToxicolSci, 2007,32:231-9 血流动力学检测，包括MAP、SBP、 DBP、HR、 ECG、单相动作电位(MAP)等         注：G?ttingen minipigs:哥根廷小型猪。上述整体QT研究相关试验建议在GLP实验室进行 （三）追加的研究 药物对心肌动作电位（Action potential，AP）的影响：心脏的正常功能依赖于心肌细胞动作电位的产生和传导。药物引起细胞膜离子通道表达或功能异常是其导致心律失常的重要病理生理基础。因此，在离体心脏标本进行动作电位参数测定，是ICH 推荐的QT间期延长药物安全性评价体系中的重要组成之一。常用于动作电位参数测定的动物离体心脏标本及试验方法见表4，试验中重要的参数项目见表5。 表4  记录心肌AP的离体心肌标本 动物标本 参考文献 犬蒲肯野纤维 Terrar, DA et al Comparison of guinea-pig ventricular myocytes and dog Purkinje fibres for in vitro assessment of drug-induced delayed repolarization J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 56: 171-85 Lightbown ID et al Towards automation of a valuable preclinical cardiac safety pharmacology assay: Evaluation of the effects of cardiac ion channel blockers on cardiac repolarisation in vitro J Pharmacol Toxicol Methods, 2007;56:194-202 Limberis JT et al The effects of plasma proteins on delayed repolarization in vitro with cisapride, risperidone, and D, L-sotalol J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 56:11-7 兔蒲肯野纤维 Himmel HM Suitability of commonly used excipients for electrophysiological in-vitrosafety pharmacology assessment of effects on hERG potassiumcurrent and on rabbit Purkinje fiber action potential J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 56: 145-58 Ducroq J et al Action potential experiments complete hERG assay and QT-interval measurements in cardiac preclinical studies J Pharmacol Toxicol Methods, 2007; 159-70 豚鼠心室肌细胞 Hagiwara T et al A comparative study of the fluoroquinolone antibacterial agents on the action potential duration in guinea pig ventricular myocardia Jpn J Pharmacol, 2001; 87: 231–34 Shuba LM et al Action potentials, contraction, and membrane currents in guinea pig ventricular preparations treated with the antispasmodic agent terodiline JPET, 1999; 290:1417-26 豚鼠心室乳头肌 Hayashi S et al QT PRODACT: a multi-site study of in vitro action potential assays on 21 compounds in isolated guinea-pig papillary muscles J PharmacolSci,2005; 99:423-37 Langendorff离体心脏 Milberg P et al Proarrhythmia as a class effect of quinolones: increased dispersion of repolarization and triangulation of action potential predict torsades de pointes J Cardiovasc Electrophysiol, 2007; 18:647-54 Clements-Jewery H et al Actions of flecainide on susceptibility to phase-2 ventricular arrhythmias during infarct evolution in rat isolated perfused hearts British J Pharmacol, 2006; 147: 468–75 ChengHC and Incardona J Models of torsades de pointes: effects of FPL64176, DPI201106, dofetilide, and chromanol 293B in isolated rabbit and guinea pig hearts J Pharmacol Toxicol Methods, 2009; 60: 174-84 冠状动脉灌注兔左心室肌楔形标本 ChenX et al Use of arterially perfused rabbit ventricular wedge inpredicting arrhythmogenic potentials of drugs J Pharmacol Toxicol Methods, 2006;54: 261-72 Liu T, Brown BS, Wu Y, Antzelevitch C, Kowey PR, Yan GX.Blinded validation of the isolated arterially perfused rabbit ventricular wedge in preclinical assessment of drug-induced proarrhythmias Heart Rhythm 2006; 3: 948-956     上述研究相关试验建议最大可能执行GLP 表5  心肌动作电位试验中的重要参数项目 三浓度检测参数项目 测试 测试浓度数 3 检测每一个受试物所需的蒲肯野纤维数或心肌细胞数 4 用于对照品的蒲肯野纤维数或心肌细胞数 4 累积曲线 + 在生理温度 (37o±1o C) 下进行试验 + 统计学分析 + 如果系GLP实验室，收集样本的分析 + 报告 + 如果是GLP实验室，要求有质量保证部门(Quality Assurence Unit, QAU)的检查，包括同步、数据和报告的检查 +     可参考的文献 1. De Clerck F et al, In vivo measurement of QT prolongation, dispersion and arrhythmogenesis: application to the preclinical cardiovascular safety pharmacology of a new chemical entity, FundamClinPharmacol, 2002;16:125-40. 2. Sanguinetti MC, Mitcheson JS, Predicting drug-hERG channel interactions that cause acquired long QT syndrome, Trends Pharmacol Sci,2005;26: 119-24.  3. Lawrence CL et al, Nonclinical proarrhythmia models: Predicting Torsades de Pointes, J PharmacolToxicol Methods,2005; 52: 46–59 4. Guth BD, Preclinical cardiovascular risk assessment in modern drug development, ToxicolSci, 2007; 97, 4–20.  5. KettenhofenR,Bohlen H, Preclinical assessment of cardiac toxicity,  Drug Discov Today, 2008;13:702-7.  6. Sugiyama A Sensitive and reliable proarrhythmia in vivo animal models for predicting drug-induced torsades depointes in patients with remodelled hearts, Br J Pharmacol, 2008;154:1528-37.  7. 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Early testing scenarios and integrated risk assessment, (Bernard Faller and Laszlo Urban ed, Hit and Lead Profiling- Identification and Optimization of Drug-like Molecules, 2010; Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KgaA. 附件8 非临床安全性评价供试品检测要求的Q&A Q1.在非临床安全性评价中为何需进行供试品检测？ A：供试品是非临床安全性评价获得可信结果的基础。供试品分析揭示受试品的质量和配制的准确性，为临床前安全评价中发现的问题（如毒性与剂量关系等）提供可靠的科学参考。如果供试品存在问题，安评的结果可能失去了技术评价的价值，甚至可能误导新药的后期开发。鉴于供试品检测对于新药安全性评价具有重要意义，应该在安全性评价试验中进行供试品检测。 在开展非临床安全性评价之前，申请人向评价机构提供合格的供试品，该供试品质量符合已定的质量标准（提供检验报告），其有效期满足试验周期的要求（提供前期的稳定性研究报告）。 合格的供试品在给予动物之前，需要经过运输、保存、配制（混合、溶解或混悬、稀释等）、配制后保存、场内运输等过程，这些过程可能会影响供试品的稳定性。另外，样品配制后也需要分析确认配制的供试品浓度（含量）。 Q2.非临床安全性评价供试品检测适用范围？ A：化学药物。生物技术药物建议参考该要求执行，遵从Case by case的原则。 Q3.目前用于非临床安全性评价试验的供试品质量信息提供方面存在的主要问题？ A：供试品的重要信息缺失，如制剂来源、批号、纯度、浓度、处方组成、稳定性、溶解性、有效期、保存条件，供试品浓度和含量分析的方法学验证资料和配制后供试品质量检测结果等。另外，试验样品制备工艺不成熟，可能导致不同批次的样品质量（含量、纯度、杂质、晶型等）不一致，进而影响安全性评价试验数据的准确、可靠。 Q4.毒理试验申报资料中应有哪些供试品检测结果、信息？有何格式要求？ A：毒理试验报告中应该含有 （1）供试品的基本理化性质检验报告单：包含来源、批号、纯度、浓度、处方组成包括辅料、稳定性、溶解性、有效期、保存条件等信息。 （2）若供试品需经溶解后（混合、混悬、溶解）给药，应提供供试品在溶剂中的稳定性、均一性（非溶液体系）等检测报告（浓度范围需能覆盖全部毒理试验的浓度范围），以及配制后的供试品浓度分析报告。 （3）针对检测供试品浓度和含量分析的方法学验证报告。 报告中上述信息应完整，但在格式方面无严格要求。 Q5.谁提供供试品（原料药）质量检测报告？谁提供配制后的供试品含量分析方法的方法学验证资料？对照品如何要求？赋形剂作为阴性对照的要求？ A：供试品检测方法的建立和验证，可以由申请人（含生产者）、GLP试验机构或第三方完成，或由其中的一方完成后转移至另外一方进行检测；由验证方提供供试品检测方法学验证的资料。 配制后的供试品浓度分析方法的方法学验证资料，应由完成配制后的供试品浓度分析检测的GLP实验室提供。 必要时对对照品进行分析，对照品的分析要求与供试品相同。如果对照品为上市样品，其基本理化性质等资料可以参照对照品的说明书和/或标签。 如系采用特殊的赋形剂作为阴性对照，应由申请人（含生产者）提供该赋形剂质量检测报告。 Q6.申请人提供的供试品质量检验报告和GLP实验室配制后的供试品检测的关系？是否应该同时需要（如果必要）？ A：申请人对供试品的检测是确认其符合拟定的质量标准，能够作为供试品进行毒理学试验，该质量检验报告与供试品同时提供给试验机构，以作为试验机构进行供试品分析的基础。 GLP实验室开展的供试品分析是确认配制过程对稳定性的影响和配制的结果符合试验方案要求，是在配制后进行的。 质量检验与供试品分析两种检测都需要。 Q7.如何确保供试品和配制后供试品质量？ A：影响供试品的质量包括人员、仪器设备、配制后的保存条件、包装、贮存条件等，需保证每个批次的供试品均符一质检标准。 在进行正式毒理试验前，需对供试品的配制方法、配制后的保存条件下的稳定性、均一性进行检测和验证。验证通过后在正式试验时需严格按照要求保存和使用（如搅拌一定时间后使用）等，同时对保存条件（温度、是否避光等）进行严格控制。 涉及到供试品分析的各环节都必须遵从GLP规范。 Q8.是否一定需要按GLP要求进行供试品和配制后供试品的检测？ A：供试品（原料药或制剂）的质量检测可由申请人（含生产者）完成，但配制后供试品的检测工作必须在GLP条件下进行。 Q9.为何需要进行供试品与溶剂混合物的稳定性检测？是否每次配制时都应进行供试品浓度分析？ A：在首次配制前应完成稳定性分析，在前期稳定研究的基础上，对配制过程和配制后可能影响稳定性的因素都应进行研究，如溶媒、浓度、搅拌方法、温度、配制后储存时间等。应在这些研究完成后确定配药的频率，否则可能因质量改变(如含量明显下降或出现大量新杂质等)导致毒性暴露不充分或出现新的毒性。 无需在每次配药时均进行浓度分析。短期给药试验（如14天的试验）仅需在首次配制时检测供试品的浓度，但试验中如果伴随有TK试验，则TK给药当日的供试品也需进行浓度分析。对于长期试验（如1个月的试验），一般在首次及末次配制给药时进行供试品浓度分析（如果是每天配制，首末次配制日也是进行TK试验的日期）。如果试验周期更长（如3个月或长于3个月时），除首末次配制外，还需增加供试品浓度的检测次数，以确保供试品在该条件下的稳定性满足使用要求。 如果更换配制溶媒，需要重新进行方法学验证再测定。 Q10.如果液体供试品是采用高浓度受试品稀释后给药，如何选择分析的浓度（是否每个浓度都分析）？ A：建议每个配制后的浓度都进行分析。若确定为真溶液，采用系列稀释方法配制，测定低浓度即可。 Q11.何种溶液制剂（真溶液、混悬液等）需要进行均一性的分析？与固体饲料混合的产品如何进行混合物（含量、稳定性、均一性）的检测？ A：如果为混悬液则需要进行均一性分析，一般取混合后的液体上、中、下三部分进行分析。 混悬液等需在方法学验证时对配制方法均一性进行检测，后期试验使用验证后的配制方法进行配制。 固体饲料中供试品的含量检测要求如下： （1） 进行致癌试验饲料中供试品含量测定前须确认已完成该供试品测定的方法学确证，同时需确认饲料中供试品的提取方法，并确保饲料中的其他成分对供试品含量测定无干扰。 （2）采集饲料取样量一般为10 g左右。取样时一般在饲料的中部随机取样。取样后的饲料应按相应的保存条件保存并及时测定，测定结果偏差不得超过20%。 一般首、末批次的饲料均需进行供试品含量测定，且每3个月需增加一次供试品含量测定。 （3）均一性检测 测定时需同时从饲料的上层、中层及底部各取10 g左右饲料，测定供试品在饲料存在状态是否均一。测定结果的准确度介80%~120%，且RSD不超过20%时方可认为供试品在饲料中的均一性符合要求。 （4）稳定性检测 根据供试品的稳定性及保存条件，决定稳定性的测定周期。需同时测定饲料刚加工好后的供试品含量及按照饲料保存条件存放一定时间后的供试品含量。从饲料中层取10 g左右饲料，根据确定的供试品含量测定方法检测。结果评价：饲料存放一定时间后的供试品含量与刚加工好的供试品含量偏差不大于10%。 Q12.哪些情况下可不进行配制后供试品的检测？ A：（1）如供试品无需配制直接使用，在供试品的质检报告可提供试验所需的信息（含量、浓度、保存条件、有效期）时，无需进行检测。 （2）如供试品经过配制才可使用，建议所有的实验都进行配制后的供试品的分析。 Q13.供试品分析的内容？ A：包括： （1） 供试品分析 质检标准的建立，包括含量（浓度）、纯度、保存条件及有效期等。 （2） 配制后供试品分析方法的建立与验证 特异性、灵敏度、精密度与准确度、线性范围、溶液稳定性、均一性（上、中、下三层）等。 （3）分析指标 稳定性分析：分析配制过程和储存对供试品浓度和含量的影响。 浓度或含量分析：分析配制后的供试品浓度或含量，确认配制的准确性。 均一性分析：对非真溶液体系，开展均一性分析，对混悬液的上、中、下三层进行采样分析。 其他指标：必要时开展纯度等分析。 若无质量标准或无分析方法的供试品，应有详细说明，但只能用于非GLP试验。 Q14.配制后的溶液及混悬液浓度与理论浓度可接受的误差是多少？ A： 一般由专题负责人根据供试品的特性及具体毒理试验的要求在试验方案中确定该误差，但大部分实验室及大部分试验采用的范围是：溶液为±10％，混悬液为±15％。