流行性出血热诊断标准及处理原则GB 15996

流行性出血热诊断及处理原则GB 15996—1995 　 前 言 国际上将流行性出血热(EHF)与流行性肾病(Nephopathia epidemica，NE)等统称肾综合征出血热(Hemorrhagic　fever　with　renal　syhndrome，HFRS)。HFRS是由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus)中某些病毒引起和由某些啮齿动物携带传播的一类自然疫原性疾病。在我国流行的是EHF，黑线姬鼠和褐家鼠为其主要宿主动物和传染源，其传播主要通过与宿主动物或其排泄物(尿、粪)/分泌物(唾液)接融。EHF起病急，进展快，病死率高，早期诊断对降低病死率有着特殊的重要意义。 本标准的附录A，附录B，附录C都是标准的附录； 附录D是提示的附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出。 本标准起草单位：中国预防医学科学院病毒学研究所、中国预防医学科学院流行病学和微生物学研究所、西安医科大学第一附属医院。 本标准主要起草人：宋干、杭长寿、陈化新、张成文。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病监督管理办公室负责解释。 1 范围 本标准规定了流行性出血热(EHF)的诊断标准及处理原则。 本标准适用于各级、各类医疗、卫生、保健机构工作人员对EHF病人的诊断、预防和治疗。 2 诊断原则 依据患者的流行病学史、临床现及实验室检查结果的综合判断进行诊断，确诊须有血清学或病原学检查结果。 3 诊断标准 3.1 流行病学史 发病在EHF疫区及流行季节，或病前两月内有疫区旅居史，或病前两月内有与鼠类或其排泄物(尿、粪)/分泌物(唾液)直接或间接接触史。 3.2 临床表现 3.2.1 早期症状和体征：起病急，发冷，发热(38℃以上)；全身酸痛，乏力，呈衰竭状；头痛，眼眶痛，腰痛(三痛)；面、颈、上胸部充血潮红(三红)，呈酒醉貌；眼睑浮肿、结膜充血，水肿，有点状或片状出血；上腭粘膜呈网状充血，点状出血；腋下皮肤有线状或簇状排列的出血点；束臂试验阳性。 3.2.2 病程经过：典型病例有发热期、低血压期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过。前三期可有重叠，并存在有大量五期不全的异型或轻型非典型病例。 3.3 实验室检查 3.3.1 血检查：早期白细胞数低或正常，3～4病日后明显增多，杆状核细胞增多，出现较多的异型淋巴细胞；血小板明显减少。 3.3.2 尿检查：尿蛋白阳性，并迅速加重，伴显微血尿、管型尿。 3.3.3 血清特异性IgM抗体阳性，见附录A。 3.3.4 恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有4倍以上增高，见附录A。 3.3.5 从病人血液白细胞或尿沉渣细胞检查到EHF病毒抗原或EHF病毒RNA，见附录D。 3.4 病例分类 3.4.1 疑似病例：具备3.1及3.2.1。 3.4.2 临床诊断病例：疑似病例加3.2.2，3.3.1，3.3.2。 3.4.3 确诊病例：疑似病例或临床诊断病例加3.3.3，3.3.4，3.3.5中的任一项。 4 预防原则 采取以防鼠灭鼠及疫苗预防接种为主的综合性措施，抓好人间和鼠间的疫情监测，及时报告疫情，见附录B。 4.1 防鼠灭鼠 灭鼠应与防鼠紧密结合。搞好环境卫生及卫生整顿，清除鼠类栖息活动的隐蔽场所，开展以药物杀灭为主，居民区及其周围地区为主的灭鼠措施，在流行高峰期半个月前开展一次突击性灭鼠活动。根据疫区不同类型(家鼠型、姬鼠型、混合型)确定灭鼠重点，一般春季重点在居民区灭鼠，秋季重点在居民区周围及野外灭鼠。 4.2 野外作业工地及生活区的预防措施 进入前对施工区及宿营地区进行流行病学特别是疫源地的监测，施工期内做好防鼠灭鼠工作，加强个人防护措施。 4.3 个人防护 避免与鼠类及其排泄物/分泌物接触，以减少受感染的危险；对高发病区人群及对其他疫区高危人群接种疫苗。 5 治疗原则 抓好“三早一就”(早发现、早休息、早治疗、就近治疗)措施及发热期的治疗，包括抗病毒治疗、预防性治疗(预防低血压、少尿期出现)。通过综合性抢救治疗措施预防/控制低血压休克、肾功能衰竭、大出血(三关)，做好抢救治疗中的护理工作，见附录C。 附录A (标准的附录) 流行性出血热血清学诊断方法 A1 应用IgM捕获ELISA法检测EHF IgM抗体 A1.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人μ链多克隆或单克隆抗体捕获待测血清中的IgM，然后加入特异性抗原和酶标特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，加底物显色。显色程度与特异性抗体中的IgM抗体含量呈正相关。以待检血清与特异性抗原和阴性(对照)抗原反应()D值的比值，作为判定IgM抗体反应的标准。 A1.2 a)聚苯乙烯塑料板：40孔或96孔板，U型。 b)可变微量加样器：20μL和100μL各一支。 c)抗人IgM(μ链)：鼠抗人IgM(μ链)单克隆抗体或羊抗人IgM(μ链)多克隆抗体。 d)抗原：阳性抗原：细胞培养EHFV灭活抗原或基因工程表达抗原； 阴性抗原：未接种病毒的细胞培养抗原或无外源基因的相应表达系统抗原。 e)抗IgM阴性或阳性对照血清。 f)辣根过氧化物酶－EHF单克隆抗体标记物(HRP－McAb)。 g)包被液：0.1mol pH9.6的碳酸盐缓冲液(Na(下标始)2(下标终)CO(下标始)3(下标终))3.18g，NaHCO(下标始)3(下标终)5.88g，加蒸馏水至1000mL。 h)洗涤液(×10)：0.2mol pH7.4 PBS－T(Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O 51.6g，NaH(下标始)2(下标终)PO(下标始)4(下标终)·2H(下标始)2(下标终)O 8.7g，NaCl 76g，Tween－20 5mL，溶解至1000mL)高压后使用，临用前10倍稀释。 i)稀释液：上述10倍稀释的PBS－T液，含5％牛血清。 j)底物液：临用前取柠檬酸磷酸盐缓冲液(pH5.0)(柠檬酸10.2g，Na(下标始)2(下标终)HPO(下标始)4(下标终)·12H(下标始)2(下标终)O 36.8g，加水至1000mL)。 k)终止液：2mol/LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)。 A1.3 检测步骤 a)用0.1 molpH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗人IgM(μ链)单克隆抗体(或羊抗人IgM(μ链)，包被聚苯乙烯塑料板，每孔100μL，4℃过夜(或37℃ 2h)。 b)弃去包被液，用洗涤液重复洗3次，甩干。 c)加待检血清：将血清用PBS－T液稀释100倍，分别加入2反应孔，每孔100μL(如需设阳性和阴性血清对照亦同此法处理)，37℃ 1h。 d)弃去血清，用洗涤液重复洗5次，甩干。 e)加阳性抗原及阴性抗原：将阳性抗原用稀释液稀释至适当工作浓度，加入其中一反应孔100μL；阴性抗原同样稀释，加入另一反应孔，37℃水浴孵育2h或者置4℃过夜(效果更优)。 f)弃去抗原，用洗涤液重复洗5次，甩干。 g)加HRP－MCAb：将HRp－McAb用稀释液稀释至工作浓度，每孔加入100μL37℃1h。 h)弃去标记物，用洗涤液洗5次，甩干。 i)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液。放在室温暗处显色。 j)当观察到阳性抗原(或血清)对照显黄色而阴性抗原(或血清)对照为无色后，每孔加入50μL2mol/LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)终止反应。 A1.4 结果判断 a)酶标检测仪测定OD值(空白对照调零)，P/N＝2.1判为阳性(P：阳性抗原孔OD值；N：阴性抗原孔OD值)。 b)目测法：与对照孔比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄色，阴性抗原孔基本无色。 A1.5 意义 IgM抗体阳性表示患者新近感染EHF病毒。本法具有高度敏感性和特异性，特别适用于EHF早期特异性诊断。 A2 应用间接酶免疫吸附试验(ELISA)检测EHF IgG抗体 A2.1 原理 根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化病毒抗原包被塑料板，与1∶100连续稀释的待检血清中的特异性抗体结合，其中血清IgG部分又与后加入的酶标记的抗人IgG结合，通过酶与底物的作用产生可见的颜色反应，根据反应产物的多少，即颜色深浅进行抗体的定量测定。 A2.2 材料 a)聚苯乙烯塑料板及可变微量加样器：同A1.2。 b)包被阳性抗原和正常对照抗原：细胞培养EHFV抗原(灭活)或初步纯化的基因工程表达抗原为阳性抗原；未接种EHFV的细胞培养正常抗原或无外源基因的相应表达系统的抗原为对照抗原。将阳性抗原和对照抗原作2倍稀释，包被聚苯乙烯塑料板，4℃过夜。以适当稀释的EHF恢复期血清测定抗原，选其中特异性抗原孔OD值最高，而对照抗原孔OD值低于0.05的抗原稀释度为工作浓度。 c)辣根过氧化物酶标记抗人IgG(HRP-IgG)，按上述方法确定其工作浓度。 d)阳性对照血清(EHF病人恢复期血清)；待检病人血清(急性期和恢复期病人血清)。 e)抗原包被液，洗涤液，血清和结合物稀释液，底物液及终止液均同A1.2。 A2.3 检测步骤 A2.3.1 用0.1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被聚苯乙烯塑料板，每孔100μL4℃过夜(或37℃2h)，同时设阳性和阴性抗原各2孔，分别与阳性血清和待检血清反应。 A2.3.2 弃去包被液，用洗涤液重复洗3～5次，甩干。 A2.3.3 将待检血清从1∶100开始作4倍稀释，加入各抗原孔，每孔100μL37℃1h。 A2.3.4 弃去血清，洗涤液反复洗5次，甩干。 A2.3.5 加酶结合物，每孔100μL，37℃1.5h，同A2.3.4法洗6次，甩干。 A2.3.6 每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液，放室温暗处显色。 A2.3.7 当阳性抗原与阳性血清对照孔显黄色，而阴性抗原孔为无色(10～20min)后，每孔加入50μL2mol/LH(下标始)2(下标终)SO(下标始)4(下标终)终止反应。 A2.4 结果判断 a)目测法：即与阴性抗原孔相比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄色显色反应，判为阳性。 b)酶标检测仪测定OD值(空白对照调零)，P/N值大于2.1，判为阳性(P：阳性抗原孔OD/492值；N：阴性抗原孔OD/492值)。呈阳性反应血清最高稀释度的倒数，即为病人血清IgG抗体滴度。 A2.5 意义 恢复期病人血清比急性期血清IgG抗体滴度高，有4倍以上升高，可确诊感染，单份血清检测一般表明其曾受过出血热病毒感染，但抗体滴度大于等于1∶320时，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近毒感染。 A3 应用反向被动血凝抑制试验(RPHI)检测EHF总抗体 A3.1 原理 先将绵羊红血球以戊二醛固定，使其表面阴离子化，再经鞣酸或氯化铬(交联剂)处理，使提纯的特异性抗体吸附到醛化红血球表面致敏，此致敏血球与相应的特异性抗原相遇，即发生特异性抗原抗体反应而使血球凝集，称为反向被动凝集(RPHA)。将含特异性抗体的待检血清与已知抗原先混合，使发生特异性抗原抗体反应而将抗原上的结合位点占据，此时加入抗体致敏血球就不能再与已知抗原起反应，因而不产生血凝，此法称为反向被动血凝抑制(RPHI)。反向被动血凝试验是用来检查抗原的，而反向被动血凝抑制试验则是用来检测抗体的。 A3.2 材料 a)微量塑料板：96孔，U型。 b)可调微量加样器。 c)高效价兔抗EHF IgG致敏的绵羊红细胞，每支含3％冻干红细胞1mL，使用前用蒸馏水恢复至1mL，再用稀释液稀释10倍成0.3％。 d)EHFV抗原(液体或冻干)：使用前必须测定血凝素效价并稀释成4个血凝单位使用。 e)稀释液：pH7.2，0.01mol/L PBS，含1％兔血清，用来稀释所有试剂和被检血清。 A3.3 检测步骤 A3.3.1 抗原血凝单位测定：采用96孔U型板，每孔加入25μL稀释液，取抗原25μL作1∶2，1∶4，1∶8，……，1∶256倍比稀释，然后加0.3％致敏红细胞液25μL于微型振荡器上混匀后，放37℃水浴1h，观察结果，以出现十十的抗原稀释度(如1：64)为1个血凝单位，其前2个抗原稀释度(1∶16)为4个血凝单位。 A3.3.2 被检血清稀释及反应：在U型微量反应板，每孔加稀释液25μL，待检血清先作1：10稀释，取25μL加入第一孔作倍比稀释，然后每孔加入4个血凝单位抗原25μL，混匀，放37℃水浴(湿盒)中作用30min，每孔再加入0.3％致敏的红细胞液25μl，同上混匀，再放37℃湿盒中2h，观察结果。 A3.3.3 设EHF病毒抗原(4个血凝单位)及稀释液空白对照，必要时设EHF病人阳性血清及阴性(正常人)血清对照。 A3.4 结果判断 在所有对照都成立的前提下，以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度的倒数为血清抑制抗体效价。 A3.5 意义 本法可作血清流行病学调查，疫苗免疫血清抗体检测。单份血清检测到反向被动血凝抑制抗体阳性，表明该个体曾受过EHF病毒感染，一般恢复期抗体水平比急性期有4倍以上抗体增高，方可确定诊断。 A4 用血凝抑制试验(HI)检测EHF血凝抑制抗体 A4.1 原理 许多病毒都有血凝抗原(血凝素)，能选择性地与多种动物红细胞的受体作用，附着其表面，引起红细胞发生凝集反应，称为红细胞凝集现象，简称血凝(HA)。在血凝素中加入特异性抗体可抑制这种血凝反应，叫血凝抑制(HI)，可用于血凝抑制抗体的测定。 EHF病毒的血凝要求条件比较严格，如对提供红细胞的动物种属(鹅或鸽)和反应的pH值等。不同型的病毒的血凝素及相应的血凝抑制抗体有差异，据此可对病人血清进行分型，推测病人由哪种型别病毒感染。 A4.2 材料 a)微量塑料板：96孔，U型。 b)可调微量加样器：20μL和100μL各一支。 c)血凝抗原(血凝素)： 野鼠型血凝抗原用汉滩型病毒制备，血凝滴度为≥1∶64； 家鼠型血凝抗原用汉城型病毒制备，血凝滴度为≥1∶32。 d)稀释液： pH6.0磷酸盐缓冲液，用于制备新鲜鹅红细胞(60mL)； pH9.0硼酸－氢氧化钠溶液(含0.5％牛血清白蛋白)，用于稀释血凝抗原和待检血清。 e)参考血清： 汉滩型免疫血清，汉城型免疫血清。 f)鹅红细胞制备： 鹅翅下静脉抽血，注入阿氏液中混匀，用生理盐水洗涤3次，最后1次以2000r/min离心10min，弃上清，用pH6.0磷酸盐缓冲液稀释鹅红细胞为0.3％，4℃冰箱保存备用。 g)待检血清的处理： 取待检血清用生理盐水配成1∶10，用10倍量4℃冷丙酮处理2次，离心弃上清(丙酮)，将沉淀物真空或室温干燥；加入pH9.0硼酸－氢氧化钠溶液，恢复到1：10浓度，4℃冰箱过夜。于上述每管血清中加入0.05mL压积红细胞，混匀后37℃水浴吸附60min(中间摇动数次)，离心取上清，即为1∶10处理血清。 A4.3 检测步骤 a)血凝抗原单位测定： 在96孔U型微量板上，每孔加入25μLpH9.0硼酸－氢氧化钠稀释液，取待测血凝抗原25μL加入第一孔，并从第一孔起作倍比稀释，最后一孔混匀后弃去25μL，然后于每孔补加25μL稀释液，加入50μL0.3％新鲜鹅红细胞，混匀后置37℃水浴60～90min，观察结果。以最高抗原稀释度出现十十为一个血凝单位(如1∶64)。检测抗体(分型)时用4个血凝单位(即1∶16)。 b)血凝抑制试验： 在U型微量板中，每孔加25μLpH9.0硼酸－氢氧化钠稀释液，再于第一和第二孔及第八孔分别加入25μL待检已处理血清，再从第二孔起作倍比稀释至第七孔止，第八孔不加抗原作血清非特异性凝集对照。除第八孔外，每孔加25μL4个单位血凝抗原，混匀。放37℃水浴反应1～2h，再于每孔加入50μL0.3％鹅红细胞，混匀后置37℃水浴箱中，反应1～2h，观察结果。 A4.4 结果判断 以完全抑制鹅红细胞凝集血清的最高稀释度倒数为血凝抑制抗体效价。 A4.5 意义 血凝素主要定位在包膜糖蛋白上，血凝抑制抗体出现部分反映病毒包膜糖蛋白的特性，血清型别的判定依据同份血清与两种血凝抗原的反应滴度不同来区分。如果单份血清与汉滩型血凝抗原反应滴度高于与汉城型血凝抗原反应滴定4倍或4倍以上，即判为野鼠型，反之亦然。 A5 用免疫荧光试验(IFAT)检测双份血清IgG抗体 A5.1 原理 荧光素(如常用的异硫氰酸荧光素，FITC)与抗体(IgG，IgM)经化学偶联后不影响荧光素显示荧光及抗体与抗原发生特异性免疫反应，当特异性荧光抗体(即结合物)与宿主细胞内相应抗原结合后，在荧光显微镜下显示荧光，表明有特异性抗原的存在。直接免疫荧光法可用于检查感染细胞内的特异性病毒抗原，间接法可检查待检血清中的特异性抗体。此法具高度敏感性和特异性，是目前应用最广的一种血清学方法。 A5.2 材料 a)多孔EHF病毒抗原片，用国内外标准病毒株感染Vero－E6细胞制备，-20℃以下干燥保存。 b)羊抗人或兔抗人IgG荧光素结合物。 c)待检病人血清(急性期和恢复期)。 d)荧光显微镜。 e)常用稀释液，试剂及设备(振荡器等)。 A5.3 检测步骤 A5.3.1 用pH7.4～7.6PBS稀释待检血清，从1∶20开始2倍或4倍连续稀释至需要稀释度。 A5.3.2 取出抗原片，用蒸馏水漂洗一次，冷风吹干。 A5.3.3 用加样器依次从高稀释度至低释稀度方向逐个加入已稀释的待检血清，所需量以完全覆盖细胞抗原面为准。在37℃水浴箱湿盒内孵育30～45min。 A5.3.4 用0.01mol/L pH7.4～7.6PBS振荡洗涤3次，每次5min，再用蒸馏水洗1次，脱盐，冷风吹干。 A5.3.5 按使用说明书要求，用PBS(含1∶3×10(上标始)4(上标终)伊文思蓝)稀释荧光结合物，每孔加入量以完全覆盖细胞面为准，置37℃水浴箱湿盒内30min。然后同A5.3.4法洗涤、漂洗吹干。 A5.3.6 用荧光显微镜观察结果 A5.4 结果判断 细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，根据荧光亮度，阳性细胞在细胞总数中所占的比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。无特异性荧光者为“－”。检测抗体滴度时，以发出明显特异性荧光反应(＋)最高血清稀释度的倒数来表示。 A5.5 意义 血清荧光抗体阳性，表明提供血清的个体曾受过EHF病毒感染，一般单份血清不能对现症病人作出确诊，回顾性诊断要求双份血清，即恢复期血清抗体滴度比急性期有4倍以上抗体滴度升高。本法多用于回顾性诊断及血清流行病学的调查。 附录B (标准的附录) 流行性出血热的预防方法 B1 防制方法 EHF疫情防制：采取以灭鼠防鼠为主的综合性措施，对高发病区的多发人群及其他疫区的高危人群进行疫苗接种。 B1.1 灭鼠防鼠：采取以灭鼠和防鼠为主的综合性防制措施。必须加强组织领导，充分发挥爱卫会和三级卫生网的作用，争取农业、林业、水利、交通、城乡建设等有关部门的支持和积极配合。认真搞好环境卫生整治，清除鼠类栖息活动条件。坚持灭鼠和防鼠相结合，在搞好环境整治和防鼠的基础上，开展以药物杀灭为主的灭鼠措施。高发病区每年至少要在春秋季各开展一次突击灭鼠。家鼠型、野鼠型疫区均要在其流行高峰到来一个月之前进行灭鼠。家鼠型疫区可重点灭家鼠。野鼠型疫区必须灭野鼠，也要灭家鼠。混合型疫区春季着重灭家鼠，秋冬季着重灭野鼠。 B1.2 结合灭鼠进行药物灭螨。 B1.3 野外作业工地的预防措施：水利、农垦、矿产、国防、桥梁、铁路等大型野外作业工地，进入前应进行流行病学侦察和疫源地监测，如属EHF疫区或疫源地，必须加强组织和宣传，做好施工及宿营地区的灭鼠、防鼠工作。 B1.4 疫苗接种：对高发病区的青壮年(家鼠型疫区不分年龄)及其他疫区与鼠类及野外疫源地接触机会多的职业或工种等，包括有关医疗、护理、检验及防疫人员(高危人群)接种EHF灭活疫苗。应根据疫区类型选用相应类型的疫苗。疫苗接种应在流行高峰季节开始前一个月内完成，初次免疫一年后宜加强接种一次。疫苗接种应严格按照疫苗使用说明书进行，有禁忌症者严禁接种，过期疫苗不能使用。 B1.5 加强个人防护，尽量避免与鼠类及其排泄物(尿、粪)或分泌物(唾液)接触，灭鼠过程中要特别注意个人防护。进入野外疫源地作业及留宿时，必须加强个人防护，防止接触感染。 B2 监测方法 EHF疫情监测包括人间疫情监测(人群感染及发病情况)和鼠间感染情况监测等。通过监测，为确定EHF防制对策和措施提供依据。 B2.1 人间疫情监测 B2.1.1 监测内容 a)以县为单位，设专人负责疫情监测和疫情管理，及时掌握辖区内的疫情数字。每年画出当年的疫情分布地图，按月统计发病数、死亡数，按年统计发病率、死亡率和病死率，分析疫情动态和发展趋势。 b)对临床可疑病例，应采血检查抗体，以确定诊断及核实疫情，并根据确定的误诊和漏诊病例，及时修正疫情报告数字。 c)对需核实诊断的可疑病例，以及新发现疫区，偶发或散发疫区的病例，均应进行个案调查。 d)抽样用分型血凝抑制试验(HI)对病人进行感染病毒型别的血清抗体分型，每隔2～3年用IFAT法对正常人群进行一次血清抗体水平(隐性感染)及HI法分型的监测，以确定当地EHF病毒的型别及人群的免疫水平。 B2.1.2 监测方法 首先要把固定监测点所在地区(乡或镇)和所属行政地区(省、地和县)疫情的人群间、时间、空间分布进行系统的分析和描述。分析疫情分布的方法是：将报来的疫情资料(姓名、性别、年龄、职业、住址、发病和死亡时间等)按人群、地区、时间统计，计算发病数、发病率、死亡数、死亡率和病死率。在描述疫情分布时，应观察全人口和全人口中的所有病例。要考虑报来疫情的可靠性，必要时应作疫情漏报调查和个案调查。要求用血清学方法核实疫情。 B2.1.3 血清学核实疫情 根据监测点实际条件，可在以下方法中任选一种：间接免疫荧光法、反向被动血凝抑制试验或酶联免疫吸附试验。在混合型疫区可进行抗体分型检测。详见《流行性出血热防治手册》实验室诊断部分。 B2.2 鼠间感染情况监测 B2.2.1 监测内容 a)以县为单位，逐步查清居民区及野外的鼠种构成、分布、密度、带病毒率及血清抗体阳性率。 b)选预料有可能爆发疫情的地区，对该地区主要宿主鼠种的密度和带病毒率进行定点监测，根据需要对其他可能有疫情爆发的地区进行不定期的监测。监测应在两型EHF高峰前一个月内进行。 c)对疫区内的实验动物饲养场的大白鼠、小白鼠和家兔等，应定期(至少一年一次)进行EHF病毒感染的血清学监测。一旦发现EHF病毒感染，应在监督下将全部大白鼠等销毁，饲养房舍内外进行彻底消毒和灭鼠。 B2.2.2 监测方法 B2.2.2.1 监测地区选择：应选择不同地理景观(平原、丘陵、山区等)地区。 居民区应选居住条件、生活条件、卫生条件均较差的地区；野外应选在河流、水渠、道路两旁、田埂、坟地和场院等可能有鼠类栖息活动的地方；长途汽车站、火车站、轮船码头等的货栈仓库亦应监测。 B2.2.2.2 监测时间：每年3、4月和9、10月，分别在城镇、农村居民区和野外同时进行监测。 B2.2.2.3 监测对象和数量：各个监测点应在居民区和野外各捕获当地优势鼠种100只以上；实验用大白鼠、小白鼠和家兔等，应抽查饲养量的5％。 B2.2.2.4 监测和计算方法 B2.2.2.4.1 居民区放鼠夹方法：每15m(上标始)2(上标终)房间放鼠夹一个。诱饵用花生米或油条、油饼(一个地区应选用同一种诱饵)。晚上将鼠夹放在鼠类经常出没活动的场所，用粉笔在放夹附近墙上画箭头标志。次日晨取回鼠夹，将捕获鼠放在塑料袋(或白布袋)内，编号，做好，并系紧袋口。 B2.2.2.4.2 野外放夹(或笼)方法：应选有鼠活动的地方，行距30m以上，夹(或笼)距5m，诱饵应统一，天黑前将夹(或笼)放完，次日晨收回；如捕白天活动的鼠，在同一地点放24h后再更换放夹(或笼)地点。其间早晚应各检查一次，并取回捕获鼠类，补充诱饵。 B2.2.2.4.3 捕获鼠分类鉴定：应写学名，参考《医学动物分类鉴定》确定鼠名。 B2.2.2.4.4 剖取鼠肺和采取鼠血标本：取分类鉴定的鼠，用酒精棉将鼠胸部的皮毛消毒，剪开胸腔，用镊子提取鼠肺并剪下，放入编号的小塑料管内，将盖盖好再用胶布封口，放入液氮罐内保存。在剪取鼠肺时，用滤纸条(7cm×1cm)沾取鼠血，阴干后扎在一起用塑料袋包好放入液氮罐中保存。 上述标本带到实验室后，应及时放到超低温或低温冰箱内保存，或尽快分装检测。 B2.2.2.4.3 用直接免疫荧光法检测鼠肺抗原：将鼠肺冷冻切成4～5μm薄片，沾附在有孔的载玻片上，风扇吹干后，冷丙酮固定7min，过一次蒸馏水吹干。滴加直接荧光血清，于37℃水浴锅中的搪瓷盘内结合30min，用0.01mol/LpH7.2 PBS振洗3次，每次1～2min，用蒸馏水洗3次，吹干。缓冲甘油封片后，用荧光显微镜观察。在鼠肺上皮细胞质内见颗粒状黄绿色荧光即为特异性抗原。 B2.2.2.4.4 用间接免疫荧光法检测鼠血抗体：取出抗原片吹干，编号，剪下圆形血片，放在抗原片圆孔内，滴加一滴PBS，使血片变湿，将载玻片放入37℃水浴锅中的搪瓷盘内，30min后取出，用PBS振洗3次，再用蒸馏水洗3次，吹干，滴加羊抗鼠荧光血清，再放入水浴锅中结合30min后，PBS振洗3次，蒸馏水洗3次，吹干，封片，镜检。在细胞质内见黄绿色颗粒即为特异性抗体阳性。 B2.2.2.4.5 鼠种构成按式(B1)计算： B2.2.2.4.6 总鼠密度及每种鼠密度分别按式(B2)、(B3)计算： B2.2.2.4.7 鼠总带病毒率及每种鼠带病毒率分别按式(B4)、(B5)计算： B2.2.2.4.8 带病毒鼠指数按式(B6)计算：可按各种鼠总数及每种鼠计算。 附录C (标准的附录) 流行性出血热的治疗方法 目前仍然要采取综合性治疗。首先应抓好“三早一就”(即早发现、早休息、早治疗和就近治疗)。针对各期的病理生理改变，在各该期到来之前采取预防性治疗和防治合并症的治疗，特别是应抓好抗病毒治疗及液体疗法。对重症患者要抓紧抗休克、预防出血及肾功能衰竭的治疗。 C1 发热期的治疗 治疗原则为抗病毒、抗渗出、抗出血。 C1.1 尽早卧床休息，给予高热量，多维生素，易消化饮食。对呕吐不能进食者，应静脉补充平衡盐液和葡萄糖液。 C1.2 维持水、电解质、酸碱及血浆渗透压平衡：发热早期，成人补液量一般约为每日1500mL左右，对有呕吐、腹泻者应酌情增加，补液尽量口服，不足部分静脉补充。发热后期，多有血液浓缩，应静脉补液，采取以平衡盐液为主的综合性液体疗法。同时注意热量摄取(可用高渗葡萄糖液)，并给予大剂量(5g)维生素C和维生素E。部分病人发热后期中毒症状严重，有恶心、呕吐，应按照病情调整和保持酸碱平衡。对外渗现象明显者，应静脉补充低分子右旋醣酐、血浆或人血白蛋白。 C1.3 抗病毒药物治疗：一般5病日内应用效果好。病毒唑成人一般每天1.0g，分二次静脉滴注。疗程5～7d。病程早期，重症病人可选用恢复期血清(20～30mL，一次肌注)，干扰素(100～300万u/日，肌注，连续3～5d)。 C1.4 发热后期，每日尿量少于1000mL或每小时平均尿量小于40mL为少尿倾向，应及时采用预防性治疗，可酌情应用利尿剂。 C1.5 对高热，中毒症状严重者，可选用氢化可地松(每次100～200mg)或地塞米松(每次5～10mg)，稀释后缓慢静脉滴注。 C2 低血压期治疗 以积极补充血容量为主，并针对微循环功能障碍、酸中毒、心功能不全等，进行相应的治疗。力争血压尽快回升，于4h内达到稳定。补充容量应早期、快速、适量。 C2.1 补充血容量 C2.1.1 液体成分：以综合性液体(如平衡盐液，低分子右旋醣酐溶液)为主。渗出严重者胶体液量可加大(血色素每上升1mL约需150mL)，但低分子右旋醣酐24h用量不得超过100mL。有条件者，可用血浆或人血白蛋白等胶体溶液。 C2.1.2 早期扩容：收缩压低于13kPa(100mmHg)，或较其本人基础血压低2.7kPa(20mmHg)，应立即补液扩容。 C2.1.3 快速扩容：低血压时静脉快速滴注，100滴/min左右。休克时首次300mL液体在30min内静脉滴注，随即静脉快速滴入200～300mL(130～150滴/min)。以后根据血压回升情况及血液浓缩改善程度，调整补液速度及补液量。快速补液应注意液体温度(适当加温)、输液反应及心肺情况。对老年及心肺功能不良者，补液速度适当减慢。 C2.1.4 适量扩容：根据达到下述五项指标，确定补液量。 a)收缩压达12～13kPa(90～100mmHg)； b)脉压差大于3.4kPa(26mmHg)； c)心率100次/min左右； d)微循环障碍缓解； e)红细胞、血红蛋白及红细胞压积接近正常。 C2.2 调整酸碱平衡：有酸中毒时，可选用5％碳酸氢钠溶液，或3.64％三羟甲基氨基甲烷(THAM)。 C2.3 强心剂的应用：当血容量基本补足，而心率仍在140次/min以上者，可选用西地兰或毒毛旋花子甙K。 C2.4 血管活性药的应用：经快速补液、强心、纠酸等处理后，血压回升仍不满意者，可酌情选用血管活性药物，如阿拉明、多巴胺等。有些病例选用阿托品、山茛著碱(654－2)等。 C2.5 皮质激素的应用：一般早期用氢化可的松200～300mg，或地塞米松10mg，每日1～2次，疗程不超过3d。低血压期应慎用，但遇大出血时可考虑使用。 C2.6 抗凝疗法：针对凝血像的变化，可选用潘生丁、鱼精蛋白或肝素治疗。基础无化验指标，对高凝、纤溶不易掌握，采用抗凝治疗应慎重。 C2.7 中药应用：在综合治疗的基础上，可用生脉散、四逆汤、参附汤静脉注射液等静脉滴注。 C3 少尿期治疗 尿量在500～1000mL/日为少尿倾向，在500mL/日以下为少尿，50mL/日以下为尿闭。为便于早期治疗，可以平均每小时尿量少于30mL为少尿，及时采取相应的治疗措施。本期的治疗原则为稳定体内环境，促进肾功能恢复，防止合并症。 C3.1 稳定体内环境 C3.1.1 水及电解质平衡：在功能性少尿阶段，每日可补充电解质溶液500～1000mL，同时应用利尿剂，使尿量保持在50mL/h以上。进入器质性少尿阶段，应限制液体量，即入量＝出量＋500mL液体，以高渗葡萄糖液为主。但应防止高血容量的出现而加重病情。除非确切有低钾外，一般应限制钾盐输入。 C3.1.2 每日糖量应不低于200g，热量不低于5kJ。每日蛋白摄入量为0.5g/kg。 C3.1.3 维持酸碱平衡：对于重症酸血症，CO(下标始)2(下标终)结合力低于13.47mmol/L者，应酌情纠酸。 C3.1.4 维持血浆渗透压(280～320mmol/L)及血压的稳定。 C3.2 促进利尿 C3.2.1 高效利尿剂：常选用速尿、利尿酸钠、丁尿胺等。 C3.2.2 血管扩张药：可用苄胺唑啉、安、巯甲丙脯酸等。 C3.2.3 提高血浆胶体渗透压：若血浆胶体渗透压降低者，可用人血白蛋白或血浆等。 C3.3 导泻疗法 常用甘露醇、硫酸镁、中药大黄、芒硝等。 C3.4 透析疗法 C3.4.1 透析指征 a)少尿超过5天或尿闭2天以上，经利尿等治疗无效； b)尿量增加缓慢，尿毒症表现日趋严重，血尿素氮大于28.56～35.7mmol/L(80～100mg/dL)； c)高血容量综合征经保守治疗无效，伴肺水肿或脑水肿、肠道大出血者，可与药物治疗同时进行； d)合并高血钾(6.5mmol/L)，心电图出现高血钾图形，用一般方法不能缓解者； e)凡进入少尿期后，病情进展迅速，早期出现严重意识障碍，持续性呕吐； f)大出血，尿素氮上升速度快，每日超过9mmol/L(高分解代谢型)，可不拘于少尿天数及血液生化指标，尽早透析。 C3.4.2 透析方法：血液透析或腹膜透析。 C4 多尿期治疗 渡过少尿期后，若每日尿量增至500～2000mL，为少尿向多尿移行阶段。超过2000mL，为进入多尿期。尿量超过3000mL为多尿。多尿早期仍按少尿期治疗原则处理，多尿数日后按本期的治疗原则调节水、电解质平衡，加强支持疗法。 C4.1 补充适量液体：补液原则上无需限制，但又不宜输入过多。一般多尿开始后，补液量可为尿量的三分之二(欠量补液)，以免延长多尿期。要维持出入量及电解质平衡。补液以口服为主，食欲不佳者，可静脉补液。 C4.2 支持疗法：患者应食用营养丰富，易消化，含钾量较高的饮食。对严重贫血及低蛋白血症者，可酌情输入新鲜血液、血浆或人血白蛋白。 C4.3 尿量超过3000mL/日应补钾，以口服为主，必要时可缓慢静脉滴入。同时注意钠、钙等电解质补充。 C4.4 对日尿量超过5000mL者，可试用安妥明或双氢克尿塞、垂体后叶素、消炎痛等。 C4.5 中药的应用：可选用金匮肾气汤或麦味地黄汤。 C5 恢复期的治疗 C5.1 继续注意休息，逐渐增加活动量。 C5.2 加强营养，给高糖、高蛋白、多维生素饮食。 C5.3 出院后可根据病情恢复情况，休息1～3个月，重型病例可适当延长。 C5.4 中药应用：可选用十全大补汤、六味地黄丸等。 C6 大出血治疗 应针对出血原因进行治疗，输鲜血是治疗出血的主要措施；输血量可根据病人出血情况，一般一次输鲜血300～400mL。如消化道出血，可用凝血酶稀释后口服，亦可用白药，或试用去甲肾上腺素，稀释后口服。如有DIC早期证据者，可选用肝素。如有继发性纤溶亢进者，可用6－氨基己酸或对羧基节胺。如有血游离肝素增高者，可用鱼精蛋白。血中尿素氮显著增高者，要配合透析疗法，以降低血中尿素氮含量。 C7 加强护理工作 各期护理重点为： C7.1 发热期 C7.1.1 密切观察体温变化，做好高热患者护理。体温过高时，应及时采取物理降温，并与医生联系。 C7.1.2 及时查尿，观察尿蛋白变化。 C7.1.3 定期测量血压，以便及早发现低血压倾向。 C7.2 低血压期 C7.2.1 严密观察血压变化情况，每15～30min测量血压一次，并作好记录。 C7.2.2 注意补液速度，早期应快速补液，用血管活性药物时，应根据血压情况，调整药物滴入速度，防止血压骤升骤降。并应注意输液反应。 C7.2.3 注意尿量，及早发现少尿倾向。 C7.2.4 让患者绝对卧床，严禁搬动，以防血压波动。 C7.3 少尿期 C7.3.1 准确记录出入量，入量＝出量＋500mL。 C7.3.2 做好病人的清洁护理，定时帮助病人翻身，严防继发感染。 C7.3.3 密切观察病人出血情况。 C7.4 多尿期 加强营养。注意水和电解质平衡。 附录D (提示的附录) 流行性出血热病原学诊断方法 D1 用单克隆抗体检查早期病人血液白细胞中EHF病毒抗原 D1.1 原理 流行性出血热病人发病早期不仅有短期的病毒血症，在其循环血液白细胞中也携带有EHF病毒抗原，可用免疫荧光法检出这种抗原。应用特异性单克隆抗体免疫荧光结合物的直接免疫荧光法检查病人白细胞特异性抗原，在病程5天内阳性率可达80％以上，有利于本病的早期诊断。 D1.2 材料 a)多孔载玻片，染色缸，微振荡器，荧光显微镜等同间接免疫荧光法。 b)白细胞分离液(聚蔗糖泛影葡胺溶液)。 c)0.02mol/L pH 7.4PBS。 d)无水丙酮。 e)EHF病毒单克隆抗体荧光素结合物(A25－1－FITC)。 f)伊文思蓝(Evans Blue)PBS液1∶3万。 D1.3 检测步骤 D1.3.1 病人血液白细胞的分离：静脉采取病人全血5mL，置于含肝素(125μg/mL)0.5mL的试管内，摇匀。将抗凝全血沿试管壁缓慢加入预先装有5mL白细胞分离液的试管内。1500r/min离心15min。此时从上至下分为四层：血浆、白细胞、白细胞分离液和红细胞。吸出白细胞层放入另一试管中，用PBS振洗二次，每次洗后用2500r/min离心5min，弃上清液，沉淀物加1mL1640液，即为压积总白细胞(包括淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞)悬液。 D1.3.2 白细胞抗原片的制备：取上述白细胞悬液，摇匀，滴加于多孔载玻片上，紫外线照射15min，冷风吹干，冷丙酮(4℃)固定20～30min，吹干即为白细胞抗原片。 D1.3.3 染色观察：取吹干的白细胞抗原片，加EHF病毒单克隆抗体荧光素结合物(用1∶3万伊文思蓝的PBS稀释到使用浓度)，37℃水浴箱湿盒中孵育45min，取出，用PBS振洗3次，每次3～5min，蒸馏水漂洗一次，吹干后镜检。 D1.4 结果判断 荧光显微镜下查白细胞胞浆有颗粒性或团块状荧光，其亮度在“十”以上，而阴性对照无荧光反应时，即为阳性。 全视野细胞均有荧光颗粒为“＋＋＋＋”； 3/4视野细胞有荧光颗粒为“＋＋＋”； 2/4视野细胞有荧光颗粒为“＋＋”； 1/4视野细胞有荧光颗粒为“＋”； 多视野查不见细胞有荧光颗粒为“－”。 D1.5 意义 在白细胞中查见EHF抗原，可确诊为此病，因此时不能获100％阳性结果，可同时检查同份血标本特异性IgM抗体。 注：如用EHF病毒分型单克隆抗体荧光素结合物检查白细胞抗原片，可同时区分病人感染EHF病毒的型别。 D2 用EHF病毒核酸杂交探针检测早期病人血液白细胞中EHF病毒RNA D2.1 原理 EHF病人外周白细胞携带有EHF病毒抗原，也能从白细胞中分离出血热病毒，说明白细胞中有病毒的复制，用特异性核酸探针可以检测到病毒RNA(根据碱基配对原理)。 D2.2 材料 a)一般材料试剂及检测步骤详见B1.2和B1.3。 b)洋地黄毒昔配体(Digoxigenin，Dig)DNA标记及检测试剂盒。 EcoR I PstI内切酶 Proteinase K c)汉城病毒R(下标始)22(下标终)株R(下标始)3(下标终)cDNA克隆(在PUC18载体EcoR I切点插入)或Hantaan病毒S片段cDNA克隆或M片段cDNA克隆(在PBR322Pst I酶切位点插入)。 d)杂交缓冲液：50％甲酰胺，10％硫酸葡萄糖，1×Denhardt液，2×SSC，400μg/mL鱼精DNA。 e)20×SSC，800mL水中溶解175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠，加数滴10mol/L氢氧化钠，调pH至7.0，加水至1000mL。按比例稀释成5×SSC，2×SSC等。 D2.3 检测步骤 a)Dig标记cDNA探针方法： 取EHFV R(下标始)3(下标终)(或HTN S或M)克隆cDNA，双链线状DNA3～10μg。95℃变性10min，置冰水中，然后加入：1μg变性cDNA(5μL)，2μL六聚核苷酸混合物，2μLdNTP和Digoxigenin混合物，19μL蒸馏水，1μLKlenow，置37℃孵育过夜，加2μL0.2mol/LEDTA，加2μL4mol/L氯化锂及75μL乙醇，置—70℃至少30min或—20℃至少2h，12000r/min离心10min，70％冷乙醇漂洗一次，真空干燥后，加50μLTE液(10mmol/L和1mmol/L)(pH8.0)溶解，待用。 b)白细胞抗原片的制备及杂交： 1)白细胞悬液按D1.3.1方法制备。 2)白细胞片的制备：常规清洗载玻片置5×SSC和1×Denhardt混合液中37℃过夜或56℃干燥4h，蒸馏水漂洗一次，转入乙醇/冰乙酸(3∶1)混合液，放置20min，取出晾干备用。 白细胞滴于涂有聚乙烯醇的玻片上，56℃干烤2h，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，每次10min。经30％，60％，80％，95％，100％乙醇脱水，在每一溶液中保留3min，晾干后置含0.5％过氧化氢的无水甲醇中10min(去内源性酶)，无水乙醇洗2次，每次5min。经94％，80％，74％，60％，30％的乙醇水溶液和PBS中水化及洗涤，置0.1mol/L盐酸中10min，PBS洗3次，置含0.01％TritionX－100PBS中1.5min，PBS洗3次，每次10min。用Proteinase溶液消化(0.5μg/mL)15min，PBS洗3次(PBS含2mg/mL甘氨酸)，每次3min。用4％多聚甲醛固定5min，再按上法用PBS洗，最后在30％，80％，95％，100％乙醇溶液中脱水，每次3min。 c)杂交： 杂交液中按比例1μg/mL加入探针DNA，将杂交溶液加在载玻片孔内，用硅化盖玻片盖上，周围用胶泥封闭，在120℃干燥箱中变性5min，迅速移至冰水中冷却，然后置湿容器中42℃杂交45h，去除盖玻片，载玻片在2×SSC中洗2次，每次10min，0.2×SSC60℃条件下洗2次，每次10min，2×SSC洗10min及PBS中洗一次。 探针检测：切片放入含10％小牛血清缓冲液中，37℃ 10min，再在1∶25碱性磷酸酶标记的抗Digoxigenin抗体中2h，PBS洗3次，置入显色液中3h，甘油封片，普通显微镜检查。 D2.4 结果判断 以正常人白细胞标本为对照，可在白细胞胞浆中观察到明显的着色信号，即为杂交阳性。 D2.5 意义 白细胞杂交检测阳性的可以确诊为EHF病毒感染。 D3应用RT－PCR技术检测EHF病毒基因及进行基因分型 D3.1 原理 PCR技术(聚合酶链式反应)是利用双链DNA分子碱基配对原则，和在一定条件下(耐热TaqDNA聚合酶及特异性引物等)扩增DNA片段的体外方法。其过程与病毒DNA的天然复制过程类似。它的特异性是由两个人工合成的寡核苷酸引物的序列决定的。引物与待扩增片段两条链两端DNA序列分别互补，扩增片段末端由两引物5′端限定，它的实质是一个重复进行的热变性－复性(退火)延伸的温控循环过程。待扩DNA在变性温度下解链成两条单链模板，在复性温度下，引物与模板的两端分别复性(杂交－碱基配对)，在延伸温度和单核昔酸存在的条件下，由TaqDNA聚合酶催化，引导引物的5′→3′端方向延伸合成新链。合成产物再变性又成为下一循环的模板。随着循环次数的增加，DNA产量呈指数上升。从理论上讲，20个循环后，产量应为2(上标始)20(上标终)，而从微量基因材料(Pg水平)特异性扩增可达几百万倍(μg水平)。EHF病毒含RNA基因组，在进行PCR之前，需将其通过逆转录酶作用合成第一链cDNA(RT)，然后按上述原理及方法进行扩增(PCR)，故称RT－PCR。设计不同型病毒的引物对，可以分别准确扩增出不同的基因型病毒的基因产物，故可作病毒的分型检测。 D3.2 意义 此法可用来对出血热病毒基因的鉴定及分型，分型的结果与血清学(特别是空斑减少中和试验PRNT)的分型结果一致，且具有更高的敏感性及特异性。在实践中有的病毒基因cDNA可以同时用两型引物扩增，有的均不能扩增，这时应考虑其他基因型的存在。