野柿子树叶单宁的半仿生法提取及抗氧化性分析

野柿子树叶单宁的半仿生法提取及抗氧化性分析 余先纯１，２，吴 瑛２，韩大良２ （１．中南林业科技大学材料科学与工程学院，长沙 ４１０００４； ２．岳阳职业技术学院基础部／岳阳市洞庭湖区特色中药材综合利用重点实验室，湖南 岳阳 ４１４０００） 摘要：采用半仿生法提取野柿子树叶单宁，对其提取工艺进行优化，并对其抗氧化能力进行检测。结果表明，采用半仿生法能够提高单宁对ＯＨ·、ＤＰＰＨ·和ＡＢＴＳ＋·等自由基的清除能力，其ＩＣ５０值均低于水浴加热法及酶法提取。正交试验优化得到的最佳工艺条件为提取温度４０ ℃、提取时间６０ ｍｉｎ、溶剂体积分数５０％、３次提取液ｐＨ分别为２．０、７．８和９．０以及原料粒度１２０目。在此条件下，单宁提取量可达２０６．８ ｍｇ／ｇ，远高于水浴加热法及酶法提取的样品。 关键词 ：野柿子树叶；单宁；半仿生法；抗氧化能力 中图分类号：Ｓ７９２．９９文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）01－0148-04 ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０38 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｎｎｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｗｉｌｄ Ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ Ｌｅａｆ ｗｉｔｈ Ｓｅｍｉ－Ｂｉｏｎｉｃ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＹＵ Ｘｉａｎ－ｃｈｕｎ１，２，ＷＵ Ｙｉｎｇ２，ＨＡＮ Ｄａ－ｌｉａｎｇ２ （１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４， Ｃｈｉｎａ；２． Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｋｅｙ Ｌａｂ. ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｙｕｅｙａｎｇ Ｄｏｎｇｔｉｎｇ Ｌａｋｅ Ａｒｅａ， Ｙｕｅｙａｎｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｙｕｅｙａｎｇ ４１４０００， Ｈｕｎａｎ， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔａｎｎｉｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｗｉｌｄ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｌｅａｆ ｕｓｉｎｇ Ｓｅｍｉ－Ｂｉｏｎｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ. Tｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ of ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｄａｔｉｏｎ activity ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｓｅｍｉ－Ｂｉｏｎｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｍｐｒｏｖｅd ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔａｎｎｉｎｓ ｏｎ ｒａｄｉｃａｌｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＯＨ·， ＤＰＰＨ·， ａｎｄ ＡＢＴＳ＋·. The ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｌｏｗｅｒ than that of ｔｈｅ ｗａｔｅｒ－ｂａｔｈ ｈｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ｍｅｔｈｏｄ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ yield of ｔａｎｎｉｎ ｒｅａｃｈed ２０６．８ ｍｇ／ｇ， ｈｉｇｈer ｔｈａｎ that of ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｗａｔｅｒ－ｂａｔｈ ｈｅａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ： ４０ ℃ ， ６０ ｍｉｎ， ５０％ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍａｓｓ ｆｒａｃｔｉｏｎ， ｔｈｒｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ with ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ２．０，７．８， ａｎｄ ９．０， ａｎｄ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ of １２０ ｍｅｓｈ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｉｌｄ ｐｅｒｓｉｍｍｏｎ ｌｅａｆ； ｔａｎｎｉｎ；Ｓｅｍｉ－Ｂｉｏｎｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ 收稿日期：２０１４－０５－１５ 基金项目：湖南省科技计划项目（２０１３ＧＫ３１８４） 作者简介：余先纯（１９６９－），女，湖南岳阳人，教授，硕士，主要从事生物质材料综合利用研究，（电话）１３０３７３０２０３２（电子信箱）ｓｄｌｙｘｃ＠１６３．ｃｏｍ。 单宁是一种存在于植物中具有多酚羟基结构的水溶性物质，能与金属离子螯合，并能与蛋白质、生物碱、多糖等发生反应。具有优异的生物活性、较强的抗氧化性［１，２］、优良的抗病毒活性以及抑制致癌物及肿瘤活性等功能［３，４］，在预防和治疗自由基所引起的疾病、抗艾滋病、抑制脂质及其他物质的过氧化作用等方面显示出独特的优越性，广泛用于医药［５］、食品、皮革及印染工业。 目前，国内外单宁的生产主要是采用水浴加热法和酶法从黑荆树皮和松树皮中提取，这不仅会损伤活立木，而且提取的时间长、单宁的生物活性也难以保证。半仿生法（ＳＢＥ）作为一种新型的提取工艺，在生物制药中具有较好的前景，它采用活性指导下的导向分离方法，从而保证被提取物的生物活性［６］。而野柿子的青果和树叶中均含有丰富的柿子单宁，且野柿子树在湘西地区分布广泛。本研究以野柿子树叶为原料，采用半仿生法提取野柿子树叶单宁，对其提取工艺进行优化，检测其抗氧化能力。这种方法不仅不会损伤林木，且在一定程度上能够保证单宁的生物活性，同时也能为从树叶中提取单宁，并保证其活性提供一种切实可行的方法。 １ 材料与方法 １．１ 原料与设备 野柿子树叶（采自湘西地区），乙醇、乙酸锌、ＥＤＴＡ、铬黑Ｔ等试剂均为分析纯。 主要设备有ＳＨＺ－８２型数显水浴恒温振荡器、ＦＷ１１７型中草药粉碎机。 １．２ 方法 1）将杀青后的野柿子树叶干燥、粉碎至３０目，用溶剂与水按一定的比例混合后作为提取溶剂，模拟胃肠道的ｐＨ（表１），在一定的温度下回流提取３次。 2）将３次提取所得提取液合并，４ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心３０ ｍｉｎ，除去残渣，将得到的分离液经过真空浓缩后在５０～６０ ℃温度下干燥，即得到野柿子树叶单宁。 3）按照上述步骤，在其他条件相同的情况下，用酶法和水浴加热法进行对比试验。 4）在探索性试验的基础上以提取液ｐＨ、溶剂体积分数、提取时间、提取温度、原料粒度等为因素进行单因素试验。 5）正交试验：用乙醇为溶剂，采用Ｌ１６（４５）正交试验对提取液ｐＨ（Ａ）、溶剂体积分数（Ｂ）、提取时间（Ｃ）、提取温度（Ｄ）、原料粒度（Ｅ）５个有重要影响的因素进行，正交试验因素和水平如表２所示。 １．３ 单宁含量测定 采用乙酸锌络合滴定法测定单宁的含量［７］。 １．４ 清除自由基能力测定 清除ＯＨ·能力的检测参照Ｓｍｉｍｏｆｆ的方法［７］；清除ＤＰＰＨ·能力的检测参照文献［８，９］的方法；清除ＡＢＴＳ＋·能力的检测参照文献［１０，１１］的方法。 ２ 结果与分析 ２．１ 单因素试验结果 ２．１．１ 提取液ｐＨ的影响 选取提取液为体积分数６０％的乙醇、提取时间６５ ｍｉｎ、提取温度５０ ℃及原料粒度８０目进行试验，其ｐＨ按照表１中的设置进行调节，进行９组试验，结果如图１所示。由图1可知，７号试样的单宁提取量最高，达到１９９．３ ｍｇ／ｇ，即酸性环境ｐＨ ２．０、弱碱性环境ｐＨ ７．５、碱性环境ｐＨ ９．５，因此，后续试验中提取液的ｐＨ分别采用２．０、７．５和９．５。 ２．１．２ 溶剂体积分数的影响 分别用体积分数为４０％、５０％、６０％、７０％和８０％的甲醇、乙醇、丙酮溶液作为提取液，在酸性环境、弱碱性环境和碱性环境中的ｐＨ分别为２．０、７．５、９．５，每次提取时间６５ ｍｉｎ、温度４５ °Ｃ、原料粒度８０目。试验结果如图２所示，体积分数为６０％的乙醇溶液的单宁提取量最高，同时还可以看出，当乙醇用量超过６０％后单宁提取量有下降的趋势。这可能与单宁的组成和性质相关，乙醇体积分数在６０％时，单宁的溶解度达到最大，而乙醇体积分数在远离６０％时，混合溶液对单宁的溶解具有选择性，即在小于６０％时，提取的可能是水溶性单宁，而在大于６０％时，提取的可能是醇溶性单宁［１２］。因此，可选取６０％的乙醇溶液作为提取液。 ２．１．３ 提取时间的影响 选取６０％乙醇为溶剂，３次提取液的ｐＨ分别为２．０、７．５、９．５，提取温度４５ ℃，不同提取时间和原料粒度对单宁提取量的影响如图３所示，在相同时间内原料粒度越细，单宁的提取量越高，但粒度为１６０目的提取量与１２０目的相比差异不明显。在原料粒度为１２０目及１６０目时，提取量随着时间的延长而快速增大，６５ ｍｉｎ后，提取量增幅减缓。这是因为在提取初期，野柿子树叶中单宁的含量较大，因此提取量快速增加；随着时间的延长，单宁的含量逐步减少，故提取量增加较少。因此，选择提取时间为65 min。 ２．１．４ 提取温度的影响 选取6０％乙醇为溶剂，３次提取液的ｐＨ分别为２．０、７．５、９．５，提取时间为６５ ｍｉｎ，不同提取温度和原料粒度对提取量的影响如图４所示，原料粒度为１２０目及１６０目时，在温度４５ °Ｃ时单宁提取量达到最大，然后开始下降。这可能是由于单宁的结构稳定性较差，高温加热发生氧化或水解反应使提取量降低。因此，提取温度选择45 ℃。 ２．１．５ 原料粒度的影响 原料粒度对单宁提取率的影响见图３及图４，用乙醇提取野柿子树叶中的单宁，粒度４０目时，单宁的提取量最低，１６０目时提取量最高，虽然原料粒度１６０目高于原料粒度１２０目的提取量，但二者差异不明显。从生产成本角度考虑，野柿子树叶单宁的原料粒度以１２０目为最佳。 ２．２ 正交试验结果 正交试验结果与极差分析如表３所示。由表３可知，影响野柿子树叶单宁提取量的因素大小顺序为Ｄ、Ｃ、Ｂ、Ａ、Ｅ，工艺的最佳组合为Ａ４Ｂ３Ｃ３Ｄ４Ｅ２，即：提取温度４０ ℃、提取时间６０ ｍｉｎ、溶剂体积分数５０％、3次提取液ｐＨ ２．２、７．８和９．０、原料粒度１２０目。按上述最优条件进行３次验证试验，单宁平均提取量为２０６．８ ｍｇ／ｇ。而水浴加热法所得单宁的提取量为１９６．２ ｍｇ／ｇ、酶法所得单宁的提取量为１６２．５ ｍｇ／ｇ。 ２．３ 清除自由基能力 表４中为水浴加热法、酶法及半仿生法所提取的单宁对自由基清除的情况。采用半仿生法提取的单宁对ＯＨ·、ＤＰＰＨ·和ＡＢＴＳ＋·的清除率均高于水浴加热法及酶法。这可能是因为野柿子树叶单宁在水浴加热法及酶法提取中发生氧化、异构等变化。而半仿生法工艺可以降低提取温度、缩短提取时间、防止高温下单宁的氧化，因此不会对其分子结构与理化性质产生过大的影响，并保持了单宁的生理活性。 ３ 小结 采用半仿生法提取野柿子树叶单宁最佳工艺条件为提取温度４０ ℃、提取时间６０ ｍｉｎ、溶剂体积分数５０％、３次提取液ｐＨ分别为２．２、７．８和９．０、原料粒度１２０目。在此工艺条件下单宁提取量可达２０６．８ ｍｇ／ｇ，高于水浴加热法及酶法所提取的单宁提取量，且得到的单宁对ＯＨ·、ＤＰＰＨ·和ＡＢＴＳ＋·等自由基的清除能力均高于水浴加热法及酶法提取的样品。 参考文献： ［１］ ＺＨＡＮＧ Ｌ Ｈ， ＬＩ Ｌ Ｌ， ＬＩ Ｙ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｆｒｕｉｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２００８，７６５：３１－３４． ［２］ 王 川．葡萄籽单宁的抗氧化性研究［Ｊ］．食品科技，２００９，３４（２）：１８４－１８７． ［３］ ＢＯＵＫＨＡＲＴＡ Ｍ， ＪＡＬＢＥＲＴ Ｇ，ＣＡＳＴＯＮＧＡＹ Ａ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｌｌａｇｉｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏ ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ［Ｊ］． Ｂｕｌｌ Ｌｉａｉｓｏｎ－Ｇｒｏｕｐ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ，１９９２，１６（１）：２４５－２４９． ［４］ 李 娜．五倍子单宁酸对变异链球菌作用的初步研究［Ｄ］．西安：第四军医大学，２０１３． ［５］ 张 帆．不同分子量缩合单宁的分离及其对瘤胃体外发酵的影响［Ｄ］．吉林延吉：延边大学，２０１３． ［６］ 罗 兰．半仿生提取法在中药配方颗粒制备中的研究进展［Ｊ］．海峡药学，２０１０，２２（４）：１２－１４． ［７］ 余先纯，孙德林，李湘苏．超声波辅助提取柿子树叶单宁的研究［Ｊ］．化学研究与应用，２０１１，２３（３）：３４５－３４９． ［８］ ＢＲＡＮＤ－ＷＩＬＬＩＡＭＳ Ｗ， ＣＵＶＥＬＩＥＲ Ｍ Ｅ， ＢＥＲＳＥＴ Ｃ． Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９５，２８（１）：２５－３０． ［９］ ＣＥＲＶＡＴＯ Ｇ， ＣＡＲＡＢＥＬＬＩ Ｍ， ＧＥＲＶＡＳＩＯ Ｓ， ｅｔ ａl． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｒｅｇａｎｏ（Ｏｒｉｇａｎｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ） ｌｅａｆ ｅｘｔｒａｃｔｓ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２０００，２４（６）：４５３－４６５． ［１０］ ＭＩＬＬＥＲ Ｎ Ｊ， ＳＡＭＰＳＯＮ Ｊ， ＣＡＮＤＥＬＡＳ Ｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｅｓ ａｎｄ ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｓ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９６，３８４：２４０－２４２． ［１１］ ＲＥ Ｒ， ＰＥＬＬＥＧＲＩＮＩ Ｎ， ＰＲＯＴＥＧＧＥＮＴＥ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｐｐｌｙｉｎｇ ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＡＢＴＳ ｒａｄｉｃａｌ ｃａｔｉｏｎ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ［Ｊ］． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ， １９９９，２６（９－１０）：１２３１－１２３７． ［１２］ 童 波，刘大川．紫苏粕中单宁和植酸提取工艺的研究［Ｊ］．中国油脂，２００８，３３（９）：４７－５０． （责任编辑 赵 娟） 1