基因工程基因工程1

第一章 基因概论 第一节 基因工程的基本概述 　一、基因工程的基本概念 　1、基因工程的基本定义： 　　　按照预先好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗　传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另　外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 　广义基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。分为上游和下游技术。 　2、上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义基因工程） 　3、下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以　及外源基因的表达、分离、纯化过程。 　基因工程又称为：gene manipulation, gene cloning, recombinant DNA 　　　technoglogy, genetic modification, new genetics, molecular agriculture 　二、 基因工程的基本过程： 　1、材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制　性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 　2、 目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。 　3、 重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。 　4、 筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确　表达。 　进一步可将基本步骤概括为：切、接、转、增、检［步骤演示］ 　 　        图1-1 基因工程的基本步骤 　三、 基因工程的基本原理： 　主体战略思想是外源基因的高效表达，可从四方面达到目的： 　1、 利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达　水平。 　2、 筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。 　3、修饰和构建蛋白质生物合成的调控元件：序列、密码子。 　4、工程菌（微型生物反应器）的稳定生产及增殖。 第二节基因工程发展历史 一、基因工程的诞生 　基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持：   1. 理论上的三大发现：       证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）       DNA的双螺旋结构和半保留复制机理       遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立   2. 技术上的三大发现       限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）       载体的使用       1970年，逆转录酶的发现。      1973年，Cohen等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，标志着基因工程的诞生。 　 二、基因工程的发展： 　1. 1972-1976年，日本人，somatostatin； 　2. 1978年，美国人，生长激素基因（HGH）； 　3. 1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因； 　4. 1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）； 三、基因工程的腾飞： 　1. 1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠； 　2. 1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因） 　3. 1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID） 　4. 1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD； 　5. 1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊 第三节 基因工程的研究意义 　　     基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难，使基因在微生物、植物、动物之间交流，迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型 。 概括地讲，其意义体现在以下三个方面：    大规模生产生物分子；    设计构建新物种；    搜集、分离、鉴定生物信息资源 一、第四次工业大革命： 　　1980年11月15日，美国纽约证券交易所开盘的20分钟内，Genentech公司的新上市股要从3.5USD上至89USD，胰岛素基因表达 　　1. 医学：抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物、生长因子诊断剂 　　2. 轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体 　　3. 能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换 　　4. 环保：微生物生态种群 　　5. 信息：蛋白芯片、基因芯片 　　日本政府称基因工程为战略工业 二、第二次农业大革命： 　　1. 蛋白类杀虫剂（生物农药）、抗广谱虫害植物； 　　2. 农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状； 　　3. 畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率 　　4. 固氮 三、 第二次医学大革命：（麻醉外科术是第一次医学大革命） 　　1. 分子病：（文明病富贵病）基因治疗，遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症 　　2. 抗衰老：端粒酶编码基因 　　　基因疗法 　　　补充突变基因原始产物、 　　　更换突变基因 第2章 基因工程工具酶 第一节 用于基因工程的工具酶 一、限制性内切酶（Endonucleosase） 　 （一）限制性内切酶（Endonucleosase）的发现与分类 　　1） 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, 　　　hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： 　　hsd R---限制性内切酶 　　hsd M---限制性甲基化酶 　　hsd S---控制两个系统的表达 　　1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有一百种，而实验室常用的有二十种 。 　　2）限制性核酸内切酶可分为三大类： 　　　I类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。 　　　II类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断 　　　III类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 　　因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。 　（二）II类限制性内切酶的命名及特性 　　命名：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。 如，HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 　（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 　　绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4，5，6碱基对，这些碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic），而且切点就在其内部，如EcoRI 5'-GAATTC-3' 。 　　DNA被限制性内切酶切开之后，呈现两种断口： 　　钝端（平端）如Pvu II, Alu I, EcoR V等 　　粘端（粘性末端）如：EcoR I等 图2-1 限制性内切酶产生的末端 　（四）识别位点在DNA分子中的频率 　　对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的，四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约4096（46）个核苷酸有一个识别序列，计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的。实践中这种方法不完全正确，如λ DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，实际上要少一些，如Bgl II只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个。 二、甲基化酶 　　在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。 　（一）大肠杆菌中的甲基化酶 　　dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I（TGATCA），但BamH I（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 　　dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。 　（二） 甲基化酶在基因工程中用途 　　许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割。 三、T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase） 　　来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3'端羟基和5'端磷酸基因，脱水形成3'-5'磷酸二酯键 　　连接双链DNA上的单链缺口（Nick），因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 　　连接RNA模板上的DNA链缺口 　　 连接平头双链DNA速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，这属于分子之间的连接.                    图2-2 连接酶的作用方式 四、核酸酶 　　作用: 降解磷酸二酯键 　　分为：外切酶 内切酶 　（一） Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的内切酶活性。依赖于Ca2+ 　　用途： 　　　构建限制酶图谱 　　　产生末端缺失突变 　　　DNA超螺旋线性化 　（二）E. coli外切酶III 　　只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。 　（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌） 　　特性： 　　1. 降解单链DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解的速度 　　2. 降解发生的方式为内切和外切 　　3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境，Zn2+激活 　　4. 酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低75000倍 　（四） DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链 五、聚合酶 　（一）DNA聚合酶I 　　5’-3’聚合酶活性 　　3’-5’外切酶活性 　　5’-3’外切酶活性 　　核酸内切酶活性 　　可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。                           图2-3 DNA聚合酶I 　（二） Klenow酶 　　该酶无5'-3'外切活性，保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性，基因工程中利用该酶： 　　修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端 　　标记DNA探针 　　催化cDNA第二条链的合成 　　末端终止法测序 　               图2-4 Klenow 酶的作用方式 （三） T4 DNA聚合酶 　　与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。 　（四）T7 DNA聚合酶 　　测序酶 　（五） Taq DNA聚合酶 　　耐高温，主要用于PCR反应。 　（六） 逆转录酶：将mRNA转录成cDNA 　　AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒） 　　DNA聚合酶活性 　　RNase H活性 　　DNA内切酶活性 　　核酸结合活性 　　M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒） 　　两种逆转录酶的区别 　　肽链的组成 　　禽酶2条肽链，具聚合酶和很强的RNase H活性 　　鼠酶1条，较弱的RNase H活性 　　反应的最适温度 　　禽酶42°C，二级结构丰富RNA，禽酶效率高 　　反应的最适pH值 　　禽酶pH 8.3 　　鼠酶pH 7.6 六、DNA修饰酶 　　有大量的修饰酶，主要的有以下几种： 　　1） 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。 　　2） polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。 　　3） 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。 　　4） Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构 第二节 DNA的切割反应 一、缓冲系统的组成 　　 II类酶的酶活条件：Tris-HCl PH7.5, 25-50mM；10mM MgCl2 ；NaCl 0-150mM； DTT 1mM 　　根据不同酶对盐离子要求不同，可将缓冲液分为以下三种情况： 　　高盐：100-150mM 　　中盐：50-100mM 　　低盐：0-50mM 二、酶切操作 　　DNA量的确定，加入酶量的确定，发应体积的确定（20μl），反应时间的确定，1-1.5hr，一般为37℃，但也有例外，如Taq I在65°C时活性最高。 　　单位限制性内切酶定义为：在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时，完全水解1μgDNA所需的酶量。 三、酶切结果 （一） 酶切片段的检测 　1） 通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。 　2） DNA分子的检测 a. 染色EB，DNA分子小于25ng，很难检测到 　　b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子。 （二）估计DNA分子的大小 　　根据DNA分子的迁移率，可以用公式计算出分子量D=a-b(logM) D是移动的距离，M是分子量，a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变。 也可以根据已知大小的片段进行比较，误差约在5%左右。 四、多酶联合酶解 　　对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶解； 　　对于对浓度要求不同的酶，可以： 　　1. 低盐浓度的酶先切，后补加NaCL 　　2. 一种酶切后，换缓冲液，加5mM NaAc 0.1体积，2体积乙醇，冰浴5min，4℃离心10min，干燥 五、定位酶切位点 　　建立酶切图谱需要一系列的酶。 　　首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目； 　　然后进行双酶切； 　　比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱； 　　含糊的位点可以通过部分酶切解决，可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行。 六、 限制性内切酶的star活性 　　在PH不合适，或甘油浓度过高≥10%时，限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。 第三节 DNA片段的连接 　　重组DNA分子构建的最后一步是连接，通过连接酶完成。相对而言，钝端的连接效率较低，因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会。而粘性末端的连接效率较高，因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对。这种暂时的、碱基配对结构可以提高连接的效率。在分子克隆的连接方式主要有以下几种： 一、连接方式 （一）相同粘性末端的连接 　　来源: 　　　相同的酶 　　　同尾酶 　　问题: 　　　极性有两种可能 　　　同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。 （二）平头末端的连接 　　粘性末端--分子内部连接，平头末端--分子间的连接。 　　提高连接效率的方法： 　　　加大酶用量（10倍） 　　　加大平头末端底物的浓度 　　　加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用 　　　加入单价阳离子， 150-200mM NaCl 　　提高反应温度 　　平头连接同样存在两种极性 （三）不同粘性末端的连接 　　突出5'末端 　　Klenow补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接 　　突出3'末端 　　T4-DNApol切平，然后平头连接 　　突出末端不同 　　Klenow补平，或S1核酸酶切平 　　连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI与HindIII（ XbaI恢复）， XbaI与EcoRI（均保留），BamHI与Bgl II（产生ClaI位点） （四）人工粘性末端的连接 　　5'突出的末端 　　　外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。 　　3'突出的末端 　　　外源片段先用TdT加polyG；载体片段加polyC；然后退火；再用Klenow补齐；连接 　　平头末端 　　　可直接用TdT补加末端，但以加polyA/T为佳。这样稍微加热，AT区就会出现单链区域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段 （五）粘端与平端的连接 　　linker : 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA片段。 　　　– 连接的效率较高 　　　– 酶切时可能破坏DNA分子的完整。 　　adaptor：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。                        图 2-5 linker的连接方式 （六）粘性末端的更换 　　在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 　　　– BamHI酶切片段用Klenow补平，或用S1酶切平；连接一段linker或Adaptor，使之产生EcoRI粘性末端。这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 。 　　　– 由AluI更换EcoRI：AluI切开，T4-DNApol切平，另一段DNA EcoRI切开，Klenow补平，连接，原来含有AluI的片段变成含有EcoRI 二、重组率 　　重组率：连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比。较为理想的重组率为25-75% 　　提高重组率的方法： 　　　连接反应条件 外源片段：载体＝2:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。 　　　载体除磷 （磷酸酯酶5’除磷）。 　　　TdT在3’端增加人工粘性末端，防止载体自我环化 。 第三章 基因科隆载体 第一节 载体的功能及其特征 载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 二、载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.长度尽可能小，以提高其载装能力 4.具有多种单一的酶切位点 5.具有合适的选择性标记 附图：                  图 3-1 自主复制型载体和附加载体的扩增方式 第二节 质粒 　　质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA），并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。 　一、质粒的基本特性 　（一）自主复制性 　　质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。 　（二）不相容性 　　利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。 　（三）可扩增性 　　质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。 但另外两种质粒（psc101和p15A）和的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。 　（四）可转移性 　　在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。 　二、质粒的构建 　（一）天然存在的两种质粒 　　（1）colE1宿主细菌大肠杆菌6.5kb松弛型复制20-30/cell 　　（2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcr质粒的命名 p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。 　（二） 质粒人工构建的目的 　　天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建： 　　（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 　　（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 　　（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 　　（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 　　（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 　　　方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。 　三、质粒的分类 　（一）根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类： 　　　Fertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。 　　　Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素或水银抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。 　　　Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. coli 中的CoE1。                        图3-2 利用抗性基因进行重组子的筛选 　　　降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。 　　　致瘤质粒（Virulence plasmids）农杆菌Ti质粒 　（二）人工构建的质粒根据其功能及用途分为: 　　1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 　　2.测序质粒 　　3.整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 　　4.穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制 　　5.表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达 　　6.探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。[图示] 　四、实验室常用质粒 　（一） pBR322 （见影音文件） 　　该质粒具有以下优点： 　　1） 分子大小4363bp，容易纯化。 　　2） 含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 　　3） 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。可以产生大量的重组pBR322分子。                     图3-3 pBR322的结构 　（二） pBR327一个多拷贝质粒 　　pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改变了质粒的复制和接合能力。他与pBR322这要有两点不同： 　　1） pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。但正常细胞中较高的拷贝数，使它适合于应用于基因功能研究。 　　2） 剪切破坏了pBR322的接合能力，pBR327不具有接合能力，不能直接转入其他细胞。这对生物biological containment是非常重要的（生物防范）。                       图3-4 pBR327的结构 　（三）pUC8—Lac 选择质粒 　　pUC8也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ’基因内的一个小片段上。 　　pUC8的优点： 　　1）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞中质粒的拷贝数达到500-700个，可以提高载体的产量。 　　2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。 　　3）pUC8的多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。 　　4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。                      图3-5 pUC8的结构图 　（四） pGEM3Z-DNA的体外转录 　　pGEM3Z与pUC载体非常相似，不同的是pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。这两段启动子存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录，合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。 　五、质粒的制备 　　实验室一般使用两种方法制备质粒： 　（一）碱裂解法 　　（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液体中 　　（2）加溶菌酶裂解细菌细胞壁 　　（3）加NaOH与SDS的混合溶液，去膜释放内含物 　　（4）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 　　（5）离心取上清液，用苯酚－氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶 　　（6）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒 　　（7）无DNase的RNase处理残余RNA 　　用此方法制备的质粒较纯，收得率高，但繁琐，且质粒中有开环现象 　（二） 沸水浴法 　　（1）将菌体悬浮浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中 　　（2）加溶菌酶破细胞壁 　　（3）放入沸水浴中煮40秒 　　（4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物 　　（5）乙醇异丙醇沉淀 　　用此法制备的质粒不纯，收得率低，且制备规模小，但快速，特别适用于重组质粒的鉴定。                                       图3-6   pGEM3Z载体的结构及外源DNA的转录                            HYPERLINK "http://etc.lyac.edu.cn/courseware/03_04jiyingongcheng/web/chap03/3-7.htm" INCLUDEPICTURE "http://etc.lyac.edu.cn/courseware/03_04jiyingongcheng/images/class/003/0303-1.gif" \* MERGEFORMATINET                                                图 3-7细菌DNA的提取                         图3-8 质粒DNA提取方法 图3-9 CsCl梯度离心法纯化质粒DNA 第三节 以噬菌体DNA为基础的载体 一、λDNA载体 （一） λ噬菌体的分子生物学 　　 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 　　1) λ-DNA的物理图谱 　　　λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA，称为cos区，全长48.5kb。特点是功能相近的基因在基因组中聚集在一起。例如，所有的编码外壳蛋白的基因都聚集在左端1/3处；控制基因组整合到寄主基因的基因位于分子中央；右端是负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控的基因；相关基因的聚集对λ基因组的表达是非常重要的，这能够使他们一起启动或关闭，而不是单独起作用。                           图3-11 cos位点的作用 　　2）感染周期 　　　噬菌体通过特殊的生物学方式感染宿主细胞，将其DNA导入 　　（1）吸附 吸附于大肠杆菌外膜上的LamB受体（正常功能是运转麦芽糖进入细胞内），麦芽糖可诱导这些受体的合成，故它也可促进λ噬菌体的吸附与感染（尾部吸附）。 　　（2）DNA注入 　　（3）DNA复制 从单一ori区滚筒复制，形成线状多联体，λ-DNA上两个基因的产物激活复制的起始，但复制所需的蛋白因子系统则由宿主细胞提供。 　　（4）包装 包装蛋白在宿主细胞内合成，包装蛋白首先结合在cos区的附近，形成包装启动复合物，因此cos区对包装是至关重要的。 　　　包装时由一个蛋白因子将cos区切开，从而保证只有一个DNA 线状负责被保证在一起，每个宿主细胞可包装多达100个成熟的λ-DNA分子，包装对DNA本身的性质无关，但对其大小要求比较严格，它只能包装λ-DNA分子的75%-105%，也就是说可以包装36.4kb-50.9kb范围内的DNA，包装好了的λ-DNA便形成成熟的噬菌体颗粒。 　　（5）裂解 每个细胞内容纳了多达100个成熟的噬菌体，这时两种负责裂解宿主细胞的蛋白被合成，细菌细胞被裂解，成熟的噬菌体释放出去，又去感染另外的宿主细胞，直至大肠杆菌细胞全部被裂解。                         图3-12  λ噬菌体的侵染循环 　　3）溶源状态的建立 　　　噬菌体感染大肠杆菌后除了可能裂解细胞外，也可能直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不裂解细菌，这种情况的为溶源状态，整合重要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质，使λ-DNA或处于溶菌状态，或处于溶菌状态。 （二） λ－DNA载体的构建 　　建立λ克隆载体前需要解决2个问题 　　1） λDNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。 　　2） λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ基因组。 　　Ⅰ. 缩短长度 　　　野生型λ－DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实λ－DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。                                图3-13 λ－DNA的结构 　　（1）插入型载体 　　　该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-13.9kb） λgt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoRI。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。 λZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ’基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。                           图3-14 插入型载体 　　（2）取代型载体 　　　该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saλI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。显而易见，这类载体的容量不仅比插入型载体大，而且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。这类载体实际上已经不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去，当然这类载体的使用较为繁琐，现在商品化了的取代型载体已去除了中间片段（14kb）解决了这一问题。 　　λWES. λB’，两个 EcoRI位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。 λEMBL4，可以插入20kb的DNA分子，可利用EcoRI、BamHI、SalI替换填充片段，因此可以插入不同粘端的DNA片断。重组子的筛选可以根据片段的大小也可以利用Spi表现型。                            图3-15 取代型载体 　　Ⅱ.修饰酶切识别位点 天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。                 图3-16 通过自然选择法筛选无EcorI识别位点的λ-噬菌体 （三）λ-DNA的抽提 　　1) 大肠杆菌培养至对数生长期（在含有乳糖的培养基中） 　　2) 加入λ-噬菌体或重组λ－噬菌体悬浮液，37℃培养1小时 　　3) 用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时 　　4) 高速离心，沉淀噬菌体 　　5) 苯酚抽提，释放λ-DNA 　　6) 乙醇或异丙醇沉淀DNA （四）λ-DNA作为载体的优点 　　1) λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌 　　2) λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量 　　3) 重组λ-DNA的筛选较为方便 　　4) 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易 二、考斯质粒（粘性质粒，cosmid） （一）考斯质粒的构建 　　λ-DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒就是应这种需要而人工组建的。 考斯质粒顾名思义就是含有λ-DNA两端cos区的质粒。由于λ-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象λ-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，考斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。                       图3-17 Cos质粒pJB8 （二） 考斯质粒的优越性 　　1) 能象λ-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞 　　2) 可以装载比质粒或λ-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA 　　3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选 　　4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。                        图3-18 利用Cos质粒进行克隆 三、M13-DNA （一） M13单链噬菌体的分子生物学 　　M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞的复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，滚筒式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100-200时，负链上的基于产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。                    图3-19  M13噬菌体的侵染循环 （二） M13-DNA载体家族 　　1. M13mp载体家族 　　　M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是插入标记基因如，lacZ'、多克隆位点，消除多余的酶切位点。在M13上引入lacZ’基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。 M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoRI位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2是最简单的M13克隆载体，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。 M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ’基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为polylinker，含有一系列的限制性位点和EcoRI粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoRI位点上，就产生了M13mp7。                   图3-20 外源基因由M13mp8向M13mp9载体的转移 　　2. 噬菌粒（Phagemid） 质粒与M13-DNA的重组体，它带有质粒上的酶切位点及标记基因，这样更于筛选及克隆，同时由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，但不及λ-DNA。                                图3-21 pEMBL8的结构 　 　 　                                                  图3-22 将pEMBL8转化为单链形式 （三） M13-DNA作为载体的优点及用途 　　最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，用途： 　　（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序 　　（2）用于单链DNA的定点诱变 　　（3）用于合成探针 第四节 构建基因文库的大容量载体 一、构建文库需要的克隆的数目 　　不同载体承载外源DNA片段大小的能力是不同的。如λ载体可以插入20kb的片段，粘粒可以携带40kb的片段。质粒的最大插入片断是8kb，M13只能插入小于3kb的分子。克隆片段的能力决定了构建生物基因文库需要的克隆的数目。 建立一个基因文库需要克隆的数目，可以通过下面的公式计算： 　　　N=ln(1-P)/ln(1-a/b) 　　　N=所需要的克隆数 　　　P=可能性，一般用95%的可能性所有的基因都包括在内 　　　a=插入在踢得DNA片段的平均大小 　　　b=整个基因组的大小 　　表中给出了多种生物体基因文库所需要的克隆的数目。获得成千上万的克隆是完全可能的，所以这样大小的基因文库是合理的。然而，科学家们一直致力于寻找大容量的载体，以便降低克隆数目的方法。 二、大容量的载体 　　a)噬菌体P1，头部可以装入110kb得DNA片段，以P1为基础的粘粒，可以插入70-100kb得DNA分子，这样可以将人类基因文库克隆的数目从257000个（λ粘粒）降低到90000个。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　b)以F质粒为基础称为细菌人工染色体或者BACs，可以插入300kb的片段，只需要30000个克隆就可以建立人类的基因文库。 　　c) 酵母人工染色体（YACs），可以克隆600kb的片段，一些特殊的类型可以携带1400kb片段，可以是人类基因文库的克隆是降至6500个。 第五节 酵母载体 　　酵母是生物技术中最重要的生物体之一，除了酿酒和生产面包外，极目也被用来作为基因克隆的受体生产药物。在酵母S. cerevisiae的大部分品系中都发现了质粒的存在，它是一个2um环状的分子。 一、2um质粒的选择标记 　　2um质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1, REP2。 2um质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。 　　为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。                        图3-31 leu-作为酵母载体的选择标记基因 二、以2um质粒为基础的载体—酵母附加质粒 　　来自于2um质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。YEps可以含有完整的2um质粒，也可以只含有2um质粒的复制起点，如YEp13以后的类型。 YEp13是一个穿梭质粒，含有2um质粒的复制起点和选择基因LEU2, YEp13还包含pBR322的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。穿梭质粒的应用需要进一步论证，第一很难从转化的重组克隆中将重组DNA分子提取出来，这对于YEp13来讲不是问题，操作步骤：首先要在大肠杆菌中进行克隆试验，选择重组子，重组质粒纯化后转化酵母。                  图3-32 YEp的结构 三、YEp可以插入酵母的染色体DNA 　　附加体意味着YEp可以独立的复制也可以整合到酵母的染色体内，因为在载体中作为选择标记的基因与突变体主染色体DNA同源性很高，比如YEp13质粒中LEU2基因可以与染色体上突变的LEU2基因进行重组，将整个质粒插入到酵母染色体内，可以一直保持整合状态，随后的重组事件也可以切下来。                         图3-33 YEp整合到酵母染色体上 四、其他类型的克隆载体 　　除了YEps，还有其他类型的载体，下面介绍主要的两种： 酵母整合质粒(YIps)：主要是细菌质粒含有一个酵母基因。如YIp5，是在pBR322的基础上插入了一个URA3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，可以作为选择标记，选择的方法与LEU2标记相同，YIp不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母的染色体上，整合的机制与YEp相同。                    图3-34 整合型载体 　　酵母复制质粒(YRps)：由于含有一段包括起始位点在内的染色体DNA, 可以作为独立质粒进行复制。复制起始位点与多个酵母基因距离很近，包括作为选择标记的基因。YRp7是其中的一种，他由pBR322与酵母基因TRP1组成，TRP1参与色氨酸的合成，他与起始位点的距离非常近，插入YRp7的酵母DNA片段包括TRP1和复制起始位点。 　　在一个特定的克隆实验中选用哪一种类型的质粒需要考虑三个因素。 　　第一转化频率，也就是每ug的质粒DNA可以获得转化子的数目。YEps的转化频率最高，每ugDNA可以获得10000-100000个转化细胞，YRps次之，可以产生1000-10000个转化细胞，YIp产量较低，一般少于1000个，如果不是用特殊的程序，只能产生1-10个重组子，较低的转化效率意味着与染色体之间的重组是非常少的。 拷贝数：YEps和YRps含有的拷贝数也最多，每个细胞中含有20-50和5-100个，而YIps一般只以单个拷贝存在于细胞中。如果要从克隆的基因中获得蛋白，这些特性就非常重要，因为拷贝数越多，蛋白质的产量就越高。 　　稳定性：因为YIps能产生稳定的重组子。另一方面YRp重组子是非常不稳定的，母细胞中聚集大量的重组分子，但在子代中就可能丢失，YEp也有同样的问题。                           图3-35 复制型酵母载体 五、人工染色体可以用来克隆大片段的DNA 　　酵母克隆载体的最后一种类型是YAC，酵母人工染色体。染色体的主要组成如下： 　　1) 着丝点 　　2) 两个端粒：存在于染色体的末端，使染色体正确的结束复制，防止染色体被外切酶撕咬 　　3) 复制起始位点： 　　DNA复制的起点染色体结构确定后，可以同过重组DNA技术将每一组成部分分离开来，然后连接在一起，创造人工染色体。自然中酵母的染色体有几百个kb长度，利用人工染色体可以携带比其他质粒更大的DNA分子。 　　a) YAC载体的结构和应用 pYAC3是在pBR322的基础上，插入了几个酵母基因。其中两个基因是URA3和TRP1，可以作为选择标记分别存在于YIp5, YRp7，就像在YRp7中一样，携带TRP1的同时也包含一个复制起点，但在pYAC3中这一片段扩展到CEN4，他是一段来自4号染色体着丝粒的DNA片段。TRP1-origin—CEN4片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。 　　第三部分端粒，有两段称为TEL的序列提供，并不是他们自身组成端粒序列，而是在引入酵母细胞核后，作为种子序列建立端粒。还有最后一部分没有提到的是SUP4，他在克隆实验中作为插入片段的选择标记基因。 利用pYAC3克隆的策略如下： 　　载体首先被BamHI和SnaBI酶切将分子切成三块，BamHI片段被去掉，剩下两个臂，每一臂都已TEL作为末端，另一端是SnaBI位点。克隆的DNA必须是平端(SnaBI也是一个平端酶，识别序列是TACGTA)被连接在两个臂的中间就产生了人工染色体。利用原生质转化法将人工染色体引入酵母。受体酵母是利用一个双营养缺陷体trp1-ura3，载体上含有互补基因作为选择标记。转化后于基本培养基上培养，只有含有人工染色体的细胞可以正常生长。含有两个左臂或者两个右臂的染色体都不能正常生长，因为其中一个选择标记基因丢失，插入片段的鉴定可以通过SUP4基因的插入失活，白色的克隆是重组子，红色的不是。 　　b) YAC载体的使用 　　一些哺乳动物的基因大于100kb（如人类膀胱纤维基因有250kb），超过了大肠杆菌载体系统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。最近的研究发现，在某些情况下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。 　　YACs在构建基因文库中非常重要，要知道，最高容量的大肠杆菌质粒可以插入300kb的片断，对于人的基因文库需要30000个克隆，而YACs可以克隆600kb的片段，一些特殊的类型可以携带1400kb片段，可以是人类基因文库的克隆是降至6500个。但不幸的是，这样的”mega-YACs”存在着不稳定性，克隆的DNA片段可以被重新排列。不管怎样，YACs在大规模的测序中例如人类基因组计划是非常有用的。                     图3-36 利用YAC载体克隆外源基因