30份国家自然科学基金标书(医学生物类)示例2006省基金

分子生物学省重点实验室 妇科学博士点 **省自然科学基金资助项目 申请书 项目名称 卵巢上皮性癌的间皮素（Mesothelin)表达及与CA125的功能关系 所属学科 生命 学科代码 C030304 申 请 人 *** 申请单位 医科大学 通讯地址 邮政编码 归口单位 教育厅 合作单位 申请时间∶ 2005年 06月 10 日 填 写 说 明 一、填写前要认真查阅省自然科学基金管理的有关规定。内容表达要明确、严谨，字迹要清晰，空格不够时可另加页。使用外来语要同时用中文表达。首次出现的外文缩写标明外文全称。 二、“学科”分7大类，即∶数理、化学、生命、地球、与工程、信息、管理。填写时要按照主要研究内容确定所属学科，并填写学科代码。如难以界定的可同时填写两个学科及代码，但仍以前一个为主，禁止同一研究内容同时多学科申报。 三、项目名称限制在30个汉字以内，关键词最多不超过30个汉字长度。“预期水平”栏中选择国际领先、国际先进、国内领先、国内先进之一。类别∶按申报项目性质在属纯基础和应用基础中选择。 四、申请者必须是所在单位实际主持本研究工作的首席研究人，只能一名，工作稳定，有研究、组织能力，时间上有保证。参加人为实际从事本研究工作的人员，顾问等指导性工作人员不列入其中。青年专项基金项目负责人，实足年龄在35岁及以下，项目组成员主要是年轻人。 五、项目申请人和项目组成员在研省基金项目已满两项的，不再受理其新申请项目。 六、项目经费限于本项目研究工作直接需要的开支，实事求是，勤俭节约。应充分利用已有条件和可以利用的协作条件，多渠道积极争取经费。 七、使用基金会办公室提供的录入系统填写申请书，由申请者所在单位审查、筛选后统一报基金会办公室，一式六份，其中原件一份。 一、简 表 项目名称 卵巢上皮性癌的间皮素（Mesothelin)表达及与CA125的功能关系 研究类别 应用基础 预期水平 国际先进 起至年月 2006年至2008年 研 究 内容 、 创新点和意义摘要 研究内容：卵巢上皮性癌（卵巢癌）早期诊断困难，具长期在腹腔种植转移的生物学特征，是死亡率最高的妇癌。我们用基因芯片了卵巢癌基因表达谱，发现间皮素（mesothelin, MSLN）是上调表达最为显著的可分泌分子。最新研究提示CA125是鼠MSLN的受体。因此，本课拟用分子生物学和免疫组织学技术，分析MSLN在健康妇女血清和临床各期卵巢癌患者的血清、腹水、组织标本中的表达，探讨与CA125表达及定位的关系、与临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系，总结MSLN是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物；MSLN是否可与CA125互补应用于卵巢癌的诊断和病情监测。用体外细胞黏附实验和裸鼠卵巢癌腹腔转移瘤模型，探讨MSLN与CA125在细胞的生长增殖、黏附、腹腔种植和转移过程中的作用，揭示MSLN与CA125的功能关联性，为卵巢癌的腹腔生长转移行为提供理论依据，并为抗卵巢癌腹腔转移治疗打下基础。2.创新点： (1）本课题组首次发现和验证了MSLN在卵巢癌中极显著上调表达，并准备就其临床应用价值方面率先开始系统的研究。截止本申请撰写时，国内外未见相关研究的报道。 (2)将MSLN的表达与CA125的表达相联系，试图发现其内在联系，如能达到预期的目的，不仅为临床实践提供价值很高的标志物，也将为研究MSLN和CA125的功能开辟新的途径。 (3)本课题组根据最新的研究结果进行合理的科学推测，设计进行MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长和黏附的影响的实验研究，并结合卵巢癌的独特转移规律，研究MSLN和CA125对卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞（表达MSLN）的黏附的影响，在此基础上拟建立动物模型观察MSLN和CA125在体内对卵巢癌腹腔转移的作用。结果将对理解癌腹腔转移的分子机制和开发新的抗癌药提供理论依据，这一思路在国内外均未见报道，具明显的创新性。 关键词 卵巢上皮性癌；间皮素；CA125 项目组 总人数 高级 中级 其他 其 中 博士后 博士 博士生 硕士 硕士生 3 1 2 0 1 2 2 申请者及项目主要成员情况 姓 名 性别 年龄 职称 学位 专业 单位 项目分工 年月 *** 女 39 教授 博士 妇科 医科大学 项目设计 08 *** 女 30 讲师 硕士 分子生物学 医科大学 动物实验 09 ** 女 27 讲师 硕士 细胞生物学 医科大学 实验 09 二、经费收入、支出计划(金额单位∶万元) 金 年 额 度 来 源 2006 2007 2008 合计 申请省基金 3 2 1 6 单位自筹 其他 渠道 拨款 1.省卫生厅 1 1 2. 合 计 4 2 1 7 ㈠ 省基金经费使用计划 预算支出科目 金额 计算依据 1.科研业务费(实验动植物购置和种植、养殖费，计算、测试分析费，国内调研和学术会议费，业务、报告、论文印刷费，临时用工劳务费、必需的国际合作研究费) 2.8 用于数据分析、统计、日常消耗、参加学术会议和论文版面费等 2.实验材料费(原材料、试剂、药品等消耗性物品的购置费，标本、样品采集加工费，运杂包装费) 2.2 购置细胞系、抗体、RNA干扰技术所用试剂、动物实验、分子生物学实验和细胞培养 3.仪器设备费(专用仪器设备的购置费，运杂包装费，自制专用仪器设备的材料、配件和外协加工费) 0.7 ＊＊＊仪器 4.实验室改装费(根据研究工作需要所进行的实验室简单改装) 5.协作费(外单位协作者承担研究工作所需经费) 6.管理费(经费自立的单位项目管理费不超过资助金额的5%，最高不超过0.5万元) 0.3 管理费 ㈡ 单位自筹及其他渠道拨款使用计划 省卫生厅经费主要用于实验材料的1万元 ㈢ 需购买的主要仪器、设备 仪器、设备名称 规格型号 数量 产地 资金来源 ＊＊＊ 1－6 1 中国 省基金 三、立论依据(包括科学意义和应用前景，国内外研究概况，主要参考文献目录。纯基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；应用基础研究着重结合学科前沿，围绕国民经济和社会发展中的科技问题，论述其研究特色及应用前景) 90%的卵巢恶性肿瘤是卵巢上皮性癌（以下简称卵巢癌），是妇科肿瘤领域内死亡率最高的疾病，5年生存率长期徘徊在30%左右[1。随社会经济的发展和妇女生育率的降低，卵巢癌的发病率逐年上升，由于该病的治疗需要彻底的手术和后续长期的多个疗程的化疗和其它辅助治疗，给患者家庭和社会经济带来沉重的负担。卵巢癌有两个显著特点：一是早期诊断困难，75%的患者就诊时已到临床晚期，晚期患者的5年生存率仅20%，而早期则高达85%-90%；二是其具有独特的生长和转移规律，与其他实体瘤经由血液系统或淋巴系统转移至远处不同，卵巢癌长期在腹腔转移，癌细胞在腹膜间皮细胞黏附、种植并形成转移灶，最终由于腹腔广泛病灶累计网膜、胃肠道和肝脾等脏器而导致患者死亡。 卵巢癌的术前辅助诊断和病情监测的首选方法之一是血清CA125的测定。CA125是由单克隆抗体OC125识别的一种高分子量的糖蛋白，是近20年妇科领域应用广泛的生物标记物。85%的晚期卵巢癌血清CA125升高，并且与分期呈相关性。CA125还与人体卵巢癌的荷瘤量成正比，当彻底手术切除癌灶后，CA125明显下降或转阴，化疗奏效时，也使CA125下降。卵巢癌的治疗是长期的过程，术后应给予多个疗程的化学治疗（化疗），治疗过程中根据肿瘤对化疗的敏感度及时调整治疗方案也很重要；此外，卵巢癌的复发率很高，CA125的阳性预测率高达90%，因此CA125也被用于病情监测。CA125是血清检测，故简便、经济、微创。 CA125的局限性也很多：①诊断的特异性不高，在很多生理状态和良性疾病时也可升高。晚期卵巢癌时，可结合临床表现易于鉴别，而早期时则难以区分。②早期病例阳性率低。临床实践中，由于卵巢位于盆腔深部，一般临床查体难于直接接触，早期发病无特异症状，患者通常是有明显的症状后方就诊，此时多已届临床晚期，所以寻找有价值的早期诊断方法是临床迫切需要的，而CA125难以满足这以要求。例如，英国的Ian Jacobs博士，分析了22 000位妇女的血清CA125，发现340例CA125升高，结合阴道超声，对41例超声异常的妇女实施了剖腹探查术，发现11例卵巢癌，但令人沮丧的是其中8例为临床晚期[2]。早期卵巢癌CA125升高不到50%，这也是制约CA125做为早诊指标的因素。由此可见卵巢癌早期诊断困难之一斑。③15%的晚期卵巢癌CA125阴性。④部分复发卵巢癌CA125不升高，CA125的阴性预测率仅45%-55%。 综上，临床仍迫切需要敏感、特异的诊断和监测卵巢癌病情的经济、简便的指标，毕竟卵巢癌是威胁妇女生命的第一杀手。为这一目的，在2003年我们采用了高通量的DNA微阵列（基因芯片）技术，所用的cDNA微阵列含8000条人基因，分析了卵巢癌和正常卵巢的基因表达谱，结合生物信息学统计处理，进行了深入的数据分析和数据挖掘。与正常卵巢相比，发现了56条上调和23条下调的基因，79条表达差异的基因中，间皮素（mesothelin, MSLN）的变化最为显著，在卵巢癌中显著上调表达[3]。随后，我们用半定量RT-PCR和免疫组织化学对80例卵巢癌和11正常卵巢进行了MSLN的检测，初步验证符合芯片杂交的结果[4]。 MSLN是由单克隆抗体CAK1在间皮细胞、间皮瘤和卵巢癌中识别的抗原[5]。MSLN的cDNA编码69 kDa多肽，糖基化后被蛋白酶水解为40 kDa和31 kDa的片段，40 kDa通过糖基磷酯酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol）与胞膜相连，31 kDa脱落成可溶片段。我们检索了所有与MSLN有关的文献（43篇），意外地发现，2004年3月最新的研究提示人CA125是鼠MSLN相应的受体，二者可能有某种功能关联。[6]。尽管CA125用于临床已有20余年了，但其结构和功能始终是个谜一般的问题，直到2001年CA125的结构才基本清楚[7]，全长的CA125是由11 000个氨基酸构成蛋白质的核心结构， CA125蛋白质是由短的胞浆尾、跨膜功能区和巨大的细胞外糖基化的功能区构成。N-末端的胞外功能区的有N-和O-糖基化部位，由60余个串联的重复的模基（motif）组成，模基含156个氨基酸，主要是富含丝氨酸和苏氨酸的序列，正是这个功能单位和MSLN、OC125抗体和M11（识别CA125的B单位）抗体结合[7]。C-末端，有跨膜部分和短的胞浆尾。CA125的释放是在胞浆尾的功能区经过丝氨酸/苏氨酸和/或酪氨酸依赖的磷酸化后，经由细胞内质网和高尔基器释放到细胞外。在人体不同组织和体液有不同形式和大小的CA125[8]。 通常细胞发生恶性转化时出现了新的表型及与之相随的分子改变，这些变化不仅使恶性细胞获得了与正常细胞不同的生长特性，也为我们寻找新的肿瘤诊断标记物和新的药物作用靶提供了线索。目前科学界公认卵巢癌（上皮癌）起源于卵巢表面上皮，而卵巢表面上皮就是分化修饰后的间皮细胞。因此，间皮素--MSLN可能是我们理解卵巢癌生物学行为的“分子桥梁”。我们推测，（1）可分泌的蛋白质MSLN，可能作为新的血清学指标用于卵巢癌诊断，尤其辅助早期诊断，也可用于病情监测。（2）MSLN和CA125的表达可能有关联，MSLN的过度表达可能影响CA125的释放而导致血清CA125水平的降低，二者可能有互补性应用的临床价值。⑶ MSLN可能影响卵巢癌细胞的生长和转移方式，与CA125有某种功能的关联，二者的相互作用可能与卵巢癌细胞的生长和增殖、脱落、与腹膜间皮细胞特异性黏附、种植有关，最终导致腹腔广泛转移。而卵巢癌的独特的生长和转移规律就是瘤细胞长期在腹腔种植和转移。 我们做出以上推测受到以下启示：⑴ 我们前期工作中应用高通量的基因芯片技术发现MSLN在卵巢癌细胞中极高表达，RT-PCR和免疫组化初步验证的结果也支持芯片杂交的结果[4]。2003年下半年，美国学者用同样技术也有类似发现[9]。⑵ 同CA125一样，MSLN是可分泌的蛋白，血清中可检测。但MSLN的可溶片段是31 kDa[5]，远远小于CA125的220 kDa的片段，因此，MSLN释放后易于被血循环吸收，理论上敏感度要高于CA125。⑶ 最新的研究MSLN血清检测的报告有令人震惊的发现[10]：对暴露于石棉的41人分析血清MSLN，33例MSLN血清浓度正常的人，随访8年仍健康，但7例血清MSLN升高的人，3例3年后患间皮瘤，1例5年后患肺癌。这一结果提示，血清MSLN有可能用于癌的早期诊断。⑷ Pastan等[5]发现转染MSLN的细胞较对照细胞有更强的黏附力，推测MSLN可能与细胞的黏附有关。⑸ Rump等[6]用生物化学的方法证实，转染了人CA125 cDNA的COS7细胞（来源于猴肾）胞膜表达CA125蛋白质（尽管cDNA中不包括信号肽和跨膜部分的编码基因），转染后的COS7细胞可与培养基中的鼠MSLN蛋白质特异性结合。研究还显示CA125通过含156个氨基酸的模基与MSLN结合在一起，而CA125分子含60余个串联的模基，这种结合可能是多价的方式。上述结果提示人CA125可能是鼠MSLN的相应受体，但人体细胞系或人体组织细胞中CA125和MSLN是否存在这样的关系尚未得知。⑹初步的研究提示MSLN的过度表达可能会阻止CA125从癌组织释放，因此，导致癌组织中CA125高表达的卵巢癌患者的血清中的CA125不高或正常[6]。⑺ MSLN与CA125的结合可调节细胞间的黏附[6]。（8）2003年8月英国帝国理工学院的学者发现CA125通过免疫调节的机制与肿瘤的侵袭进展有关[11]。 我们课题组近年一直致力于卵巢癌的临床应用基础研究。但此次选题与以往不同，我们是对研究的对象（卵巢癌）采用了高通量的基因芯片进行了侯选目标的筛查，在分析卵巢癌基因表达谱的基础上，复习文献，奠定了课题立项的客观性。MSLN是新发现的肿瘤分化抗原，有关的研究还很少。有关MSLN与人体肿瘤的研究仅33篇文献报道。在卵巢癌方面，最早识别和克隆MSLN是在卵巢癌细胞系OVCAR-3细胞[4，12,13]，一些研究集中在发展抗MSLN的免疫治疗方面 [14-17]。有的学者进行有关血清检测MSLN的方法学研究[18]。从2003年始，美国的一项研究报道用基因芯片发现卵巢癌MSLN表达上调[9]，另一项了他们正在进行MSLN用于卵巢癌筛查，但研究尚未完成[19]。至于以人体组织或细胞系为对象研究MSLN和CA125相互关系以及二者共同作用对肿瘤细胞生长和转移的影响，在国内外均未见报道。在国内，我们课题组首先开始MSLN的研究。文献检索未见其国内他单位的报道，参见第五部分所附的省科技情报所查新报告。 综上所述，我们将在前期发现卵巢癌出现MSLN上调表达的基础上，深入研究MSLN作为诊断（早期诊断）、病情监测生物标记物的可能性；研究MSLN和CA125共表达的状况和消长关系，观察2个指标的互补应用的可能性。同时，探讨MSLN和CA125在卵巢癌细胞生长增殖、黏附和腹腔转移过程的作用及功能关系，理解导致卵巢癌独特生长转移规律的机制，为抗卵巢癌腹腔转移的治疗提供新的思路和药物作用的靶。 参 考 文 献 Gerrnle RT, Hill-Harmon MB, Murray T, et al. Cancer Statistics. 2001. CA Cancer J Clin 2001; 51:15-36 Menon U, Jacobs IJ. The current status of screening for ovarian cancer. Ovarian Cancer. The first editon, New York: Oxford University Press, 2002, 171-188 应用DNA微阵列分析卵巢浆液性乳头状囊腺癌的基因表达谱. 中华妇产科杂志 （待发） Chang K, Pastan I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:136-140 Rump A, Morikawa Y, Tanaka M, et al. Binding of ovarian cancer antigen CA125/MUC16 to mesothelin mediates cell adhesion. J Biol. Chem. 2003; Dec 15 O'Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, et al. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumour Biol. 2001; 22: 348-66 Nustad K, Lebedin Y, Lloyd KO, et al. Epitopes on CA 125 from cervical mucus and ascites fluid and characterization of six new antibodies. Third report from the ISOBM TD-1 workshop. Tumour Biol. 2002; 23: 303-14 Schaner ME, Ross DT, Ciaravino G, et al. Gene expression patterns in ovarian carcinomas. Mol. Biol. Cell 2003; 14:4376-86 Robinson BWS, Creaney J, Lake R, et al. Mesothelin-family proteins and diagnosis of mesotheliomas. The Lancet 2003; 362: 1612-17 Kui Wong N, Easton RL, Panico M, et al. Characterization of the oligosaccharides associated with the human ovarian tumor marker CA125. J Biol Chem. 2003; 278: 28619-34. Chang K, Pastan I. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding a protein detected by the K1 antibody from an ovarian carcinoma (OVCAR-3) cell line. Int J Cancer. 1994; 57: 90-7. Brinkmann U, Webber K, Di Carlo A, et al. Cloning and expression of the recombinant FAb fragment of monoclonal antibody K1 that reacts with mesothelin present on mesotheliomas and ovarian cancers. Int J Cancer. 1997; 71: 638-44 Fan D, Yano S, Shinohara H, et al. Targeted therapy against human lung cancer in nude mice by high-affinity recombinant antimesothelin single-chain Fv immunotoxin. Mol Cancer Ther. 2002; 1: 595-600. 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North Am. 2003, 17: 989-1005 四、研究内容和预期成果(说明项目的具体研究内容和重点解决的关键问题，预期成果和提供的形式。理论成果，应写明在理论上解决哪些科学问题及其科学价值；应用性成果或基础性资料，应写明其应用的可能性及预期效益) 研究内容： 我们的前期研究中用DNA微阵列发现MSLN在卵巢癌组织中极度上调表达，在此基础上，本研究的内容：一是分析和评价MSLN作为卵巢癌诊断和病情监测标记物的价值；二是初步探讨MSLN与CA125的表达及其功能关系、MSLN和CA125的相互作用在卵巢癌细胞的生长、黏附和癌的腹腔转移中的作用。具体如下： 采用RT-PCR和免疫组织化学方法，检测冰冻正常卵巢表面上皮、卵巢良性上皮肿瘤和临床各期的卵巢癌组织标本中的间皮素（mesothelin, MSLN）的基因表达和蛋白质的定位，总结MSLN在正常卵巢和卵巢上皮性肿瘤的表达规律。同时检测CA125在卵巢癌组织中的表达情况，总结MSLN和CA125表达的关系。对MSLN和CA125均表达的标本，用免疫荧光方法并借助共聚焦显微镜分析MSLN与CA125的表达定位的关系，观察二者在人体卵巢癌细胞中是否存在共表达和重叠分布状态。 用ELISA法检测与上述标本同源的健康妇女、卵巢良性上皮肿瘤患者和卵巢癌患者（含早期和晚期）血清的MSLN的可溶蛋白质水平，并同时检测血清CA125水平，探讨（1）MSLN的血清水平与卵巢癌临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系，着重评价临床早期的MSLN水平；（2）同一患者的MSLN与CA125的水平荷和二者的关系；（3）MSLN和CA125在组织细胞中的表达水平水平与血清水平的关系。初步评价MSLN的诊断（尤其是早期诊断的敏感性）和监测卵巢癌病情变化的意义，并探讨MSLN和CA125互补应用的价值。对有腹水的患者，分析腹水中MSLN的浓度。 用免疫荧光法分析一些卵巢癌细胞系的MSLN和CA125的表达定位。用双重荧光标记借助共聚焦显微镜观察MSLN和CA125的定位和共表达情况。 MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长、增殖和凋亡的影响。 卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验：降调MSLN和CA125蛋白质的表达，将已经降调了MSLN和CA125的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，进行体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验，观察MSLN和CA125对人体卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞黏附的影响。 异种细胞黏附实验：由于迄今仅有鼠的MSLN的封闭抗体，所以本课题应用异型细胞黏附实验观察在表达MSLN和CA125的细胞间的黏附过程中MSLN所起的作用。 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型：将表达MSLN和CA125和被降调了MSLN和CA125表达的卵巢癌细胞注入雌裸鼠的腹腔，建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，观察MSLN和CA125在人卵巢癌转移过程的作用。 研究目标： 用分子生物学、细胞生物学和免疫组织学技术，分析间皮素（mesothelin, MSLN）在临床各期卵巢癌患者的血清、腹水、组织标本中的分布表达，探讨MSLN与卵巢癌临床分期、荷瘤量和疾病进展的关系、与传统指标CA125表达及定位的关系，最终总结MSLN是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物，MSLN是否可以和CA125互补应用于卵巢癌的诊断和病情监测。初步探讨MSLN的在卵巢癌细胞生长增殖、黏附和腹腔种植转移的作用，揭示MSLN与CA125的功能关联性，为卵巢癌独特的腹腔生长转移行为提供理论依据，为抗腹腔转移治疗打下基础。 拟解决的关键问题： 1 目前尚无系统研究MSLN用于卵巢癌的诊断和病情监测的报告，因此，本研究要解决的首要问题是MSLN是否有作为卵巢癌的诊断标记物的价值。这一问题的解决也为今后研究MSLN对子宫内膜异位症等与腹膜间皮细胞有关的疾病的诊断价值打下基础。 2 最新研究提示（2004年3月）人CA125是鼠MSLN受体，因此，研究人体细胞MSLN和CA125的表达定位关系及其与卵巢癌疾病状态的关系非常重要。在明确这一问题的基础上，将为临床互补使用这两个指标提供理论依据。 3 卵巢癌的主要转移途径是直接在腹腔的腹膜种植形成转移灶，腹膜间皮是人体表达MSLN的主要细胞。卵巢癌细胞恶性转化后同时出现CA125和MSLN，而CA125可能是MSLN的受体。这一重要线索提示二者可能与卵巢癌的腹腔转移有关。通过体外细胞的黏附实验和裸鼠动物模型的研究，阐明MSLN在CA125在这一过程的作用，为理解卵巢癌转移方式提供理论依据，并可为开发抗肿瘤转移新药提供新的思路和药物作用靶。 预期研究结果： 本课题经过3年左右的研究，将对MSLN在卵巢癌诊断（含早期诊断）和病情监测的价值基本得出结论，如结论是肯定的，对卵巢癌的临床实践有重要的意义。这一成果可达到国际先进水平。 阐明MSLN和CA125的表达关系，MSLN将可以与CA125联合用于临床实践，使得医师更准确地判断病情。 完成观察MSLN和CA125共同作用对细胞黏附和癌的转移的影响的研究，将可以深入理解二者的功能，理解癌腹腔转移的分子机制，为开发新的抗癌药提供理论依据。 本课题的完成，将撰写和投稿国外SCI期刊文章3—4篇，国家级期刊4—6篇，申报国家级成果一项，省级成果2—3项。 五、拟采取的研究方法和技术路线(包括理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性分析、创新处；研究工作的总体安排和年度进度) 拟采取的研究方案: MSLN在组织中的表达分析：用RT-PCR和免疫组织化学的方法分析来自正常卵巢表面上皮、卵巢良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌的手术切除标本的MSLN和CA125的表达，观察 ⑴MSLN的表达阳性率和定位；⑵ MSLN和CA125的共表达状况；⑶对出现MSLN和CA125共表达的标本，用MSLN和CA125的抗体双重标记，借助免疫荧光技术用激光共聚焦显微镜，分析二者在细胞的定位是否重叠，即形态学上寻找MSLN和CA125结合的证据。 MSLN的血清学和腹水检测：用ELISA法检测来自健康妇女和与1项中同源的卵巢良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌患者血清中的MSLN，⑴由健康妇女来源的数据确定MSLN的正常值范围，以 此作为基线观察肿瘤患者血清中MSLN的水平；⑵分析MSLN的水平与临床分期和组织学分类的关系；⑶观察手术切除肿瘤前后和化疗后MSLN的变化、肿瘤复发时MSLN的值的改变；⑷对上述人群同时监测血清CA125的水平，与组织细胞的MSLN和CA125的表达状况相联系，观察MSLN的过度表达是否会影响癌组织CA125的释放和血清CA125的水平；⑸检测腹水中MSLN和CA125的水平， 并与血清的浓度比较，结合组织细胞的表达状况，分析MSLN的释放和循环规律。 在总结上述1和2项的基础上，最终总结MSLN是否可作为卵巢癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物，MSLN是否可以和CA125互补应用于临床理解和判断卵巢癌疾病状况。 卵巢癌细胞系的MSLN分析：以阳性表达MSLN的卵巢上皮性囊腺癌细胞OVCAR-3为对照，检测卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）、黏液性囊腺癌（3AO）、透明细胞癌（TOV-21G）3株细胞系中的MSLN和CA125的表达和定位。同时分析培养液中MSLN和CA125的水平。用双重荧光标记借助共聚焦显微镜观察MSLN和CA125的定位和共表达情况。 MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长和增殖的影戏：用MSLN和CA125的反义寡聚核苷酸或RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）降调卵巢癌细胞系中MSLN和CA125的表达，用流式细胞术和Western blot证实降调后，将已经降调了MSLN和CA125的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，用细胞克隆形成率、MTT法、流式细胞术等观察MSLN和CA125对卵巢癌细胞生长、增殖能力和细胞凋亡的影响。 体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验：用MSLN和CA125的反义寡聚核苷酸或RNA干扰技术降调卵巢癌细胞系中MSLN和CA125表达，将已经降调了MSLN和CA125的卵巢癌细胞系作为实验组，与未处理的卵巢癌细胞系为对照，进行黏附实验。手术中取人卵巢癌患者的腹水，分离得到腹水中腹膜间皮细胞，体外原代培养腹膜间皮细胞，将间皮细胞加入培养板的孔内；用51Cr标记4株卵巢癌细胞系，将标记后的细胞系置于包被了间皮细胞的培养孔内，37OC培养30分钟，细胞黏附在此间发生，用γ记数器探测放射活性，计算细胞的黏附率。该实验探讨MSLN及其可能的受体CA125在卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞黏附过程中的作用。 异型细胞黏附实验：由于至今尚无人MSLN的封闭抗体，所以本课题应用异型细胞黏附实验观察同时表达MSLN和CA125的人卵巢癌细胞与表达MSLN的鼠内皮样细胞LO的黏附率，并用针对鼠MSLN的封闭抗体B35封闭LO细胞后，观察异型细胞的黏附率的变化。该实验进一步分析MSLN和CA125在细胞黏附过程中的作用。 建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型：将OVCAR-3细胞以10×106/个浓度注入雌裸鼠的腹腔，建立卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型，5周后记数腹腔转移灶的数目。此为对照组。用MSLN的反义寡聚核苷酸或RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）分别降调MSLN和CA125蛋白质的表达，用流式细胞术定量分析蛋白质表达量后，将已被降调了MSLN和CA125的OVCAR-3细胞分别注入雌裸鼠的腹腔（10×106/个），5周后将两个实验组与对照组比较，记数实验组腹腔转移灶数目。该实验在体内实验的基础上探讨MSLN和CA125对卵巢癌腹腔转移形成的作用。 可行性分析： 我们课题组多年从事卵巢癌的基础研究，主要集中在卵巢癌的早诊和癌的侵袭转移等方面。2003年，申请人采用高通量的基因芯片技术，用含人8000条基因的DNA微阵列分析了卵巢癌的基因表达谱，发现了56条上调和23条下调的基因，79条表达差异的基因中，其中，间皮素（mesothelin, MSLN）的变化最为显著，位于79条基因之首，在卵巢癌中显著上调表达。随后，对用于DNA微阵列的标本，我们用半定量RT-PCR和免疫组织化学方法进行了MSLN的表达检测，初步验证了符合芯片杂交的结果。我们的前期工作使得我们避免了选题上的盲目性，也为课题达到预期的研究目标打下了客观的基础。 由于目前尚无MSLN的特异封闭抗体，故本研究拟用RNAi和反义寡聚核苷酸技术降调MSLN。短的双链RNA可特异性的降调或消除与其序列同源的基因的表达，可下调相应功能蛋白质的表达，这一现象被成为RNA interference或RNAi。具体应用中用仔细设计的21个碱基的双链RNA，借助转染方式被导入哺乳细胞内，可失活与其任一链序列同源的基因的功能，与其他降调基因技术（如反义核酸等）相比降调高效。申请人2002年在英国ICRF（帝国癌症基金，现Cancer Research UK）工作时多次使用该技术，使得本课题应用这一新技术得到保证。 申请人于2001年在英国ICRF参研“肿瘤细胞中整合素介导的蛋白质水解作用与肿瘤的侵袭和转移”（至今英国ICRF的研究者未完成该项目）中部分内容，曾长期使用激光共聚焦显微镜观察活的瘤细胞膜的蛋白水解的动态过程，因此，具有熟练应用激光共聚焦显微镜的能力。 医院是省肿瘤防治中心，申请人所在的妇科是省妇科肿瘤医疗、教学和科研重要基地，是医科大学首个培养妇科肿瘤专业博士研究生教学点。每年住院手术治疗的妇科肿瘤患者达3000多例，其中，卵巢肿瘤患者约1000多例。对所有治疗的病例，病案资料齐全，对恶性肿瘤患者，有专人登记和随访。因此，我们有充足的研究所需的标本和病例资料，使进行此项研究得到保证。 肿瘤研究所、省肿瘤研究重点实验室均附设在医科大学医院，有较好的开展分子生物学、肿瘤细胞生物学等研究的条件，拥有超低温冰箱、实时定量PCR仪、凝胶成像系统、γ记数仪、激光共聚焦显微镜（医科大学药理教研室）、DNA测序仪、动物中心等开展此项目的必备设备和条件。主要申请人有肿瘤学、病理学、癌的侵袭转移生物学、细胞生物学和分子生物学等丰富的研究经验，故申请单位有充足信心和能力完成并达到预期研究目的。 4、本项目的特色与创新之处： MSLN的基因在人体卵巢癌组织中上调表达的研究报道，仅有2003年8月的美国一篇报道，与我们用基因芯片筛查的研究同步，但美国学者没有对该指标进行后期的验证工作，而这一步分析是芯片杂交结果的必需部分。我们不仅发现了MSLN基因在卵巢癌组织中的上调显著，还在基因和蛋白质水平验证了芯片的结果。截止到本申请撰写时，国内未见MSLN的研究报道。本课题的选题具新颖性。 本组在MSLN的临床应用价值方面率先开始系统的研究。MSLN用于卵巢癌诊断指标的研究也仅有一项美国的研究报道，且尚未完成。国内未见相关报道。 CA125已经长期应用于临床实践，根据2003年12月的最新的研究报道启示，在本研究中我们将MSLN的表达与CA125的表达相联系，试图发现其内在联系，如能达到预期的目的，不仅为临床实践提供价值很高的参数，也将为研究MSLN和CA125的功能开辟新的途径。 本研究根据最新的实验研究结果和合理地科学推测，设计进行MSLN和CA125对卵巢癌细胞黏附的影响的实验研究，尤其是结合卵巢癌的独特转移规律，研究MSLN和CA125对卵巢癌细胞和腹膜间皮细胞（表达MSLN）的黏附的影响，在此基础上拟建立动物模型观察MSLN和CA125在体内对卵巢癌转移的作用。结果将对理解癌腹腔转移的分子机制和开发新的抗癌药提供理论依据，这一思路在国内外均未见报道，具明显的创新性。 附：省科技情报所查新报告： 检索词：#1 间皮素，#2 卵巢癌，#3 CA125， #4 基因芯片 检索策略：1 #2 和 #4， 2 #2 和 #3 3 #2 和#3 和#1 结论：符合检索式1的文献3篇，符合检索式2的文献共74篇，符合检索式3的文献共0篇。未查到间皮素对卵巢上皮癌的诊断价值及与CA125的相互关系的文献报道。 年度计划： 2005年 完成MSLN在人体正常卵巢、卵巢良性上皮性肿瘤和临床各期的卵巢癌的手术切除标本的MSLN和CA125的表达的实验、血清检测MSLN和CA125的实验、结合临床和病理资料，初步总结MSLN对卵巢癌的诊断价值及与CA125表达水平的关系。进行卵巢癌细胞系的MSLN分析和异型细胞黏附实验。可总结论文2-3篇。 2006年继续随访卵巢癌患者和健康妇女，长期观察MSLN的病情监测价值和早期诊断的价值。继续进行和体外卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞的黏附实验。可总结论文1-2篇 2007年继续随访工作。进行动物模型的研究观察MSLN和CA125对卵巢癌腹腔转移的作用。资料分析、总结结果，撰写论文2-3篇，申报成果。 六、实现本项目预期目标已具备的条件(包括过去的研究工作基础，现有的主要仪器设备、研究技术人员及协作条件，从其它渠道已得到的经费情况，在研或完成的省基金资助项目情况) 工作基础 尽管近年的科研活动取得了很大成绩，加深了我们对卵巢癌的理解，提高了研究者的理论和实验水平，但我们所取得的成果距临床实用还有很大差距，仍未找到有前途用于临床实际诊断的指标，而且，也没有发现导致卵巢癌独特腹腔种植转移的关键分子和途径。为此，申请人在不断学习和追踪最新科技动态基础上，决定在卵巢癌细胞基因组范围内，在恶性转化细胞全面筛查寻找有价值的分子，避免选题上的偏差。2003年申请人与瑞典Uppsala 大学病理学系表达阵列工作站的Anders Isaksson博士合作，采用高通量的基因芯片技术，识别卵巢浆液性乳头状囊腺癌（卵巢癌）的基因表达谱。用含8000条人基因的cDNA微阵列分析人体卵巢癌标本，以正常卵巢组织标本做参照；数据处理首先采用标准化处理，严格过滤不合格克隆点，对剩余的高质量克隆点（约1500条基因）进行差异基因筛查。结果发现①卵巢癌组织中96条基因的表达有显著改变，其中，17条基因功能尚未明，在功能明确或功能有所了解的基因中，56条基因上调，23条基因下调。②Mosothelin和 keratin 19是与卵巢癌组织发生有关的极度上调表达基因，也是有潜在价值的诊断标记物。③RB1、CCND1、FosB、ST13 和WISP2可能是与卵巢癌的发生有关的癌基因。④SPINT2、SLPI、MMP 7和DCN是表达显著改变的与肿瘤侵袭转移相关的蛋白酶和细胞外基质成分。 在上述高通量芯片筛查的基础上，我们广泛查阅了有关文献，锁定MSLN为研究目标。随后，我们用半定量RT-PCR和免疫组织化学方法进行了MSLN的表达检测，结果发现：①半定量PRT-PCR显示，42例卵巢癌MSLN mRNA均显著表达，而11例正常卵巢皮质组织中MSLN mRNA呈阴性。②用MSLN的5B2抗体（针对细胞膜的MSLN片段）检测石蜡包埋组织发现，42例卵巢癌中均为阳性，11例正常卵巢皮质则阴性。初步验证符合芯片杂交的结果。 这些结果使得我们避免了选题上的盲目性，也为课题达到预期的研究目标打下了客观的基础。 工作条件 医科大学医院是省肿瘤防治的中心，省肿瘤研究所和省肿瘤分子诊断重点实验室均设在该院内。主申请人所在的妇科也是省妇科肿瘤医疗、教学和科研的重要基地，科室有自己独立的研究室，拥有进行细胞培养、免疫组织化学实验、病理学实验、PCR实验等必备的设备和条件，同时，依托在本院内附设的省肿瘤研究所和省肿瘤分子诊断重点实验室的优良环境，为课题的实施提供了客观上硬件的保证。 承担的课题有： ①省自然科学基金项目“卵巢上皮性癌基质金属蛋白酶的释放与活化”，项目编号301391。在研究中我们发现了在国内外率先研究MMPs活化形式与肿瘤侵袭转移的关系，并发现活化的MMP-2与卵巢癌的侵袭转移高度相关，结果发表在国际权威杂志Gynecol Oncol上，影响因子2.2。在国内首先使用肿瘤细胞与间质细胞共培养系统模拟体内肿瘤微环境，探讨了癌细胞与成纤维细胞相互作用对MMPs活化的影响。其中IGF-Ⅱ可上调MMP的表达。在国内外首先开展了整合素αvβ6在卵巢肿瘤的表达研究，这种伴随卵巢癌恶性表型出现的新型整合素，调节MMP的功能，与卵巢癌侵袭转移密切相关。本课题已在国内外权威期刊发表论著5篇。完成了成果鉴定，正在申报成果奖励。 ②省科技厅项目“卵巢肿瘤细胞凋亡与调控”，项目编号002763060，“卵巢肿瘤细胞凋亡与肿瘤生物学行为，项目编号00547001D-16，这两项研究基本完成，总结论文陆续投往国内期刊。 ③省科技攻关项目“应用DNA微阵列分析卵巢癌基因表达谱”，已完成芯片杂交和数据处理，现正进行对芯片杂交结果的验证，已初步总结论文3篇。本课题也是在此基础上选题进行的 七、申请者和项目主要成员业务简历(按人填写最高学历、学位、身份证号和研究工作简历，近期发表的与本项目有关主要论著目录和科研成果名称及获奖情况，标明本人名次) 申请人简历 八、合作单位意见(对合作研究内容、参加人员科研素质及保证研究工作条件等签署具体意见) 单位(公章) 年 月 日 九、申请者所在单位学术委员会或同行专家审查意见(对本项目的意义、研究方案、申请者和项目组主要成员的科研能力等签署具体意见，如单位无学术委员会，可由五人以上同行专家评议审查) 主任或副主任委员(签章) 年 月 日 十、申请者所在单位审查意见(对是否同意学术委会意见，经费预算是否合理，有无其他经费来源，能否保证研究计划实施所需的人力、物力、工作时间等签署具体意见) 单位领导(签章) 年 月 日 单位(公章) 年 月 十一、参加审查人员 姓名 年龄 专长 职称、职务 工作单位 签 字