乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证毕业论文

毕 业 论 文 目：乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 姓 名： 学 号： 专 业：   指导教师： 教师职称： 研究起止日期： 研究提交日期： 二 ○一 三 年 十一 月 目 录 毕业论文 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 中文摘要................................................................................................1 英文摘要................................................................................................1 前言........................................................................................................2 1.与方法.........................................................................................3 1.1试剂盒........................................................................................3 1.2仪器.............................................................................................3 1.3方法.............................................................................................3 1.3.1 溶液配制...........................................................................4 1.3.2 铺板...........................................................................4 1.3.3 加样步骤...........................................................................5 2. 结果....................................................................................................6 2.1 曲线与线性范..................................................................6 2.2 准确度（回收率）的验证......................................................6 2.3 精密度的验证..........................................................................7 2.3.1 板内精密度的验证.........................................................7 2.3.2 板间精密度的验证.........................................................8 2.4 检测限（LOD）计算.............................................................10 3. 讨论...................................................................................................10 3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义.............................................10 3.2 常用定量分析方法.................................................................11 3.3 方法概述................................................................................11 3.4 方法学验证内容....................................................................12 3.5 结果分析及应用评价.............................................................13 参考文献................................................................................................14 综述........................................................................................................15 致谢........................................................................................................18 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 中文摘要 目的：对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。方法：ELISA法定量分析，应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8ng/ml做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。结果：标准曲线R2=0.997，准确度97.07%，1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，检测限LOD为0.172ng/ml， 低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。结论：该HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不能用于临床标本的分析。 关键词：乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法学验证 The reification of the HBsAg ELISA quantitativmethodology Abstract In English Object: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering company to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted six concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the accuracy of RSD of 1.5ng/m is 16.78%，the RSD that cannot meet the demand of ng/ml basic level is less than <15% in common. The LOD is 0.172ng/ml, the testing of Low concentration samples （<1.5ng/ml）are lower than high concentration samples in both accuracy and precision , which as a result make it unsuitable for low concentration sample testing. Conclusion: the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample. Key words: HBsAg Quantitative analysis Verification Methodology. 乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 前 言 乙肝病毒感染是我国最常见的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清标志物是检测乙肝病毒感染最主要的病原标志。随着免疫学技术的不断发展，抗原抗体检测灵敏度明显提高，使低水平乙肝病毒得以检出，对临床诊断及流行病学有重要意义[1]。ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。目前临床上多倾向于做定量分析，若想知道检验结果是否可靠，实验室则必须对所用试剂盒进行方法学验证，本实验对福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现如下。 材料与方法 1.1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 1.2 仪器 酶标仪：Bio-Rad 680 ；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix ；电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。 1.3 方法 1.3.1．溶液配置 1×PBS缓冲液的配置： 称取8g NaCl、 0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 标准品的配置：原始标准品浓度为8 ng/ml。。取6个2mlEP管，分别标记为S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul备用，按照下表稀释方案进行稀释。 表1 标准品的稀释方案 编号 终浓度 （ ng/ml） 预加1×PBS 取 剩余（ul） 标记 （ul） S1 8 0 标准品 120 S2 4 60 S1 60 60 S3 2 60 S2 60 60 S4 1 60 S3 60 60 S5 0.5 60 S4 60 60 S6 0.25 60 S5 60 60 质控品的配置：50ul/well, 共5复孔需250ul，配置300ul备用，取3个2mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，按照下表稀释方案进行稀释。 表2 质控品的稀释方案 编号 终浓度 （ ng/ml） 预加1×PBS 取 剩余（ul） 标记 （ul） C1 6 150 标准品 450 C2 3 300 C1 300 300 C3 1.5 300 C2 300 300 1.3.2．铺板方案 取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按照下表铺板方案进行铺板在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul。空白对照加入1×PBS缓冲液。 表3 铺板方案 1 2 3 4 5 A S1 C1 C2 C3 PBS B S2 C1 C2 C3 PBS C S3 C1 C2 C3 D S4 C1 C2 PBS E S5 C1 C3 PBS F S6 C2 C3 PBS 1.3.3．加样步骤 加入酶标抗体，50 ul/well，震荡。37℃电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次， 加入A、B液, 50 ul/ well，37℃电热恒温培养箱温育15 min。加入终止液，50 ul/ well。酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件，选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值。 结果 2.1 标准曲线与线性范围 标准品理论浓度对应的实测OD值 表4 实测OD值 HBsAg(ng/ml) 8 4 2 1 0.5 0.25 OD 1.66 1.00 0.62 0.39 0.31 0.27 以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.9973，显示具有良好的相关性 图1 线性关系图 2.2 准确度（回收率）的验证 质控品理论稀释浓度对应实测浓度值 表5 实测浓度值 HBsAg (ng/ml) 测定值 1 2 3 4 5 6 6.24 4.56 5.73 6.09 6.40 3 3.36 3.29 3.55 3.28 3.48 1.5 1.24 1.27 1.17 1.17 1.20 质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，下表是对每个浓度梯度进行准确度（回收率）的验证。 表6 准确度的验证 HBsAg (ng/ml) 测定值（ng/ml） 回收率（%） 平均回收率 RR（%） 3个浓度的平均回收率 6 6.24 103.93 97.58 97.07% 4.56 75.92 5.73 95.57 6.09 101.45 6.40 106.60 3 3.36 112.13 113.07 3.29 109.57 3.55 118.40 3.28 109.40 3.48 115.83 1.5 1.24 82.47 80.56 1.27 84.67 1.17 78.07 1.17 77.67 1.20 79.93 结果显示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率为97.58%，113.07%，满足限度要求在85%-115%的范围内，而HBsAg 1.5ng/ml的平均回收率为80.56%，满足方法定量限在80%-120%的范围内。3个浓度梯度的平均回收率为97.7%，显示准确性好。 2.3精密度的验证 2.3.1 板内精密度的验证 表7 板内精密度的验证 HBsAg (ng/ml) 测定值 RSD(%) 1 2 3 4 5 6 6.24 4.56 5.73 6.09 6.40 5.80±0.74 12.73 3 3.36 3.29 3.55 3.28 3.48 3.39±0.12 3.50 1.5 1.24 1.27 1.17 1.17 1.20 1.21±0.04 3.69 上表中RSD(%)这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数CV值，HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准。而3ng/ml,和1.5ng/ml的变异系数CV为3.5%，3.7%，符合显示孔间重复性好，符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，精密度高。 2.3.2 板间精密度的验证 从同一实验室中获取2组同样的数据，做板间精密度的验证。首先对同一实验条件下不同实验人员所获得的数据是否可用于板间分析做验证。 表8 板间精密度的验证 HBsAg(ng/ml) 8 4 2 1 0.5 0.25 第二组OD值 1.98 1.42 0.86 0.58 0.40 0.31 第三组OD值 1.31 0.77 0.36 0.17 0.09 0.03 以HBsAg理论浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系。 图2 线性关系曲线 以上标准曲线结果显示第二组数据的R2 =0.967，第三组数据R2 =0.991。第二组数据由于有一些孔与标准曲线偏离较大，但考虑到随机抽样与均数存在一定误差，还是可以用于统计学分析。下表对3组数据做板间分析。 HBsAg (ng/ml) 测定值 RSD(%) 1 2 3 4 5 6 6.23 6.10 5.99 4.55 5.78 5.39 5.73 6.08 6.34 6.08 6.64 6.49 6.39 6.84 5.96 6.04±0.55 9.10 3 3.36 3.36 2.59 3.28 2.93 2.71 3.55 3.53 2.81 3.28 3.07 2.49 3.47 2.99 2.52 3.06±0.37 12.06 1.5 1.24 1.46 1.19 1.27 1.5 1.24 1.17 1.73 1.25 1.16 1.71 1.21 1.19 1.76 1.11 1.34±0.23 16.78 从表中3个组的数据比较可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分别为9.10%，12.06%，满足对ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，精密度高。而HBsAg 1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不是很高，故以下对HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的三组数据做分析。 对HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的准确性，精密度分析 表9 精密度分析 HBsAg (ng/ml) 测定值（ng/ml） 回收率（%） 平均回收率 RR（%） SD% CV% 第一组数据 1.5 ng/ml 1.24 82.47 80.56 2.98 3.70 1.27 84.67 1.17 78.07 1.17 77.67 1.20 79.93 第二组数据 1.5 ng/ml 1.46 97.60 109.1 9.49 8.70 1.50 100.00 1.73 115.60 1.72 114.53 1.77 117.67 第三组数据 1.5 ng/ml 1.19 79.47 80.27 3.80 4.74 1.25 83.13 1.25 83.53 1.22 81.07 1.11 74.13 从上表可知第一组数据和第三组数据准确性差，精密度高。而第二组数据准确性高，而精密度相对于第一组和第三组数据要好。综上对于HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的这一低浓度梯度的板内准确性和板间精密度相对于高浓度的线性要差一些。 2.4 检测限（LOD）计算 LOD为取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。 表10 空白孔的OD值 1 2 3 4 5 Mean SD LOD 空白孔OD值 0.158 0.153 0.16 0.162 0.17 0.16 0.00622 0.172 由上表可知，LOD为0.172。检测限（LOD）表示分析方法检测低浓度样品的能力，也称为方法的灵敏度，LOD通常为标准曲线上的最低浓度点，要求标准曲线上的最低浓度点应>LOD，此标准曲线上最低浓度点为0.25，大于LOD（0.172），故此标准曲线线性好。 讨论 3.1 乙肝表面抗原定量分析的意义 乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的发展，乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据。这在目前的临床治疗中应用十分广泛。 3.2 常用定量分析方法 此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又称解离增强镧系荧光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。此技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法【3】。全自动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度【4】，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。 3.3 方法概述 目前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以避免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【5】。本次实验是对实验室的一种试剂盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。 应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低浓度为0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml ～600ug/ml之间，高者可达2000ug／ml以上【6】，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。 3.4 方法学验证内容 方法学验证内容一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。标准曲线亦称校正曲线，系指生物样品中所测定的样品浓度与响应的相关性，通常用回归分析方法所得的回归方程来评件，此实验所用了6个浓度点建立标准曲线。方法准确度指待测浓度与真实浓度的接近值了，一般用相对回收率表示，限度要求在85%—115%的范围内。精密度则表示分析方法的可重复性，是对同一样品每次测定结果的一致性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于ug/ml级水平的相对标准偏差一般应<10%, ng/ml级水平的相对标准偏差一般应<15%。检测限则表示分析低浓度样品的能力，通常又称为灵敏度。 3.5 结果分析及应用评价 第一组数据标准曲线R2=0.9973，显示具有良好的相关性，HBsAg 浓度为6ng/ml和3ng/ml 的回收率分别为为97.58%，符合113.07%，符合限度要求在85%—115%的范围内。但是HBsAg 浓度为.5ng/ml的回收率为80.56%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml变异系数CV分别为12.73% ，3.69% ，3.50%，而HBsAg 6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.73%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作引起例如加样不准不属于试剂盒的问题，故可以认为此试剂盒对于批内高、低浓度样品的检测精密度还是可以的。在做3个组数据的批间的精密度分析时，发现6，3，1.5ng/ml变异系数CV分别9.10%，12.06%，16.78%，分布方式从低到高，前2个浓度满足对ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求。1.5ng/ml的RSD为16.78%，不满足ng/ml级水平的RSD一般应<15%的要求，显示低浓度的孔间重复性差，精密度不是很高。 综上分析，该试剂盒对于高浓度样品的检测具有良好的准确性和较高的精密度，而对于低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，不适合低浓度样品的检测。目前绝大多数HBV感染者外周血HBsAg浓度很低，该试剂盒不能全面检测出此类人群，故该试剂盒不能用于临床标本的检测。 参考文献 【1】魏来，陶其敏．努力规范肝脏疾病的免疫学诊断．中华检验杂志，2003，26：69—71 【2】刘晓梅，张世兰．HBsAg阴性结果的慢性乙型肝炎患者病毒血症水平与临床的关系[J】．临床检验杂志，2004，22(5)：381-382． 【3】李辉霞，王德志，杨朋，乙肝两对半定量检测及临床意义，医学信息杂志2010，23（9）。 【4】 Weber B, Dengler T, Berger A .Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surface HBsAg detection IMMUIITE HBsAg_and IMMUlITE 2000 HBsAg[ J] ．J .Clin Microbiol,2003 ,41,(1 )；13 5—143 ． 【5】郑怀竞．临床免疫学检验质量保证[M]．北京：北京医科大 学，中国协和医科大学联合出版社，1995，99． 【6】王朝阳，段文强 ,乙肝两对半阴阳性之临床意义，中国社区医师杂志，2007，26(1)：12-13. 综 述 乙肝表面抗原是人类在感染乙型肝炎病毒后出现的第一个病毒血清学标志物,通常在临床症状出现之前即在血液中出现。我国是乙型肝炎病毒的高发区,加强对乙型肝炎(简称乙肝)的检出能力,是保障我国人民健康,促进经济发展和社会进步的重要措施。由于病毒感染的窗口期问题、乙肝试剂检测质量以及实验中的各种不确定因素影响着医院对乙肝病毒的检测。随着医疗检验技术的发展,临床检测乙肝表面抗原采用的方法有了新的发展,尤其是发光法定量(或半定量)检测乙肝表面抗原近年有上升趋势。结合我国乙肝病毒感染的现状,选择反应快、灵敏度和特异度均高但又要成本低的检测方法至关重要。我们在追求低成本检测的同时,必须保证检测的质量。乙肝表面抗原是乙肝两对半的其中一项，乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用。但随着临床医学的发展，乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求，特别是在疗效观察以及乙肝疫苗注射后抗体产生情况的观察上有明显的不足。随着检验医学的发展，乙肝两对半定量测定成为可行，大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。而且乙肝两对半定量检测可与HBV DNA荧光测定相互补充，综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据。这在目前的临床治疗中应用十分广泛。此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又称解离增强镧系荧光免疫分析，是近十年发展起来的一种微量分析方法。 此技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围更宽，试剂盒货架寿命长，操作简便和非放射性等特点，成为最有潜力的一种标记免疫分析方法。全自动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。目前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被抗体、酶标抗体的结合位点尽可能的远。以避免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题。本次实验是对实验室的一种试剂盒，即福州蓝图生物工程有限公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断是否能用于临床样本分析。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。往预先包被HBsAg捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本，标准品，HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml 3个浓度梯度5复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。选择最低浓度为0.25ng/ml的原因是因为，绝大多数HBV感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml ～600ug/ml之间，高者可达2000ug／ml以上，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。本研究旨在了解目前临床乙肝表面抗原检测方法的变化,并对新应用的发光法检测系统的性能作出评价,对检测质量的提高和优秀的检测系统在临床的推广应用非常重要。本次研究的目的是对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的方法学性能和实验方法进行评价和分析。研究方法是取卫生部临床检验中心指定生产的HBsAg的弱阳性质控血清,进行项目给定的临界值浓度+20%、-20%的配制,并对其检测,建立自己实验室的临界值浓度范围;连续20d对HBsAg的弱阳性质控血清进行检测,计算s/co值,统计分析日间精密度CV;用EQA的质控物检测HBsAg,进行阴阳性符合率计算。研究结果是HBsAg定性试验的临界值分别为0.55U/ml;阴阳性符合率全部为100%;HBsAg:日间精密度CV≤11.42%。结论HBsAg定性试验的分析性能能满足临床要求,评价方案简单易行,项目临界值水平与厂家提供的不完全相同,说明厂家提供的方法学指标不能直接引用,各临床实验室应建立自己的分析性能指标。 致 谢 在本次论文设计过程中，感谢我的学校，给了我学习的机会，在学习中，老师从选题指导、论文框架到细节修改，都给予了细致的指导，提出了很多宝贵的意见与建议，老师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。这篇论文是在老师的精心指导和大力支持下才完成的。他们严谨的学术态度，幽默风趣的授课方式给我留下了深刻的影响。在这篇论文构思和写作过程，我的论文指导老师王敏教授，对我论文的完成更是功不可没，张老师每次对我的疑问给予细心的解答并给出写作建议，对我的论文进行细心的修改，使得我的论文结构一步一步的完善，内容日趋丰满。没有张老师的细心指导，这篇论文是不可能完成的。 感谢所有授我以业的老师，没有这些年知识的积淀，我没有这么大的动力和信心完成这篇论文。感恩之余，诚恳地请各位老师对我的论文多加批评指正，使我及时完善论文的不足之处。 谨以此致谢最后，我要向百忙之中抽时间对本文进行审阅的各位老师表示衷心的感谢。