第1章第六节精液保存

第5章 家畜繁殖技术 第六节 精液保存和运输 精液保存的意义 1.精液经过保存后可以随时取用，实现异地配种，扩大配种数量，充分发挥优良公畜的配种效能，体现人工授精的优越性； 2.可以延长精子在体外的存活时间； 3.便于使用和运输。 现行的精液保存方式有3种，即常温(15～25℃)保存、低温(0～5℃)保存和冷冻(-79～-196℃)保存。常温和低温保存是液态，故称液态保存。 一、保存方法 （一）精液的常温保存 常温保存的温度在15～25℃之间，温度允许有一定变动，所以又称为变温保存或室温保存。常温保存所需设备简单，特别适合猪的精液。 1.保存原理 利用酸性环境抑制精子的活动，使其营养物质消耗减少，一旦PH恢复到7.0左右，精子还可以复苏，保持其受精能力。通过在稀释液中加入酸性物质，创造酸性环境，同时利用抗生素抑制微生物的繁殖，可以使精液保存一定时间。在一定范围内是可逆抑制，通常把pH调整到6.35左右。 2.稀释液配方(见课本128页) （二）精液低温保存 （保存温度0-5 ℃ ） 1.保存原理 精子在体温状态下，能够进行正常的代谢活动，随着温度的降低，精子的代谢活动减弱，当温度降至10℃以下时，精于的代谢活动受到抑制。营养物质消耗减少，代谢产物积累减缓，精子存活时间延长。但当温度回升，精子的代谢活动又逐渐恢复，并且不丧失受精能力，因此在低温下能延长精子的存活时间，故可达到保存目的。 2.保存方法 精液进行低温保存时，应采取逐步降温的方法，并使用含卵黄的稀释液，以防冷休克。 把包装好的精液放到0～5℃的低温环境中，经1～2h，精液即降至0～5℃。在保存过程中，要维持温度的恒定，防止升温。 3.低温保存稀释液 见课本126页配方。 （三）精液冷冻保存 精液冷冻保存是利用液氮(-196℃)或干冰(-79℃)作冷源；将精液经特殊处理后保存在超低温下，以达到长期保存的目的。 精液冷冻保存是人工授精工作的一大进步，由于保存时间的延长，使精液的使用不受地区的限制，从而加快了家畜品种的育成和改良速度。 1.精液冷冻保存的原理 精子在超低温下，其代谢活动几乎停止（完全被抑制），使其在静止状态下保存下来，一旦升温又能复苏而不失去受精能力。其理论依据是玻璃化假说和甘油保护学说。 （1）玻璃化假说 物质的存在形式有气态、液态和固态，其中固态又分为结晶态和玻璃态。在不同的温度条件下，这两种形式可以相互转化。 A.结晶态 当精液的温度由冰点（0℃）缓慢降到-60℃左右时，精液中的水分由液态变成固态，冰晶颗粒大而均匀，叫做结晶态或冰晶化。对细胞内的细胞器构成巨大的破坏作用，因而，把这一温度区称为有害温区。缓慢降温形成冰晶化是造成精子死亡的主要原因。 B.玻璃态 但在特定冷冻剂参与下，精液由低温骤然降到-60℃度以下，精液变成固态时，冰晶颗粒细小而均匀，叫做玻璃态（化）。不会对细胞器造成破坏，从而达到长期保存的目的。 经试验证明，在0～60℃是冰晶形成的温度区域，叫做危险温度区。而且在逐渐降温的条件下才能形成。降温越慢，冰晶形成越大，尤以-15～25℃为甚。玻璃化必须在-60～-250℃的低温区域内，经快速降温，迅速越过冰晶化而形成。 (2)甘油保护学说 快速降温可使精液跨越结晶态进入玻璃态，但急剧降温会造成精子冷休克。研究表明，向稀释液中添加甘油，不但可增强精子的抗冻能力，而且又可防止冰晶化和精子冷休克。 甘油又名丙三醇，分子式CH2（OH）－CH2（OH）－CH2（OH），为高热能脂肪家族，其3个羟基（OH）为亲水基团，可与精液中的水结合，限制和干扰水分子的晶格排列，而产生冰晶；其烃链为疏水基团，朝向精子，可阻止精子的内外水分相互渗透，从而使精子保护在玻璃化膜中。 但是，甘油浓度高时，对精子有危害作用，应掌握甘油的用量。一般牛冷冻精液中甘油通常加入5％～7％。 除甘油外，其他多羟化合物如二甲基亚砜(DMSO)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、糖类等都具有抗冻作用。 2.精液冷冻保存稀释液配方（见课本） 3. 冷冻精液制作方法 牛的精液冷冻已普及，现以牛精液冷冻为例，将精液冷冻制作技术叙述如下： (1)采精及精液品质捡查 精采精后，立即进行精液品质检查，制作冷冻精液的精子活率应达到0.7以上。 (2)精液稀释 根据冻精的种类、分装剂型和稀释倍数的不同，选择合适的稀释液，按照精液的稀释方法进行稀释。稀释后取样在38-40摄氏度下镜检活率不低于原精液。现生产中多采用一次或两次稀释法。 3.降温平衡 采用一次稀释法，由于稀释温度为30℃，需经1—2h缓慢降温至0-5℃，以防冷休克的发生。平衡是降温后，把稀释后的精液放置在0-5℃的环境中停留2-4h，使甘油充分渗入精于内部，起到膜内保护剂作用的过程。 4.精液的分装 现行冻精常采用颗粒、细管和袋装等分装方法。 精液的分装 (1)颗粒冻精 将精液滴冻在经液氮致冷的金属网或塑料板上，冷冻后制成0．1m1左右的颗粒。颗粒冻精曾在牛中广泛应用，现多用于马、绵羊及野生动物的冻精剂型，具有成本低、制作方便等优点，但不易标记，解冻麻烦，易受污染。 (2)细管冻精 把平衡后的精液分装到塑料细管中，细管的一端塞有细线或棉花，其间放置少量聚乙烯醇粉(吸水后形成活塞)，另一端封口，冷冻后保存。细管的长度约13cm，容量有0.25、0.5或1.Oml。现生产中牛的冻精多用0.25m1剂型。细管冻精具有不受污染、容易标记、易贮存、适于机械化生产等特点，是最理想的剂型。 (3)袋装冻精 马和猪输精量大，可用塑料袋分装，但目前冷冻效果不理想。 5.冻结 (1)干冰埋植法 适合于小规模生产及液氮缺乏地区。 颗粒冷冻 把干冰置于木盒中，铺平压实，用预先做好的在干冰上压出直径0.5cm、深2～3cm的小孔，用滴管将平衡后的精液0.1ml左右滴人孔内，覆以干冰，2～4min后，收集冻精保存。 细管冻精冷冻 将分装的冻精平铺于压实的干冰上，并迅速用于冰覆盖，2～4min取出贮存于干冰或液氮中。 (2)液氮法 颗粒冻精 在广口液氮桶上安装铜纱网，调至距液氮面1～3cm，预冷几分钟后，使纱网附近温度达-80～-100℃，将精液均匀地滴压在铜纱网上，2～4min后，待精液颗粒充分冻结、颜色变浅发亮时，用小铲轻轻铲下颗粒冻精，每50～100粒装入纱布袋中，沉入液氮保存。 细管冻精 除按上述方法对细管进行熏蒸冷冻外，也可采用液氮浸泡法。把分装好的精液细管平铺于特制的细管架上，放人盛装液氮液氮柜中浸泡，盖好，5min后取出保存。这种方法启动温度低，冷冻效果好。 （三）冻精的贮存 目前，冻精保存普遍采用液氮做冷源，以液氮罐为容器贮存和分发冻精。 1.液氮及其特性 液氮是空气中的氮气经分离、压缩形成的一种无色、无味、无毒的液体，沸点温度为-195.8℃。在常温下，液氮沸腾，吸收空气中的水气形成白色烟雾。液氮具有很强的挥发性，当温度升至18℃时，其体积可膨胀680倍。此外，液氮又是不活泼的液体，渗透性差，无杀菌能力。 基于液氮的上述特性，使用时要注意防止冻伤、喷溅、窒息等，用氮量大时要保持空气通畅，注意保护。 2.液氮容器 包括液氮贮运容器和冻精贮存容器，前者为贮藏和运输液氮用，后者为专门保存冻精用。当前冷冻精液专门使用的液氮罐型号较多，但其结构基本相同。 (1)罐壁 由内外两层构成，一般由坚硬的合金制成。 (2)夹层 指内外壳之间的空隙。为增加罐的保温性，抽成真空。真空度为1.33 X 10-4pa，在夹层中装有活性碳、硅胶及镀铝绦纶薄膜等，以吸收漏入夹层的空气，也增加了罐的绝热性。 (3)罐颈 由高热阻材料制成，是连接罐体和罐壁的部分，较为坚固。 (4)罐塞 由绝热性好的塑料制成，具有固定提筒手柄和防止掖氮过厦挥发的功能。 (5)提筒 存放冻精的装置。提筒的手柄由绝热性良好的塑料制成，既能防止温度向液氮传导，又能避免取冻精时冻伤。提筒的底部有多个小孔，以便液氮渗入其中。 3.液氮容器使用应注意的问题 液氮容器主要是靠真空和减少导热来维持其冷藏性能。使用时应注意： （1）用前仔细检查外观，看是否又碰伤；然后倒入液氮检查其损耗情况。 （2）存放于阴凉、干燥、通风良好的室内，严禁靠近热源和室外日晒雨淋。 （3）使用过程中尽量避免碰撞、振动，严禁横放、叠放或倒置。 （4）存放液氮的容器要用瓶塞盖好，但瓶口不能密闭，以防爆炸。 （5）存放精液等要定期补充液氮，确保冻精浸入液氮中。 （6）取放冻精时，要尽量避免碰撞颈口。 （7）液氮罐要定期清洗，以免污染冻精。 1.精液保存的意义。 2.精液保存的方法及保存温度。 3.精液冷冻保存的原理。